南京医科大学病原生物学系

南京医科大学病原生物学系早在1981年就被遴选为国家首批博士学位授权点,也是我校设立最早的博士学位授权点。1993年,学系所在学科被江苏省政府确定为首批省重点学科,并组建了"江苏省医学分子生物学重点实验室"。2003年,为进一步增强疾病防控能力以应对新现和再现传染病,在分子生物学重点实验室基础上,重组建立了"江苏省现代病原生物学重点实验室"。目前,学系包含两个专业方向,即人体寄生虫学和医学微生物学。学系在编人员29人,其中教授7人、副教授5人、讲师12人、高级实验师1人、实验师和助理实验师4人。所有教师均有博士学位,15位教师有国外研究经历。

MOOC时代的《医学微生物学》课程改革初探

2012年被称为"MOOC(大规模开放式网络课程,Massive Open Online Course)元年",中国高等医学院校也积极参与到MOOC的浪潮中。鉴于MOOC给传统高等教育模式带来的巨大机遇和挑战,结合微生物学在新时期独特的发展特点,本文探讨了如何将MOOC模式应用于《医学微生物学》课程,以期提高课程的教学质量,推进课程改革进程。

2008-2010年南京及周边地区儿童肺炎支原体感染情况分析

目的:分析南京及周边地区儿童肺炎支原体(MP)感染的流行病学特征,为该病的预防和治疗提供帮助。方法:采用血清MP被动凝集法对2008年1月至2010年12月在南京医科大学附属南京儿童医院门诊就诊的急性呼吸道感染患儿进行MP-IgM抗体检测,并结合病例资料进行分析。结果:三年间共检测血清标本31843例,总阳性率为41.35%;2008年阳性率最高,达45.08%;≤1岁、1-3岁、3-5岁、>5岁的患儿MP-IgM抗体阳性率分别为9.90%、32.48%、38.24%、57.57%;男性患儿为36.08%,女性患儿为48.16%;春、夏、秋、冬四季阳性率分别为39.56%、36.51%、42.11%、48.69%。结论:MP可能为南京地区儿童呼吸道感染的重要病原之一。MP感染全年均可发生,尤以冬季感染率为高;婴儿感染率较低,而学龄儿童感染率最高;女性患儿感染率高于男性患儿。本研究的结果初步揭示了南京及周边地区MP感染的流行病学特征,对该地区MP的预防和治疗有一定价值。

南京地区鲍曼不动杆菌喹诺酮类药物耐药基因突变的研究

目的调查南京地区鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药情况,并研究其耐药机制。方法在南京地区的医院随机收集了73株鲍曼不动杆菌,历时9个月。定量肉汤稀释法测定菌株对左氧氟沙星、环丙沙星和加替沙星3种喹诺酮类药物的MIC,PCR扩增gyrA基因和parC基因并进行酶切分析,选取部分PCR扩增产物进行测序。结果鲍曼不动杆菌对左氧氟沙星耐药率为39.7%(29/73);对环丙沙星耐药率为76.7%(56/73);对加替沙星耐药率为32.9%(24/73)。对3种喹诺酮类药物均耐药的有16株,占21.9%。PCR-RFLP显示,对gyrA基因,耐药株有80.4%(45/56)不能被HinfⅠ酶切,敏感株100%(17/17)被HinfⅠ酶切;对parC基因,耐药株73.2%(41/56)不能被HinfⅠ酶切,敏感株有88.2%(15/17)被HinfⅠ酶切。测序结果:耐药株中的gyrA和parC基因存在突变,敏感株中则不存在突变,并在耐药株中发现gyrA和parC基因新的点突变,Genbank号分别为DQ270238和DQ270239。结论南京地区鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物耐药情况严重,其耐药与gyrA和parC基因突变有关。

淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4E2r6基因的克隆与生物信息学分析

目的从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫扩增并分析CYP4E2r6基因,为蚊虫抗药性的研究、检测和防治筛选靶标。方法根据已扩增的CYP4E2r6基因片段(长470bp,GenBank登录号为CB074945)的序列设计2条特异引物,从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫提取RNA,反转录成cDNA,以cDNA为模板,用5′-RACE和3′-RACE方法,各获得722bp、617bp片段。进行序列拼接并对所得新基因进行登录和生物信息学分析。结果获得了1条3′端含polyA尾,长1025bp的CYP4E2r6基因大片段(GenBank登录号为AY309972),编码289个氨基酸,与果蝇细胞色素P450氨基酸的同源性为55%。编码蛋白的理论分子质量单位为32.9ku,等电点为5.8。结论获得了CYP4E2r6基因大片段,为进一步获取全长基因并研究该基因的功能奠定了基础。

应用因特网对SARS病毒M蛋白B细胞抗原表位的预测

目的:预测SARS冠状病毒M蛋白的B细胞表位。方法:采用EMBOSS软件结合Hopp＆woods亲水性参数、Janin可及性参数、极性参数、柔韧性参数及二级结构方案对SARS冠状病毒M蛋白的B细胞表位进行了预测,井用吴玉章等已建立的B细胞表位预测方法进行评述。结果:SARS冠状病毒M蛋白B细胞识别的表位可能位于第3～13和153～166位氨基酸等区域内或附近,这2个被预测的表位均含有β-转角和无规卷曲结构。结论:该研究对应用合成肽抗原进行SARS早期诊断研究及相关抗体的制备具有重要指导意义。

达到血吸虫病传播阻断标准10年后人群病情监测和评价

目的探讨达到血吸虫病传播阻断标准（以下简称达标）10年后人群血吸虫病病情，评价其防治效果和今后防治策略。方法对达标10年地区采用ELISA法检测人群血清抗血吸虫抗体水平，并用改良Kato-Katz法粪检血吸虫卵，进行定量观察和比较。结果达标10年地区人群粪检未查到血吸虫虫卵（0／3440），血清抗血吸虫抗体阳性率为3．50％（132／3770），男性和女性分别为4．36％（78／1788）和2．72％（54／1982），人群抗血吸虫抗体OD均值为0．068±0．056，其中男性为0．072±0．058，女性为0．065±0．054，前者显著高于后者（P〈0．01）；6～20岁，21～35岁，36～50岁和51～65岁年龄组抗血吸虫抗体阳性率分别为0．33％（2／609）、0．55％（4／731）、3．79％（53／1399）和7．08％（73／1031），抗血吸虫抗体OD均值分别为0．048±0．030、0．052±0．032、0．071±0．060和0．087±0．068，除6～20岁与21～35岁年龄组在抗体阳性率和抗体OD均值方面无显著性差异外（P〉0．05），其余各年龄组抗体水平在统计学上均有非常显著性差异（P〈0．01）。结论达标10年地区人群血吸虫病情稳定，未发现粪检阳性病人，但人群抗血吸虫抗体水平消减缓慢，在一定时期仍长期存在，且不同性别及年龄人群抗体水平仍与其暴露于原危险因素的机率有关，建议在加强输入性传染源和钉螺监测的同时加强对历史病人的清查和治疗。

不同引物及数据分析方法对定量PCR结果的影响

目的:研究不同引物及数据分析方法对实时荧光定量PCR SYBR Green染料法检测基因表达差异结果分析的影响。方法:通过Primer Express 2.0软件对目的基因CCND1、C-JUN分别设计4对不同引物进行SYBR Green染料法定量PCR扩增,并分别使用2-△△CT法、Pfaffl法及相对标准曲线法计算肺癌紫杉醇敏感细胞株及耐药细胞株间目的基因的表达差异,分析不同引物和数据计算方法对实验结果的影响。结果:统计学分析表明,引物的扩增效率对定量PCR结果分析有显著影响,不同引物特异性扩增得到的样本间表达倍数有显著差异(P<0.05)。3种计算方法中,Pfaffl法与相对标准曲线法无统计学差异(P>0.05),而2-△△CT法与其他2种方法均有显著差异(P<0.05)。结论:引物的选择对于定量PCR结果有显著影响;Pfaffl法是更准确,更合理的相对定量计算方法。

Ficoll密度梯度离心法分离猪外周血单个核细胞条件的探讨

目的探讨猪外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件,为寄生虫免疫学研究提供有效的方法。方法使用猪淋巴细胞分离液,在不同离心转速和时间条件下分离猪PBMC,观察所得云雾状PBMC层的厚度,计算细胞得率及细胞活力,以确定猪淋巴细胞分离液分离猪PBMC的最佳实验条件。同时采用文献报道的人淋巴细胞分离液分离猪PBMC的分离条件(1500r/min,30min)分离猪PBMC,比较两者分离PBMC效果。结果使用猪淋巴细胞分离液(密度1.110ng/L),在20～25℃室温下以1500r/min(半径15cm)离心30min,接着低温(4℃)1500r/min离心10min,洗涤2次,这样获得的猪PBMC效果最好。同样条件下,用人的淋巴细胞分离液分离猪PBMC,不仅所得细胞沉淀中混杂细胞如红细胞及其他细胞碎片较多,而且PBMC细胞得率及活力也不好。结论本实验提出了获得大量有活力的猪PBMC的方法和条件。

日本血吸虫22.6kDa抗原T细胞表位的重组、表达及初步鉴定

目的 鉴定日本血吸虫中国大陆株 2 2 .6kDa抗原 (Sj2 2 .6 )的T细胞表位。 方法 用计算机软件预测Sj2 2 .6分子的T细胞表位 ,设计并合成其编码核苷酸 ,定向克隆入融合表达载体pET 32c( + ) ,转化大肠杆菌BL2 1感受态细胞 ,经酶切及测序鉴定出重组克隆。阳性克隆经IPTG诱导表达 ,表达产物用NTA柱纯化。用纯化后的表位肽融合蛋白体外刺激C3H小鼠脾单个核细胞 ,3 H TdR掺入法检测其增殖。 结果 用计算机软件预测获得Sj2 2 .6抗原的 4个候选表位肽 ,并成功克隆入pET 32c( + )。其重组体均可表达分子量约 2 0kDa的融合蛋白 ,用NTA柱纯化后经 1 2 %聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)显示单一条带。其中P4、P5、P6融合蛋白能有效刺激小鼠脾单个核细胞增殖。 结论 从Sj2 2 .6抗原中初步鉴定出P4、P5、P6

UV致弱日本血吸虫尾蚴诱导C57BL/6小鼠免疫保护作用的研究

目的研究紫外线(UV)致弱日本血吸虫尾蚴诱导C57BL/6小鼠的免疫保护作用。方法分别观察不同UV强度(300、400和500μW/cm2照射的日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤免疫)、不同免疫剂量(8、24和300条UV致弱尾蚴经腹部皮肤免疫)、不同免疫位点(300条UV致弱尾蚴经腹部和耳廓皮肤免疫)和不同免疫次数(100条UV致弱尾蚴经腹部皮肤免疫3次)诱导C57BL/6小鼠抗血吸虫攻击感染(40条正常尾蚴经腹部皮肤感染)的保护力。同时观察免疫后小鼠的体液免疫应答变化。结果300、400和500μW/cm2UV照射的日本血吸虫尾蚴免疫C57BL/6小鼠诱导产生的减虫率分别为2.72%、11.37%和10.38%;8、24和300条致弱尾蚴免疫小鼠诱导产生的减虫率分别为38.67%、7.54%和16.36%;300条致弱尾蚴经腹部和耳廓皮肤免疫诱导小鼠产生的减虫率分别为16.36%和16.14%;100条致弱尾蚴免疫3次,诱导小鼠产生减虫率为4.88%。对300条UV照射尾蚴免疫后小鼠的体液免疫应答动态观察显示,与感染对照组相比,免疫组血清中可溶性成虫抗原(SWA)和可溶性虫卵抗原(SEA)特异的IgG于免疫后2周开始升高,正常尾蚴抗原(SCA)特异的IgG于免疫1周后开始升高,SWA和SCA特异的IgG随免疫次数的增加而升高。结论UV致弱日本血吸虫尾蚴免疫C57BL/6小鼠能诱导其产生高水平的体液免疫应答,但保护力水平较低,提示C57BL/6小鼠为对UV致弱日本血吸虫尾蚴的低应答品系。

卫氏肺吸虫重组抗原的制备及初步应用研究

目的纯化重组细菌Pw鄄1/pRSETB/BL21的表达产物肺吸虫重组抗原,复性后以ELISA法检测肺吸虫病患者、其他寄生虫病患者和正常人血清,评价其敏感性、特异性和应用前景。方法通过分步洗涤及透析对细菌重组蛋白进行初步纯化,进一步做快速液相层析纯化,比较前后两法的纯化效果。初步纯化产物经氧化/还原型谷胱苷肽复性后即为重组蛋白抗原(以下简称重组抗原)。用该重组抗原,以ELISA法检测肺吸虫、血吸虫、肝吸虫、囊虫和包虫病患者以及正常人血清中相应抗体,并与卫氏肺吸虫粗抗原做比较。结果经分步洗涤及透析纯化后的重组抗原纯度已较高,快速液相层析进一步纯化效果不明显。以初步纯化后经复性的重组抗原进行ELISA法检测肺吸虫病患者血清,敏感性为91.07%,与其他寄生虫病患者和正常人血清均无交叉反应;粗抗原检测肺吸虫病患者血清敏感性虽为100%,但与其他寄生虫病患者和正常人血清交叉反应率分别为血吸虫病11.43%,肝吸虫病4.84%,囊虫病3.22%,包虫病5.88%,正常人为2.5%。结论研究制备的重组抗原应用于肺吸虫病的免疫诊断特异性较高。

淡色库蚊细胞色素P450 CYP4E2r6基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆并表达鉴定淡色库蚊细胞色素P450(CYP4E2r6)基因。方法根据昆虫细胞色素P450氨基酸保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR,从淡色库蚊四龄幼虫mRNA中扩增出目的基因片段。产物经T-A克隆、测序、比对,在抗性品系高表达的CYP4E2r6亚克隆入原核表达载体pGEX-6P1,在大肠杆菌BL21中进行原核表达,将细菌总蛋白进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果14个阳性克隆中9个为CYP4新序列,由GenBank登录上网(GenBank/NCBICB074944-51、CB270837,2003年);经鉴定属CYP4家族CYP4H、CYP4E、CYP4J亚家族;CYP4E2r6基因已成功表达。结论获得的CYP4E2r6融合表达蛋白为进一步研究CYP4基因与抗药性之间的关系奠定基础。

弓形虫培养上清体外对CD4^+CD25^+T细胞的影响

目的探讨体外培养条件下弓形虫培养上清对CD4+CD25+T细胞的影响。方法用弓形虫培养上清和自小鼠脾脏分离的CD4+CD25+T细胞共同孵育,Annexin-v染色法检测CD4+CD25+T细胞的凋亡情况,淋巴细胞增殖实验检测CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞的抑制功能。结果用弓形虫培养上清孵育10h的小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞有(36.90±0.36)%出现凋亡,和RPMI-1640孵育组相比,凋亡率上升了(13.60±2.15)%。与RPMI-1640孵育组相比,用弓形虫培养上清处理5、10h的小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞的抑制功能下降(P<0.01)。结论弓形虫培养上清中可能存在某些成分能够诱导CD4+CD25+T细胞出现凋亡,并使CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞的抑制功能下降。