重组禽流感疫苗株rH5N3的生物学特性与免疫效果

目的评价重组禽流感疫苗株rH5N3的生物学特性和免疫效果。方法将rH5N3注射SPF鸡胚和SPF鸡,观察其致病性;rH5N3及其亲本毒株A/Goose/HLJ/QFY/04分别在MDCK细胞单层和SPF鸡胚中增值,研究其生长特性;rH5N3在SPF鸡胚中连续传代,测定第10代rH5N3的核酸序列,评价其遗传稳定性;制备油包水型灭活rH5N3疫苗接种SPF鸡,免疫后不同时间采血测HI抗体滴度;rH5N3灭活疫苗接种SPF鸡,免疫后3周采血测定HI抗体滴度,同时进行H5N1亚型强毒株攻击,观察其保护作用。结果rH5N3疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性;其在鸡胚尿囊液和细胞培养上清液的HA效价极大提高,分别为1:2048和1:512;第10代rH5N3的核酸序列与其亲本毒株相同;灭活rH5N3疫苗免疫鸡后2周即可诱导产生高效价HI抗体,且免疫后18周依然保持较高水平;该疫苗对强毒株包括国内早期分离的A/Goose/Guangdong/1/96和近期分离的A/Goose/HLJ/QFY/04都能产生完全的保护作用,免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。结论rH5N3疫苗株具有安全、高产、稳定等特点,且具良好的免疫原性,免疫动物完全能够抵抗强毒株的致死性攻击。该疫苗株的成功研制为H5N1亚型高致病性禽流感的防控提供了新的技术保障。

LPS表位模拟肽诱导小鼠保护性免疫的研究

目的鉴定三种LPS模拟位合成肽的抗原性、诱导抗LPS抗体的产生及对细菌攻击的保护性。方法三种LPS模拟位合成肽与载体BSA交联后,ELISA测定其与多种抗LPS单、多克隆抗体的结合活性;合成肽与蓝载体交联物免疫Balb/c小鼠,观察其诱发小鼠体内抗LPS抗体产生的规律及血清抗LPS抗体效价;鉴定针对细菌感染的保护性效应。结果三种合成肽均能与抗鼠伤寒和大肠杆菌LPS抗体结合;用合成肽-蓝载体交联物免疫动物可诱发小鼠体内针对两种LPS的抗体反应,并对细菌攻击的免疫动物具不同程度的保护性作用,以合成肽13a,13b及12W与蓝载体交联物免疫的小鼠在鼠伤寒沙门氏菌攻击后存活时间分别为(6.5±0.77),(9.5±1.38)及(9.3±0.75)d,而PBS/蓝载体对照组存活时间为5d。结论本研究所采用的3种LPS表位模拟肽作为疫苗免疫小鼠能够产生针对细菌攻击的保护性效应,提示此3种表位模拟肽作为LPS交叉保护性疫苗候选的可行性与可靠性。

采用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感疫苗株

目的构建重组H5亚型禽流感疫苗株。方法采用RT-PCR技术,分别扩增鹅源高产禽流感病毒A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)的6条内部基因片段、高致病性禽流感病毒株A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)的血凝素(HA)基因和N3亚型参考株A/Duck/Germany/1215/73(H2N3)的神经氨酸酶(NA)基因,并对HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸(R-R-R-K-K)的编码序列进行缺失与修饰,然后分别构建这8个基因的转录与表达载体,将其共转染293T/MDCK混合培养细胞单层,对拯救出的重组病毒进行表型分析。结果利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽流感病毒的疫苗株,其基因序列符合设计要求包括删除HA基因的毒力相关序列,疫苗株的表型为H5N3。结论构建成功重组禽流感疫苗株rH5N3,为制备H5亚型禽流感疫苗打下了坚实的基础。

三色和双色荧光标记流式细胞术对肾移植免疫反应新指标TLR4的监测

目的比较三色和双色荧光标记流式细胞术(FCM)在肾移植术后免疫指标TLR4监测中的优缺点。方法选取10例肾移植术后病例,分别采用三色和双色FCM检测外周血单核细胞中CD14、TLR4和CD80表达情况,计算CD14阳性单核细胞中TLR4和CD80的表达百分率并进行统计比较。结果两种方法检测CD14阳性单核细胞中TLR4和CD80阳性表达百分率均无显著性差异(P=0.198,P=0.872),两种方法对相同血标本的检测结果均呈正相关关系(积矩相关系数r=1,P=0.000;积矩相关系数r=0.999,P=0.000)。另外,应用三色FCM还可同时获得单核细胞中TLR4和CD80双阳性的表达情况。结论三色和双色FCM检测TLR4的结果无显著性差异,但三色FCM可同时显示TLR4与其下游分子CD80双阳性表达情况,对揭示TLR4参与移植免疫反应机制具有重要价值,而且血标本用量少,节约单克隆抗体。

小肝癌患者外周免疫状态变化及手术、射频消融治疗的影响

目的观察小肝癌患者外周免疫状态的变化及手术切除、射频消融治疗的影响。方法采用流式细胞术检测健康人及小肝癌患者手术切除和射频消融前后外周血NK细胞、T淋巴细胞亚群的比例及其CD25、perforin分子。结果小肝癌患者手术切除和射频消融前NK细胞的比例低于健康人(P均<0.05),低杀伤功能的CD56brightNK细胞亚群的比例则高于健康人(P均<0.05);手术切除肿瘤后NK细胞比例上升(P<0.05),而射频消融后CD56brightNK细胞比例降低(P<0.01)。小肝癌患者手术切除前和射频消融前CD2+5辅助性T细胞(Th细胞)的比例高于健康人(P均<0.01),手术切除或射频消融后降低(P均<0.05),但仍高于健康人(P均<0.01);与健康人相比,小肝癌患者T细胞比例升高(P<0.05),而Th细胞及杀伤性T淋巴细胞(Tc细胞)的比例、perforin+NK细胞及perforin+T淋巴细胞的比例相近(P均>0.05),手术切除或射频消融治疗后没有明显改变(P均>0.05)。结论小肝癌患者外周免疫细胞亚群比例及功能分子表达水平发生改变,手术切除或射频消融后获得一定恢复。

模式抗原破伤风毒素C蛋白的克隆、表达条件优化及免疫原性初步分析

目的获得高纯度、高免疫原性的破伤风毒素C片段(TTC)蛋白。方法以PCR从破伤风杆菌质粒DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pET43.1a(+)并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达。用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化融合蛋白,经凝血酶酶切,再用Ni2+-NTA琼脂糖柱分离目的蛋白。SDS-PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的相对分子质量和抗原性,动物免疫实验鉴定其免疫原性。结果获得1373bp的TTC基因片段,构建成重组表达载体pET43.1a(+)-TTC并在大肠杆菌中表达。TTC-Nus融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的22%,酶切后TTC蛋白可与载体蛋白有效分离,获得纯度为95.5%的TTC蛋白,该蛋白可被破伤风抗毒素识别;将TTC蛋白免疫小鼠后,免疫血清可与破伤风毒素特异性结合,三次免疫后其抗体效价可达1∶25600。结论所获TTC蛋白纯度高,免疫原性好,为研究体内外抗原提呈、免疫应答提供了良好的模式抗原。

37Glu突变型MBL蛋白在CHO细胞中的表达及其生物学特性研究

目的:探索甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因GGA57GAA点突变引起免疫缺损的机制。方法:采用PCR从质粒pMBLm57中扩增含GGA57GAA点突变的MBL基因,构建重组真核表达载体,电转染CHO细胞,以Zeocin筛选并克隆化培养,用mAb-Sepharose 4B和Ni2+-NTA agarose层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot、ELISA、配体结合试验、C4d沉积试验等鉴定目的蛋白。结果:重组真核表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm57转染CHO细胞后获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株;37Glu突变型MBL蛋白主要以双链(Mr约60000)存在,不能形成高聚体;其配体结合能力低下,与MASP-2N端蛋白的结合能力也降低,不能通过凝集素途径激活补体系统。结论:GGA57GAA点突变产生结构有缺陷的MBL蛋白,进而影响其识别功能和效应功能。

医学院校特色文科人才培养研究

近年来，医学院校在向多科性方向发展，创建世界一流医科大学的过程中，普遍出现了重视人文社会学科的现象，将人文社会科学的发展视为一流大学不可或缺的环节。同时，随着社会对复合型、应用型人才需求的不断增加，我国很多以医科为背景的高等院校纷纷建立或扩大了人文社会科学（以下简称文科）的办学规模，使得医科院校文科专业的办学水平得到提高。

髓源抑制细胞群：肿瘤免疫治疗的一个新靶点

肿瘤领域的前期研究主要集中在肿瘤细胞本身的癌变机制,近年发现肿瘤微环境的免疫细胞、血管内皮细胞及其他各种间质细胞在肿瘤发展和转移过程中同样具有举足轻重的作用[1-5].随着髓源抑制细胞群（Myeloid-derived Suppressor Cells, MDSCs）的发现及对其认识的深入,使MDSCs成为当今的研究热点之一,并被视为肿瘤免疫治疗的一个新靶点.

ECDI-SP——移植免疫耐受研究的新方法

碳二亚胺(ECDI)是一种化学偶联剂,近几年关于ECDI偶联脾淋巴细胞(ECDI-SP)或供者外周血淋巴细胞诱导移植免疫耐受的研究越来越受到关注。本文对ECDI-SP诱导移植免疫耐受的相关研究进行综述,并与传统移植免疫耐受诱导方案包括淋巴细胞相关途径以及阻滞共刺激分子途径等进行比较。

MBL与Raji细胞结合特性的研究

甘露聚糖结合凝集素(MBL)作为关键的天然免疫模式识别分子已得到共识,但其在获得性免疫应答中是否发挥作用目前尚不清楚.采用酶联免疫吸附试验分析MBL能否与Raji、THP1/CD14、Jurkat和红细胞结合,并采用流式细胞术着重研究其与Raji细胞结合特性.结果显示:MBL以浓度依赖方式结合Raji、THP1/CD14、Jurkat细胞,红细胞则否.MBL与Raji细胞结合是Ca2+依赖的,且能被甘露糖、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺所抑制;C1q或抗C1qR单克隆抗体能部分抑制MBL与Raji细胞结合;重组人MBL-CRD蛋白或MBL-CLR蛋白均能抑制MBL与Raji细胞结合,两者联合应用则可完全阻断这种结合.研究资料表明,B淋巴细胞系Raji细胞表达Ca2+依赖性、糖敏感的MBL受体,包括对CLR特异和CRD特异的两种受体,前者为MBL和C1q的共同受体.进一步的功能研究显示,高浓度MBL(10～50mg/L)对Raji细胞的生长具有显著抑制作用,且呈剂量依赖关系.提示MBL作为一种重要的模式识别分子,不仅发挥天然免疫功能,而且可能在调节获得性免疫应答中起一定作用.

晚期糖化终产物诱导内皮细胞通透性增高

本文探讨了晚期糖化终产物(advanrced glycation end products,AGEs)修饰蛋白对内皮细胞通透性及细胞骨架肌动蛋白的形态学影响,以及特异的AGEs受体(receptors for AGEs,RAGE)、氧化应激和p38 MAPK通路在此病理过程中的作用。用不同浓度的AGEs修饰人血清白蛋白(AGE-HSA)与人脐静脉内皮细胞株ECV304在体外共同培养不同时间,并设立对照组进行比较,采用TRITC荧光标记白蛋白漏出法测定单层内皮细胞的通透系数Pa值,荧光染色法示细胞骨架的形态学改变。与对照组相比,AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起单层内皮细胞通透性的升高及细胞骨架肌动蛋白F-actin形态的改变;可溶性RAGE的抗体(anti-RAGE IgG)、NADPH氧化酶抑制剂(apocynin)及p38抑制剂SB203580均可减轻AGEs对内皮细胞屏障功能和形态的影响。结果提示,AGEs修饰蛋白对单层内皮细胞通透性及骨架重排的作用可能通过与内皮细胞上的RAGE结合,引起细胞内的氧化应激,并激活p38 MAPK通路所介导。

联合应用配体和单克隆抗体亲和层析纯化人血浆天然MBL蛋白

目的优化从人血浆分离纯化天然甘露聚糖结合凝集素(MBL)的方法。方法联合应用甘露聚糖-Sepharose 4B层析柱和抗人MBL-CRD单克隆抗体-Sepharose 4B层析柱,3次上柱亲和层析分离,分别用EDTA、D-甘露糖、Gly-HCl(pH2.4)溶液洗脱结合蛋白。以SDS-PAGE、Western blot和ELISA等技术鉴定纯化产物。结果所获纯化MBL为Mr28000和Mr32000肽链构成的功能性寡聚体,其纯度较高,可与配体甘露聚糖结合并有效凝集酵母菌,还能与U937细胞胶凝素受体结合。结论联合使用配体亲和层析和单克隆抗体亲和层析从血浆中分离纯化MBL,获得高纯度、高活性的天然MBL蛋白。

自然杀伤细胞在原发性肝细胞肝癌中的浸润及其与预后的关系

背景与目的:对某些实体瘤研究显示肿瘤高浸润自然杀伤细胞(naturalkiller cell,NK cell)与癌症患者良好的预后相关。本研究探讨NK细胞在肝癌组织中的浸润分布及对肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者生存和预后的影响。方法:应用流式细胞术检测肝癌切除组织中浸润的NK细胞的比例,并进一步应用免疫组化方法证实原位CD56+细胞的分布特点,同时比较CD56+细胞浸润密度与肝癌患者生存的关系。结果:肿瘤组织浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)中NK细胞的比例是(11.8±8.1)%,显著低于周围非肿瘤组织浸润淋巴细胞(nontumor-infiltrating lymphocytes,NIL)中的比例(18.0±7.9)%(P=0.002);组织原位观察癌巢CD56+细胞为(2.3±2.6)细胞/视野,也是显著少于癌旁组织的(8.5±4.5)细胞/视野(P<0.001)。癌巢NK细胞浸润密度低组患者患者的无瘤生存率(P=0.027)及总体生存率(P=0.005)明显低于浸润密度高组,而癌旁NK细胞浸润密度对二者无影响。多因素分析显示,癌巢NK细胞浸润密度是影响生存的独立预后因素(HR=2.658,P=0.019)。结论:HCC患者癌巢NK细胞浸润减少,其低密度浸润提示预后不良。

MBL对LPS诱导树突状细胞成熟的调节作用

目的探讨甘露聚糖结合凝集素对细菌脂多糖诱导的人外周血单核细胞来源树突状细胞(MoDC)成熟的影响。方法从健康成人外周血分离能黏附塑料的单核细胞,在rhGMCSF和rhIL4条件下培养5d,然后在有或无LPS和不同质量浓度(10～100mgL)天然人MBL条件下继续培养2d。用倒置显微镜观察DC的形态,以FACS分析DC的表型,用MTT法测定DC刺激同种异体T细胞增殖的能力,以酵母多糖颗粒吞噬试验评估DC的抗原摄取能力,用ELISA检测DC培养上清液中TNFα和IL12p40+p70的含量。结果MBL以剂量依赖方式下调LPS诱导人MoDC表面分子CD83和CD86表达,增强其摄取酵母多糖颗粒的能力,降低其激发初始T细胞增殖的能力,并抑制其LPS诱导的TNFα和IL12p40+p70分泌,但MBL质量浓度低至10mgL时对LPS诱导DC成熟作用几无影响。结论高质量浓度MBL能抑制LPS诱导的DC成熟过程,提示其可能在LPS引发疾病包括败血症或感染性休克中具有调节作用,亦提供了分析DC分化成熟有关信号途径的新手段。

广东地区汉族人MBL基因点突变的研究

目的:研究我国汉族人群甘露聚糖结合凝集素(MBL)结构基因外显子1第52、54、57位密码点突变(CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA)。方法:收集广东地区汉族普通人群的血标本,提取白细胞基因组DNA,以PCR扩增目的基因片段,应用荧光探针杂交可视技术检测其MBL基因的点突变。结果:从202份样本中,检出GGC54GAC点突变纯合子6例和杂合子44例(等位基因频率为0.139),GGA57GAA点突变杂合子1例(频率为0.002),未发现CGT52TGT点突变(频率为0)。结论:广东地区汉族人群MBL基因点突变的频率较高,为防治MBL缺损病提供了一定的实验依据。

人MBL糖识别域在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

目的原核表达重组人甘露聚糖结合凝集素(MBL)糖识别域(CRD)。方法采用PCR技术,从含汉族人MBL全长编码区cDNA的重组质粒pGEMmbl中扩增出CRD包括颈区的基因片段,将其插入原核表达载体pGEX4T1中,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。包涵体经变性、复性后以GSTtrap亲和层析柱纯化,融合蛋白经凝血酶切割后回收目的蛋白。分别以Westernblot和ELISA分析表达产物的免疫学和糖结合活性。结果PCR扩增得到长约450bp的目的基因片段,插入pGEX4T1载体所获重组表达载体pGEX4T1CRD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在。以GSTtrap亲和层析柱纯化获得约Mr43000的GSTCRD融合蛋白,经凝血酶切割后得到约Mr17000的CRD蛋白。纯化的GSTCRD蛋白能与抗人CRD单克隆抗体特异性结合并具糖结合活性。结论获得了具生物学活性的人MBLCRD蛋白,为进一步探索MBL分子CRD的效应功能提供了实验材料。

MBL与人单核细胞系THP1/CD14细胞结合及其特性研究

采用Cell-ELISA和流式细胞术,发现人单核细胞系THP1/CD14在生理条件下可结合甘露聚糖结合凝集素(MBL),这种结合具有Ca2+依赖性,能被甘露糖、N-乙酰葡糖胺、D-葡萄糖、半乳糖、蔗糖、海藻糖等及重组人MBL-CRD蛋白和MBL-CLR蛋白所部分抑制,但C1q或抗人C1qR单克隆抗体对之无影响。还发现,炎性状态下的THP1/CD14细胞与MBL的结合增强。结果表明,THP1/CD14细胞表达Ca2+依赖的、糖敏感的MBL受体或结合蛋白,包括对CLR特异和CRD特异的两种受体,均与C1q受体无关;炎性刺激可上调THP1/CD14细胞MBL受体或结合蛋白的表达。

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)胶原样区(CLR)蛋白。方法:应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21(DE3)感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni2+-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Westernblot和ELISA法进行鉴定。结果:从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHI和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Westernblot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论:获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。