双功能分子白介素-2-粒细胞-巨噬细胞集落生长因子促进树突状细胞在肿瘤免疫抑制环境中的活化效应

目的将本室构建与制备的双功能分子白介素-2-粒细胞-巨噬细胞集落生长因子(IL2-GMCSF)蛋白作用于肿瘤条件培养基(TCM)环境中的树突状细胞系(DC),检测其对DC细胞的活化,探讨其用于活化DC、进行抗肿瘤免疫治疗的可能性。方法制备小鼠黑色素瘤B16F10细胞系的TCM,用以培养DC2.4细胞,同时分别添加IL2-GMCSF、GM-CSF、IL-2、或IL-2与GMCSF组合使用。24 h后,检测DC2.4细胞的吞噬与增殖活性、细胞成熟表型、细胞因子分泌与信号通路活化。结果 DC2.4细胞具有未成熟DC的特征,在TCM培养条件下吞噬能力增强、但增殖活性显著受抑,TCM对DC成熟表型表面标志的表达有一定促进作用,并促进单核与DC来源的趋化因子(MDC),但抑制DC的IL-12分泌。与之相反,IL2-GMCSF主要借助其GM-CSF活性,促进DC2.4细胞的吞噬与增殖活性,并促进DC进一步成熟,且高表达IL-12与MDC。与GM-CSF相比,IL2-GMCSF可诱导更高的炎性NF-κB通路活化水平,而抑制调节性STAT3通路的活化。结论与GM-CSF单独作用相比,IL2-GMCSF可更好地促进肿瘤免疫抑制环境中的DC活化,有望成为有效的临床抗肿瘤治疗手段。

重组腺病毒Ad-HGF转染骨髓基质干细胞及其表达的实验研究

目的构建人肝细胞生长因子(HGF)重组腺病毒表达载体,体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),检测HGF基因表达,探讨转HGF基因的BMSCs治疗股骨头缺血性坏死(ANFH)的可行性。方法利用RT-PCR方法,从共表达人HGF-Met的NIH3T3-H0细胞株中扩增人HGFcDNA,插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒共转染HEK293细胞,重组产生重组腺病毒Ad-HGF,PCR鉴定毒种正确后,在293细胞中扩增、纯化,TCID50法测定感染性滴度,然后感染BMSCs,RT-PCR、原位杂交、免疫组化检测转染后细胞中HGF的转录和表达。结果成功制备了Ad-HGF,感染性滴度为2.6×1010TCID50/ml,转染后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF表达。结论获得高表达人HGF基因的BMSCs,为其用于早期ANFH的治疗奠定了基础。

医患鼻前庭携带耐甲氧西林金黄色葡萄球菌与医院感染菌同源性的研究

目的探讨医院医务人员和住院患者鼻前庭带耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的相互关系和对发生与控制医院感染的影响。方法对本院发生金葡菌感染较多的某科医务人员和住院1周以上患者的鼻前庭进行采样,常规方法进行金葡菌鉴定和MRSA确认。将医患鼻前庭以及肺炎患者痰中分离出的MRSA菌株,进行随机引物扩增多态DNA(RAPD)检测,将RAPD指纹图输入凝胶成像分析系统,经计算机处理,运用RAPD软件(Quantityone4.4.0Bio-Rad)进行同源性分析。判断医患鼻前庭携带MRSA的相关性及其与MRSA医院感染的相关性。结果RAPD聚类分析,基因同源性较高的可分为5型,医患之间、患者之间鼻前庭以及3株MRSA院内肺炎与其本人鼻前庭所携带的MRSA有较高的同源性。结论MRSA在鼻前庭较的定植或携带,可通过患者、医务人员的移动发生病室内、病室间的患者之间和医患之间的传播或感染。

IL-2体外诱导健康人外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移的研究

目的研究IL-2对体外培养的T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移的影响。方法分离健康志愿者外周血T细胞,加入IL-2,常规体外培养,乳酸脱氢酶释放法检测其非特异性杀伤活性;采用免疫谱型分析技术,分析其CDR3长度以判断T细胞的克隆性。结果3例健康志愿者外周血T细胞对鼻咽癌细胞系CNE2没有杀伤作用;PBMC的TCRVβCDR3谱型均呈高斯分布,经IL-2体外培养后部分家族出现不同的优势表达。结论IL-2对体外培养的T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移有一定影响,对其非特异性杀伤无影响。

腺相关病毒-1介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠角膜基质细胞体内外转染的研究

目的：探讨血清1型腺相关病毒（rAAV1）介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白（GFP）的表达及转染率。方法：采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒（rAAV1-EGFP）感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞，通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率。建立大鼠异体角膜移植模型，用含rAAV1-EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h，再用此缝线间断缝合，将植片移植到大鼠角膜植床，术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况。结果：按rAAV1-EGFP不同转染倍数（MOI）转染角膜基质细胞。转染后3d，在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达。体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达；随MOI值的增高而增强，转染再7～9d达到高峰，此时检测rAAV1-EGFP对角膜基质细胞的转染效率，MOI=10^时是16．3％，MOI=10^4时是30．3％，MOI=10^5时是43．6％，MOI=10^6时是47．5％.rAA1－ECFP在大鼠角膜中的表达也明显增强。结论：rAAV1-ECFP可以在体内外稳定、有转染大鼠角膜基质细胞，是角膜基质细胞理想的报告基因。

肝细胞生长因子基因转染5-aza诱导后的骨髓基质干细胞及其表达、分化的研究

目的将重组腺病毒(Ad-HGF)转染5-氮胞苷(5-aza)诱导后的骨髓基质干细胞(BMSCs),检测其心肌样细胞分化和HGF基因表达,探讨其用于缺血性心脏病治疗的可行性。方法以5-aza诱导比格犬BMSCs向心肌样细胞分化,形态学观察、免疫组化检测心肌样细胞标志—β-肌球重链蛋白(β-MHC)和α-横纹肌肌动蛋白的表达;以Ad-HGF转染5-aza诱导后的BMSCs,RT-PCR、ELISA检测肝细胞生长因子(HGF)的表达。结果形态学观察与免疫组化结果表明,5-aza诱导BMSCs向心肌样细胞分化,Ad-HGF转染5-aza诱导后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF表达,转染后48h表达量最高,达103ng/ml。结论 Ad-HGF可高效转染5-aza诱导后的BMSCs,为其应用于缺血性心脏病的生物治疗奠定了基础。

单链双特异性抗体(BHL-I)介导的细胞毒作用及其可能机制研究

目的:观察单链双特异性抗体(BHL-I)介导的PBL对靶细胞SKOV3的杀伤作用,并研究其细胞毒作用的可能机制。方法:MTT法检测在不同效靶比、不同作用时间、不同靶细胞(SKOV3、BEL-7402)、不同BHL-I浓度等条件下,BHL-I介导PBL对靶细胞的杀伤作用;RT-PCR检测杀伤过程中PBL的穿孔素(Perforin)、颗粒酶(GranzymeB)mRNA的表达及细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ含量变化。结果:BHL-I介导的PBL对SKOV3细胞毒作用明显高于对BEL-7402的,并且在效靶比10∶1、作用36小时、BHL-I浓度为25μg/ml时,PBL对靶细胞SKOV3的细胞毒作用最为显著;在IL-2存在下,BHL-I可引起Perforin、GranzymeB mRNA较高表达及细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ含量升高,当作用时间为72小时时,这些细胞因子的表达有所下降。结论:BHL-I能介导PBL对表达有相应靶抗原的SKOV3细胞具有高效杀伤作用,其细胞毒作用可能与效应细胞表达Perforin、GranzymeB、TNF-α、IFN-γ等有关。

肺结核患者外周血αβT细胞CDR3谱系研究

目的探讨活动性肺结核患者外周血T细胞TCRα,β链CDR3谱系漂移,为肺结核患者特异性T细胞免疫应答机制和免疫治疗研究提供基础。方法采用基因扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员及6例活动性肺结核患者PBMC中T细胞TCR CDR3谱型分布特征及患者TCRVα和Vβ基因家族的优势取用情况,对克隆性增生T细胞CDR3区进行序列分析。结果6例正常献血员外周血中TCR 32 Vα,24Vβ家族CDR3谱型均呈高斯分布(gaussian distribution),6例活动性肺结核患者出现不同Vα和Vβ家族优势取用,对部分单/寡克隆增生T细胞α,β链CDR3区基因进行测序,证实存在不同的CDR3序列。结论肺结核患者活动期外周血T细胞TCRα,β链CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达与结核患者细胞免疫应答机制有关,优势取用Vα,Vβ家族T细胞TCR CDR3序列的确定,为肺结核患者特异性T细胞免疫治疗研究提供基础。

重组腺病毒Ad-sTNFRI-IgGFc转染人气道上皮细胞及其表达的实验研究

目的构建携带人可溶性肿瘤坏死因子受体I胞外区和IgGFc融合基因的重组腺病毒载体(Ad-sTNFRI-IgGFc),体外转染正常人气道上皮细胞株(HBE135-E6E7),探讨重组腺病毒Ad-sTNFRI-IgGFc转染气道上皮治疗支气管哮喘的可行性。方法将sTNFRI-IgGFc基因插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞,重组产生Ad-sTNFRI-IgGFc,PCR鉴定毒种正确后,进行扩增、纯化和滴度测定,转染培养HBE135-E6E7,流式细胞术检测转染效率,RT-PCR、免疫组化检测转染后细胞中sTNFRI-IgGFc的表达和转录。结果成功构建了Ad-sTNFRI-IgGFc,感染性滴度达3×1010TCID50/ml,转染后HBE135-E6E7在mRNA和蛋白水平均有sTNFRI-IgGFc表达。结论构建的Ad-sTNFRI-IgGFc可有效转染HBE135-E6E7,并在其中高效表达,并能拮抗TNF活性,为将表达sTNFRI-IgGFc腺病毒基因治疗哮喘的实验研究提供了基础。

重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的研究重组腺相关病毒(rAAV)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的有效性和安全性。方法微型角膜刀制作兔角膜基质瓣;转染组用含rAAV-EGFP转染液浸泡角膜瓣和角膜基质床10min,对照组用等量BSS液浸泡角膜瓣和角膜基质床10min,不同时间点(1,3,7,14,21d)通过荧光体视镜观察角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况,收集角膜,其中一半用激光共聚焦显微镜观察、照相,另一半固定后行HE染色。结果转染组于转染第3天,体视荧光显微镜下观察到兔眼角膜瓣内面及基质床中开始有GFP阳性表达;7d达到高峰,21d时仍有微弱表达。第7天在激光共聚焦显微镜下可观察到兔角膜基质中有明显的荧光表达,对照组角膜始终未见荧光表达,转染组和对照组角膜HE染色均未见炎症细胞浸润及新生血管等异常。结论rAAV-EGFP经兔角膜基质瓣转染角膜基质细胞的方法可将基因安全、相对高效地转入角膜基质细胞,为转基因治疗角膜病提供了新的转染途径。

T淋巴瘤EL-4细胞双受体表达研究

目的:检测T淋巴瘤EL-4细胞T细胞受体(T cell receptor,TCR)的表达情况,为进一步研究T细胞等位基因排斥机制奠定基础。方法:以小鼠脾细胞作为阳性对照,分别提取脾细胞和EL-4细胞mRNA,逆转录为cDNA,RT-PCR扩增24个TCR BV家族CDR3区,结合基因扫描(GeneScan)和基因测序技术,对有表达的TCR BV家族进行CDR3谱型和序列分析。结果:小鼠脾细胞24 BV家族均有表达,各TCR BV家族CDR3谱型均呈高斯分布(Gaussian distribution),表明24 BV家族均为多克隆性。EL-4细胞被同时检测到TCR BV10和BV12家族表达,CDR3谱型均呈单峰,两个家族的RT-PCR产物经测序鉴定证实确属TCR序列,且均为框内编码。结论:EL-4细胞存在两套框内重排的TCRβ链,表明其TCRβ链可能存在等位基因排斥"缺陷"现象。本研究为探索T细胞等位基因排斥机制奠定了基础。

监测TCR CDR3漂移的免疫扫描谱型分析技术的建立与鉴定

外周血95％ T淋巴细胞的TCR由α（胚系基因中AV、AJ、AC重排）、β（胚系基因中的BV、BD、BJ、BC重排）两条多肽链组成，不同V（D）J重排后，由V基因末端、J基因前端和V-J（或V—D和D—J）连接时中间插入的核苷酸序列，分别组成了特异的TCRα和8的CDR3基因谱型的多样性。一种CDR3序列代表一个T细胞克隆，测定特定CDR3序列出现的频率可以反映特定T细胞克隆扩增的程度和功能状态。

系统性红斑狼疮患者外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移和序列鉴定

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移,为SLE的免疫应答机制和个性化治疗研究提供基础。方法采用免疫扫描谱型分析技术,分析5例正常献血员的CDR3分布特征及5例SLE患者PBMC中T细胞TCRβ链CDR3的优势利用情况,对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果5例正常献血员PBMCTCRBVCDR3谱型均呈高斯分布,5例活动型SLE患者24TCRBVCDR3家族均出现不同的优势表达,对单/寡克隆性增生T细胞β链CDR3区基因进行测序,证实存在不同的CDR3序列。结论SLE活动期外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达可能与SLE的免疫发病机理有关,特异应答的T细胞TCRCDR3序列的确定,将为SLE的发病机制研究和个性化治疗提供新的方法与手段。

尿激酶对环孢素A慢性肾病大鼠肾间质炎症的干预作用

目的探讨外源性尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)对环孢素A(CsA)致慢性肾病大鼠肾间质炎症的干预作用。方法将雄性SD大鼠低盐饮食饲养,经口服灌胃CsA(25mg/kg·d)4周,制作慢性CsA肾病模型,分别给予小剂量uPA持续干预和大剂量uPA间断干预。4周末,观察大鼠血肌酐(Scr)、尿素氮(BuN)及24h尿蛋白的变化,Masson染色观察肾组织纤维蛋白沉积,免疫组化检测肾间质ED-1阳性巨噬细胞浸润数量、肾组织uPA及转化生长因子b1(TGF-β1)的表达。结果大鼠经CsA灌胃后,Scr、BuN升高,24h尿蛋白增加,肾间质纤维蛋白沉积增多,巨噬细胞浸润数量增加,肾局部uPA含量下降以及肾组织TGF-β1表达上调,表明大鼠肾间质炎症模型建立成功。小剂量uPA持续给药血Scr、BuN、24h尿蛋白水平下降(P<0.01或P<0.05),肾间质纤维蛋白沉积和炎性细胞浸润减轻(P<0.05),uPA表达增加(P<0.05),肾组织TGF-β1表达降低(P<0.05)。大剂量uPA间断干预生化指标无显著性差异,局部uPA轻度升高,但对减轻肾小管间质纤维化和下调TGF-β1表达无显著性差异(P>0.05)。结论小剂量uPA持续干预能有效减轻CsA慢性肾病大鼠肾间质纤维蛋白沉积、炎性细胞浸润及下调肾组织TGF-β1表达,从而减轻肾脏炎症反应和纤维化,为其临床应用提供了基础。

尿激酶对环孢素A慢性肾病大鼠肾间质纤维化及转化生长因子-β1的影响

目的探讨外源性尿激酶(uPA)对环孢素A(CsA)慢性肾病大鼠肾小管间质纤维化及转化生长因子-β1(TGF-β1)作用的影响。方法雄性SD大鼠低盐饮食,随机分成4组:对照组、CsA肾病组、小剂量uPA组和大剂量uPA组。大鼠CsA灌胃4周,制成慢性肾病大鼠模型。应用Masson染色观察肾间质纤维蛋白沉积,蛋白质印迹及RT-PCR法检测肾组织uPA及TGF-β1的蛋白质和基因表达。结果模型组肾间质纤维蛋白沉积增多,且uPA表达降低,TGF-β1表达上调,两治疗组uPA表达增加(P<0.05),而TGF-β1表达显著降低(P<0.01),且小剂量uPA组作用更明显。结论小剂量uPA能减轻CsA慢性肾病大鼠肾间质纤维化,可能与其下调肾组织TGF-β1的表达有关。

抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体介导的αβT细胞CDR3谱系漂移

目的探讨抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-1)介导的αβT细胞CDR3谱系漂移,为双特异性抗体介导的T细胞免疫应答机制提供理论基础。方法采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员T细胞在人卵巢癌SKOV3细胞联合BHL-1刺激前后的TCR库多样性变化(CDR3谱型分布特征)及刺激后T细胞TCRα、β链CDR3优势利用情况,对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果刺激前6例正常献血员TCR CDR3谱型均呈高斯分布,刺激后发生CDR3谱系漂移,部分TCR Vα、Vβ家族出现优势增生,明确了BHL-1介导下单克隆增生T细胞的α、β链CDR3序列。结论 SKOV3联合BHL-1诱导的T细胞CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达可能与BHL-1介导的特异性T细胞免疫反应有关,特异应答T细胞TCR CDR3序列的确定,将为卵巢癌的T细胞免疫治疗提供基础。

纳米光催化空气消毒机对高压氧舱内空气消毒效果观察

目的探讨医院高压氧舱应用纳米光催化空气消毒机进行舱内空气消毒的效果。方法分别于高压氧治疗结束患者出舱后30min，采用纳米光催化空气消毒机进行空气消毒前、消毒后1、2、3h监测舱内空气细菌数量。结果采用纳米光催化空气消毒机消毒后舱内空气病原菌数，由消毒前的764～1989CFU／m^3下降到31～268CFU／m^3，自然菌平均消亡率〉80％。结论应用纳米光催化空气消毒机进行高压氧舱内空气消毒，是一种安全有效的方法。

小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达、纯化与鉴定

目的构建小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)工程菌,通过摸索其变、复性和纯化条件,得到高纯度高比活的重组mGM-CSF蛋白。方法以本实验室构建的hIL-2/mGM-CSF融合蛋白表达载体为模板,PCR扩增mGM-CSF基因,克隆入pET-11c表达载体,转化BL21,构建BL21/pET-11c/mGM-CSF工程菌,用本所专利方法提取包涵体,在含低浓度盐酸胍的复性液中复性,采用镍离子亲和层析纯化。结果工程菌采用TH肉汤培养,32℃、0.1mmol/LIPTG双重诱导,表达量达菌体蛋白总量的60.6%。提取包涵体在含1.5mol/L盐酸胍的谷胱甘肽复性液中复性效果最好,比活达4.2×106U/mg。经过亲和层析一步纯化,目的蛋白纯度达95%,比活与标准品相当。结论构建了高效表达mGM-CSF的工程菌,建立了其复性和纯化工艺,为进一步研究DC、GM-CSF体内抗肿瘤功能奠定了基础,并可为IL-2/GM-CSF双功能分子的生物学功能研究提供对照。

T细胞激活剂对Jurkat细胞重组激活基因表达的影响

目的:研究T细胞激活剂PHA,抗CD3mAb,PMA+A23187对人T细胞白血病细胞株Jurkat重组激活基因(RAGs)mRNA表达水平的影响.方法:采用RTPCR法检测不同T细胞激活剂作用不同时间后Jurkat细胞中RAG1,RAG2mRNA,以β肌动蛋白(βactin)的表达作为内参照进行灰度分析,比较不同组Jurkat细胞RAGsmRNA的表达水平.结果:三种T细胞激活剂刺激诱导的Jurkat细胞RAG1mRNA表达量明显低于对照组(P<0.05),且RAG1mRNA表达量的下降与刺激诱导作用时间有关;PHA刺激诱导后RAG2表达量显著低于对照组(P<0.05);PMA+A23187刺激诱导6,12h均未检测出RAG2mRNA的表达;而抗CD3mAb作用12h组RAG2mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05).结论:Jurkat细胞同时表达RAG1,RAG2mRNA,并在一定诱导下RAGs表达量发生改变,因此有可能成为研究外周T细胞RAGs表达调节的一个潜在的细胞模型.

鼻咽癌细胞株体外诱导同种异体T细胞TCR Vβ CDR3谱型和细胞毒性分析

目的用鼻咽癌细胞株CNE2体外负载同种异体树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导T淋巴细胞,使之活化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),观察其体外特异性杀伤和克隆性增殖。方法用GM-CSF,IL-4和TNF-α体外诱导健康志愿者外周血单核细胞,用CNE2负载,使之分化为成熟DC,流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征。在IL-2的作用下,用负载CNE2抗原的DC诱导自身T细胞生成特异性CTL。乳酸脱氢酶释放法检测其特异性杀伤活性;采用免疫谱型分析技术分析T细胞的克隆性。结果健康志愿者外周血单核细胞体外在GM-CSF,IL-4和TNF-α诱导下获得具有典型表型特征的成熟DC,其诱导的CTL对CNE2有明显的特异性杀伤作用;PBMC的TCRVβCDR3谱型呈高斯分布,而诱导后的T细胞部分家族出现优势表达。结论负载鼻咽癌抗原的同种异体DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用,优势表达的TCRVβCDR3家族对鼻咽癌治疗有潜在的临床应用价值。