罕见α-地中海贫血的新生儿筛查与诊断

目的探讨罕见α-地中海贫血的新生儿筛查与诊断。方法应用全自动毛细管电泳技术对6525例新生儿脐血进行血红蛋白定量分析,有Hb Bart’s区带的样本进行常规基因诊断(gap-PCR和PCR-RDB),对于未检出异常的样本,用多重PCR技术检测4种罕见α-基因缺失(--THAI、--FIL、--MED、-(α)20.5),用PCR产物直接测序法检测罕见非缺失型α-地贫。结果 6525例新生儿脐血样本中,检出Hb Bart’s阳性样本377例,其中基因确诊375例:包括14种基因型、383个α-地贫等位基因;发现罕见α-地贫7例,包括2例--THAI/αα及5例罕见非缺失型α-地贫;发现1例α2-基因突变至与Hb Bart’s区带峰同区域的异常血红蛋白(Hb J-Wenchang-Wuming)。结论毛细管电泳技术定量分析血红蛋白,准确、高效,应作为α-地贫高发地区的新生儿疾病筛查常规项目;在α-地贫高发地区应注意罕见α-地贫的筛查与诊断,防止漏诊导致重型地贫儿出生。

CHIA和CHI3L1基因变异与汉族儿童哮喘发病的关系

目的:探讨CHIA和CHI3L1基因的变异与中山市汉族儿童哮喘发病的相关性。方法:采用病例对照研究,利用MassARRAY-IPLEX技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱平台(MALDI-TOF-MS)对CHIA基因的rs10494132和CHI3L1的rs946263位点进行基因分型。结果:在中山市汉族儿童中rs10494132检出CC、CT和TT基因型,rs946263检出AA、AG和GG三种基因型。与正常对照相比,哮喘组rs10494132的基因型分布(χ2=8.767,P=0.012)和等位基因分布(χ2=9.749,P=0.002)均具有明显差异,而rs946263基因型分布(χ2=0.472,P=0.790)和等位基因分布(χ2=0.013,P=0.910)均无显著性差异。与CC+CT基因型相比,rs10494132的TT基因型能显著增加哮喘发生的危险性,OR值(95%可信区间)分别为2.093(1.252～3.498)。在哮喘组中,与CC+CT基因型亚组相比,rs10494132的TT基因型亚组IgE浓度(Z=-2.013,P=0.044)明显增高,而嗜酸性粒细胞计数(Z=-0.704,P=0.482)和CRP(Z=-0.488,P=0.626)无明显变化。rs10494132位点的基因型分布在哮喘初次确诊规则治疗前不同病情严重程度分级之间未见明显差异(χ2=0.719,P=0.397)。结论:CHIA基因的rs10494132可能与中山市汉族儿童哮喘的发病有关,TT基因型可能增加血清IgE浓度。

人蛋白酶体α7亚基在原发性肝细胞肝癌中的表达及临床意义

目的:探讨人蛋白酶体α7亚基(PSMA7)与原发性肝细胞肝癌(HCC)发生发展的关系。方法:采用免疫组织化学法检测254例HCC中PSMA7蛋白的表达。结果:在癌组织细胞质中,发现不同临床分期和病理分级之间,PSMA7的表达均无明显差异(P>0.05),但不同肝硬化程度间具有显著性差异(P<0.01),以早期肝硬化患者肝细胞表达量最高。在癌组织细胞核中,不同临床分期之间PSMA7的表达无明显差异(P>0.05),但不同病理分级之间具有显著性差异(P<0.05),同时与肝硬化的程度有一定关系(P<0.05),亦以早期肝硬化患者肝细胞表达量最高。另外,PSMA7的表达在癌组织和癌旁组织的细胞质中无明显差异(P>0.05),而在细胞核中具有显著性差异,癌组织高于癌旁组织(P<0.01)。淋巴结转移组细胞核中的PSMA7表达高于无淋巴结转移组(P<0.05)。结论:PSMA7在HCC细胞核中表达增高,与病理分期有关。此外,PSMA7的表达与肝硬化程度和淋巴结转移有关。

pCDNA3.1-MT2A真核表达载体的构建及亚细胞定位

目的:构建pCDNA3.1-MT2A真核表达载体并观察其在293T和SMMC7721细胞株中的定位和表达情况。方法:使用基因合成法合成MT2A基因,在其N端添加Kozak序列及His标签序列,将扩增后的目的基因双酶切连接至pcDNA3.1(+)载体的BamHⅠ和NotⅠ之间。转化DH5α大肠杆菌后,挑取阳性克隆子进行质粒抽提电泳及测序鉴定。将鉴定正确的pCDNA3.1-MT2A质粒采用脂质体法转染293T和SMMC7721细胞株,激光共聚焦显微镜观察其在真核细胞中的表达和定位情况。结果:pCDNA3.1-MT2A重组质粒经酶切电泳及DNA测序证实,目的基因MT2A的序列完全正确,真核表达载体构建成功,激光共聚焦观察发现该重组质粒表达于293T和SMMC7721细胞的胞质中。结论:成功构建pCDNA3.1-MT2A融合基因并进行真核表达,发现MT2A主要定位于293T和SMMC7721细胞的细胞质中。本研究为探讨MT2A在肝癌细胞内的功能奠定了基础。

ORMDL3基因多态性与儿童哮喘发病的关系

目的探讨ORMDL3基因的单核苷酸多态性（SNPs）与汉族儿童哮喘发病的相关性。方法选取儿童哮喘患者168例和同期健康查体者188例为研究对象,利用MassARRAY-IPLEX技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱平台（MALDI-TOF-MS）对ORMDL3基因的7个SNPs位点进行基因分型。结果与对照组相比,哮喘组嗜酸性粒细胞计数（Z=26.581,P=0.000）和IgE明显升高（Z=73.208,P=0.000）,CRP水平差异无统计学意义（Z=2.938,P=0.066）,吸入性过敏原（χ2=44.638,P=0.000）和食物过敏原（χ2=14.347,P=0.000）检出率明显增高。总的基因型分型成功率为99.34%。与对照相比,哮喘组rs4795400的等位基因分布（χ2=4.166,P=0.041）有差异,但基因型分布（χ2=3.732,P=0.155）无明显差异。与对照相比,哮喘组rs2305480和rs3859192的等位基因分布（χ2=5.294,P=0.021;χ2=6.804,P=0.009）有差异,基因型分布（χ2=5.538,P=0.019;χ2=7.618,P=0.022）也均具有显著性差异,但进行Bonferroni校正后两组间基因型分布均无显著性差异（Pc=0.114;Pc=0.132）。与对照相比,哮喘组rs7216389、rs8069176和rs12603332的等位基因分布（χ2=13.800,P=0.000;χ2=13.066,P=0.000;χ2=10.872,P=0.001）均具有显著差异,基因型分布（χ2=12.162,P=0.002;χ2=11.574,P=0.003;χ2=10.500,P=0.005）同样均具有显著性差异,进行Bonferroni校正后两组间仍均具有显著性差异（Pc=0.012;Pc=0.018;Pc=0.030）。与CC基因型相比,rs7216389的TT基因型显著增加哮喘发生的危险性（P=0.003）,OR值（95%可信区间）为3.846（1.488~9.939）。与AA基因型相比,rs8069176的GG基因型显著增加哮喘发生的危险性（P=0.008）,OR值（95%可信区间）为3.453（1.322~9.017）。与TT＋TC基因型相比,rs12603332的CC基因型显著增加哮喘发生的危险性（P=0.001）,OR值（95%可信区间）为2.057（1.316~3.214）。结论 ORMDL3基因的rs7216389、rs8069176和rs12603332位点与汉族儿童哮喘的发病有关。

PSMA7对A549细胞表面黏附分子表达的影响

目的探讨PSMA7表达量的变化对A549细胞表面黏附分子ICAM-1,VCAM-1和CD44表达的影响。方法采用流式细胞仪分别检测高表达PSMA7的A549细胞[pcDNA3.1(-)/PSMA7组]和低表达PSMA7的A549细胞(shPSMA7组)表面黏附分子ICAM-1,VCAM-1和CD44的表达情况。结果与高表达阴性对照组[pcDNA3.1(-)组]相比,pcDNA3.1(-)/PSMA7组的ICAM-1(t=86.325,P=0.000)和VCAM-1(t=16.337,P=0.000)的表达量均显著降低,CD44表达量则无明显变化(t=-0.545,P=0.615),而与低表达阴性对照组(shNC组)相比,shPSMA7组ICAM-1(t=-119.827,P=0.000)和VCAM-1(t=-26.68,P=0.000)表达量均显著增高,CD44表达量则无明显变化(t=-848,P=0.444)。与pcDNA3.1(-)组相比,pcDNA3.1(-)/PSMA7组穿膜侵袭细胞的数量明显减少(t=3.553,P=0.024),而shPSMA7组明显高于shNC组(t=-3.207,P=0.033)。结论高表达或干扰PSMA7可影响A549细胞表面黏附分子ICAM-1,VCAM-1的表达,提示PSMA7可能因此参与肺腺癌细胞的侵袭和转移。

HSPC238相互作用蛋白RPL5的初步筛选

目的:构建HSPC238诱饵载体,筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。方法:基因合成法合成HSPC238基因,sfi IA和sfi IB双酶切后与pGBKT7诱饵载体连接,获得诱饵质粒pGBKT7-HSPC238,经测序鉴定后与酵母双杂交空质粒pGBKT7共同转化到酵母菌株AH109,在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-HSPC238的自激活作用,进一步从人胎肝c DNA文库中筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。结果:诱饵载体pGBKT7-HSPC238构建成功,经表型筛选检测无自激活作用,经酵母双杂交技术结合文献分析,从人胎肝c DNA文库中初步筛选发现核糖体蛋白L5(Ribosomal protein L5,RPL5)可能是HSPC238相互作用的目标蛋白之一。结论:成功构建pGBKT7-HSPC238诱饵质粒载体,且经酵母双杂交技术结合文献分析发现RPL5可能是与HSPC238相互作用的目标蛋白之一。

靶向抑制UBE2C基因对SMMC-7721细胞生物学行为的影响

目的将构建好的UBE2C干扰质粒转入SMMC-7721细胞中,观察其对SMMC-7721细胞生物学行为的影响。方法采用脂质体法将构建好的UBE2C干扰质粒转入SMMC-7721细胞株中,潮霉素筛选4周,并经Western blot鉴定,选出干扰效果最佳的低表达稳定株(shUBE2C组)用于后续实验。用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,软琼脂克隆形成实验检测克隆形成能力。结果 Western blot检测显示,转shUBE2C组UBE2C的蛋白表达水平低于转阴性对照shNC组(P<0.05)。shUBE2C组的SMMC-7721细胞生长曲线明显右移,显示靶向抑制UBE2C可降低SMMC-7721细胞的增殖能力。与shNC组相比,shUBE2C组细胞的G1期细胞比例明显增高(P﹤0.05),而S期的比例明显降低(P﹤0.05),提示其延缓细胞周期进程。shUBE2C组的克隆形成率明显低于shNC组(P﹤0.05),提示其降低克隆形成能力。结论 UBE2C低表达可改变SMMC-7721细胞的生物学行为。

新生儿脐带血红细胞指标在新生儿地中海贫血筛查中的价值

目的:探讨新生儿脐带血红细胞指标与地中海贫血的相关性,揭示其在新生儿地中海贫血筛查中的临床价值。方法:收集2017年7月至2018年12月在南方医科大学附属中山市博爱医院出生的2919例新生儿脐带血,进行血常规检测,另采集外周血检测地中海贫血基因,确定各指标中的cut-off值,并计算灵敏度、特异度等评价指标。结果:2919例新生儿脐带血共检出地中海贫血314例,阳性检出率为10.76%。2605例非地中海贫血患儿的RBC、RDW的平均水平低于314例地中海贫血患儿;非地中海贫血患儿的Hb、MCV、MCH、MCHC、HCT、Hb/RBC、MCV/RBC水平高于地中海贫血患儿,两组间各指标的比较均有显著性差异。其中α地中海贫血组的RBC和RDW水平高于非地中海贫血组,而Hb、MCV、MCH、MCHC、HCT、Hb/RBC和MCV/RBC水平均低于非地中海贫血组;β地中海贫血组的MCV、MCH、Hb/RBC水平均低于非地中海贫血组;α,β复合地中海贫血组的MCV、MCH、Hb/RBC和MCV/RBC水平均低于非地中海贫血组。MCV的cut-off值设为106.05fl时,灵敏度为0.548,特异度为0.907,特异度在各指标中最高。MCH+MCV/RBC联合诊断的ROC曲线下面积最大,为0.807,其中灵敏度为0.710,特异度为0.841,阳性预测值为0.348,阴性预测值为0.960。结论:单一脐带血红细胞指标对于地中海贫血的筛查各有优缺点,而联合MCH+MCV/RBC可以提高其对地中海贫血筛查或诊断的准确性,对于降低重型地中海贫血患儿的出生率有积极的作用,在基层医院具有很高的普及价值。

胰石蛋白与呼吸机相关性肺炎的关系研究

目的探讨血清胰石蛋白(PSP/reg)在呼吸机相关性肺炎(VAP)诊断和疾病评估中的意义。方法收集该院中心ICU从2012年9月至2015年10月行呼吸机治疗患者的临床资料,在上呼吸机时、确诊VAP第1、4、7、14天及停呼吸机时分别留取血标本,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测PSP/reg的浓度,同时记录呼吸机治疗时间,VAP的转归。另选取同期上呼吸机未发生VAP的患者作为对照组。结果与对照组相比,未发生VAP时,VAP组血清PSP/reg浓度比较差异无统计学意义(P>0.05)。从连续监测来看,VAP组发生VAP后,与上呼吸机时相比,血清PSP/reg浓度明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),且第4天达到最高峰。第7天血清PSP/reg浓度已明显下降,但仍高于第1天,差异有统计学意义(P<0.05)。第14天血清PSP/reg浓度进一步下降,但比上呼吸相时相比仍较高,差异有统计学意义(P<0.05)。共成功脱机38例,与PSP/reg最高峰时(第4天)相比,停用呼吸机时浓度已明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),接近上呼吸机时的浓度,但两者比较差异有统计学意义(P<0.05),且高于对照组脱呼吸机时PSP/reg浓度,差异有统计学意义(P<0.05)。经Spearman分析发现确诊为VAP的第1天,PSP/reg浓度与C反应蛋白(CRP)具有明显相关性(r=0.570,P<0.05),而与白细胞总数(WBC)和降钙素原(PCT)无相关性(P>0.05)。结论 PSP/reg可作为诊断VAP的指标之一,并可能与VAP的严重程度有关。

脐带血红细胞参数检验在α-地中海贫血筛查中的应用价值

目的研究脐带血红细胞参数检验在α-地中海贫血筛查中的应用价值。方法选择2018年1—12月于南方医科大学附属中山市博爱医院出生且基因诊断为α-地中海贫血的202例新生儿作为α-地中海贫血组,另外选择802名正常新生儿作为正常对照组。对所有新生儿进行脐带血血常规检验,并抽取外周血进行α-地中海贫血基因检测,观察和比较两组新生儿脐带血中红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hb)、红细胞分布宽度(RDW)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)的水平。绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)并计算曲线下面积(AUC),比较各参数单独或联合检测的诊断效能。结果202例α-地中海贫血患儿基因型中,以--^(SEA)/αα基因型最常见〔49.50%(100/202)〕,其次为-α^(3.7)/αα〔33.17%(67/202)〕;α-地中海贫血组的RBC和RDW均明显高于正常对照组〔RBC(×10^(12)/L):4.88±0.68比4.43±0.46,RDW:(16.66±1.22)%比(14.96±0.38)%,均P<0.01〕,而Hb、MCV、MCH、MCHC和MCV/RBC水平均明显低于正常对照组〔Hb(g/L):147.78±17.20比154.96±15.74,MCV(fL):101.87±8.20比111.37±5.10,MCH(pg):30.56±3.23比35.02±1.83,MCHC(g/L):299.62±14.19比314.76±15.63,MCV/RBC:21.52±5.09比25.45±3.39,均P<0.01〕。MCH的截断值为33.65 pg时,诊断α-地中海贫血的敏感度为所有指标中最高(83.2%);MCV+MCH联合检测的特异度最高(94.6%);MCH+MCV/RBC联合检测对α-地中海贫血的检验效能最高(AUC=0.889),其对应的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为81.7%、87.8%、62.7%和95.0%。结论脐带血血常规红细胞参数联合应用对α-地中海贫血的诊断具有较高的敏感度和特异度,能够为该疾病临床诊断和防控提供重要的参考依据,值得临床应用和推广。

重型先天性中性粒细胞缺乏症合并克罗恩病:1例报道并文献复习

重型先天性中性粒细胞缺乏症(severe congenital neutropenia,SCN)为罕见疾病,本文报道1例出生后反复发生严重感染、结肠溃疡合并出血、重度生长发育迟缓、脊柱后凸畸形伴骨质疏松、佝偻病等多种表现的SCN合并克罗恩病、佝偻病,直至18岁明确诊断。本文对其临床、基因特征及诊疗过程进行分析,并结合文献进行讨论。希望能对临床早期诊断提供参考,提高患者生存率及生活质量。

G6PD缺陷与肠道病毒71型手足口病的关系

目的探讨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)缺陷对肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染所致手足口病的影响及可能机制。方法选取确诊为EV71感染手足口病的男性患儿220例,根据病情分为普通组(145例)和重症组(75例);将同期体检的132例健康男性儿童设为对照组。用全自动生化仪进行血液中G6PD、还原型谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)水平的测定。结果重症组G6PD缺陷比例明显高于对照组(P<0.0125)。重症组中G6PD缺陷患儿的总热程、精神异常时间、肢体抖动持续时间及住院时间均较G6PD正常者长(P<0.05)。急性期及恢复期普通组与重症组患儿血中GSH、G6PD水平均低于对照组(P<0.05),MDA水平均高于对照组(P<0.05)。普通组及重症组G6PD缺陷患儿急性期血GSH水平均低于G6PD活性正常患儿,MDA水平均高于G6PD活性正常患儿(P<0.01)。急性期及恢复期患儿GSH水平与G6PD活性均呈正相关(分别r=0.61、0.58,均P<0.01);急性期患儿MDA水平与G6PD活性呈负相关(r=-0.29,P<0.01)。结论 G6PD缺陷可能是EV71型手足口病的易感因素,伴G6PD缺乏的患儿病情可能更重,其机制可能与氧化应激有关。