红曲菌几种主要次级代谢产物及其生物活性的研究进展

红曲在我国古代也称"丹曲",传统的红曲是指以大米为原料,接种红曲菌经固态发酵而成的红曲米。红曲在中医上具有健脾化食、燥湿化痰、活血化瘀等功效;工业上常用于制作红曲米酒和腌渍肉、鱼等。红曲菌能产生多种次级代谢产物,例如红曲色素、莫纳可林K(MonacolinK,MK)、γ-氨基丁酸(GABA)、抗氧化物质、降血压物质等,其中部分代谢产物具有降血压、降血脂、抗菌、抗氧化和抗癌等重要的生理活性。本文介绍了近年来红曲菌几种主要次级代谢产物及其生物活性的研究进展。

1株高效聚磷节杆菌的分离鉴定及其聚磷特性研究

[目的]为降低水中磷含量以控制水体富营养化,从自然界筛选高活性的聚磷菌,用于生物除磷。[方法]以聚磷效果为主要指标,通过富集分离筛选细菌,并对其培养条件优化,提高其聚磷能力。根据生理生化反应特点以及分子生物学分析,对分离到的高效聚磷菌进行鉴定。[结果]从污水和污泥中分离到9株有效聚磷菌,其中菌株J-12的聚磷能力最强。16S rDNA序列分析显示,J-12与节杆菌属的同源性达99%,结合生长特性、生理生化特性,初步确定该菌株属于节杆菌属的一个种(Arthrobacter sp.),尚未见到具有高效聚磷作用的节杆菌的报道。研究表明,J-12在生长温度32℃,pH值7.0,微量元素液添加量为4ml的条件下,培养10h,可使合成废水中总磷由20.0mg/L降至0.1mg/L,聚磷率达95%以上。[结论]筛选到1株具有高效聚磷菌能力的节杆菌,在污水治理和水产养殖业中有着潜在的应用前景。

以吡啶硫胺素抗性基因为选择标记的红曲菌原生质体转化研究

[目的]以吡啶硫胺素抗性基因(Pyrithiamine Resistance Gene,ptrA)为选择标记基因,对红曲菌原生质体转化体系进行研究,以期为红曲菌基因功能的研究奠定基础。[方法]采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法,将含有吡啶硫胺素抗性基因(ptrA)的pPTRⅡ质粒转入橙红色红曲菌AS3.4384原生质体中,随机挑选5个转化子,通过PCR方法和Southern杂交对转化结果进行检测,验证pPTRII质粒是否整合到转化子染色体DNA中。[结果]pPTRⅡ质粒转入红曲菌AS3.4384原生质体中的转化率为20～24个/μg,PCR检测结果显示,基因组DNA中有吡啶硫胺素抗性基因的存在,Southern杂交分析发现,ptrA基因随机整合到了转化子的染色体上,该结果表明ptrA基因可用作红曲菌转化的选择标记。[结论]该研究是吡啶硫胺素抗性基因在红曲菌中的首次转化研究,试验结果为红曲菌的基因功能研究奠定了基础。

超声处理对大豆7S蛋白潜在致敏性的影响

利用超声波改性处理大豆7S蛋白,并评估超声处理产物体外消化性及消化产物抗原性和潜在致敏性的变化。结果表明,7S蛋白耐唾液、胃液消化,但其在300 W超声处理80 min后易被十二指肠消化;进一步利用体外免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G结合能力评估消化产物抗原性的强弱,超声处理7S蛋白后,随着超声处理时间(0~120 min)的延长,其消化产物的抗原性总体上呈现先升高后降低的趋势,在超声100 min时,消化产物的抗原性最低;利用体外Ig E结合能力评估其潜在致敏性,随超声处理时间(0~120 min)的延长,大豆7S蛋白消化产物的Ig E结合能力呈现先升高后降低的趋势,超声80 min时,其消化产物Ig E结合能力最低。研究结果表明超声80 min具有降低大豆7S蛋白潜在致敏性的作用。

基于Arah6的花生间接竞争ELISA检测方法的建立

建立了基于花生主要过敏原蛋白Arah6的间接竞争酶联免疫检测法,实现了对食物中花生的定量检测。利用花生过敏原Arah6纯品免疫新西兰大白兔,制得兔抗Arah6的多克隆抗体,以Arah6纯品作为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,确定了包被抗原质量浓度为1μg/mL,一抗最佳稀释度为1:50000,酶标二抗稀释度为1:5000。此检测方法对Arah6的定量检测范围为16.5～10000ng/mL(折合成含花生的含量,约为165ng/mL～100μg/mL),抑制方程为抑制率I=21.418lgC-6.0633(C为Arah6的质量浓度,单位ng/mL),IC50为414.6ng/mL,相关系数R2=0.9989。该检测方法灵敏度高,检测范围广,适用于食品中花生现场快速检测。

产毒红曲菌中生物合成桔霉素基因--pksCT基因的保守性分析

选用7种14株产桔霉素红曲菌,运用基因组PCR分析方法,从它们的基因组中分别扩增到两条大小分别为669bp和591bp的pksCT基因翻译起始区部分序列和终止密码子区部分序列片段。扩增产物的测序结果通过NCBI进行BLAST同源性分析。结果显示扩增产物序列之间具有高度同源性,且分别与Genbank中公布的紫色红曲菌中pksCT基因翻译起始区部分序列和终止密码子区部分序列一致。pksCT基因是红曲菌中普遍存在的生物合成桔霉素基因。运用基因组PCR分析pksCT基因,是鉴别红曲菌产毒株的有效方法之一。

快速检测小麦和玉米中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇

采用DON快速检测试纸条检测小麦和玉米样品,并对检测过程进行了优化,最后采用ELISA试剂盒进行比较和分析.结果发现14号和15号小麦样品为阳性,其余样品均为阴性,两种方法的检测结果一致;样品的颗粒大小、水质、搅拌时间和静置时间等对试纸条的检测结果无明显影响,显示该试纸条适合现场快速筛查.

胶束电动色谱法分析奶中两种主要的共轭亚油酸异构体

以胶束电动色谱法对奶样中共轭亚油酸主要的两种异构体进行了分析。在优化条件下(80 mM pH9.0的磷酸盐缓冲液,54 mMSDS,4%(w/v)β-CD,8 M尿素,4%(v/v)乙醇作为运行缓冲液,分离电压25 kV,柱温20℃),胶束电动色谱可在15 min内对奶样中两种主要CLA,即9c,11t-CLA和10t,12c-CLA进行分离测定,最低检出限为0.081 ng/mL。分析结果显示,不同处理奶样中的CLA含量差异显著(P<0.001),但CLA的组成相近,其中的10t,12c-CLA含量差异不显著P=0.999,约为3%;不同品种奶样,如牛奶、水牛奶和羊奶中的CLA含量差异显著(P<0.001),其中CLA含量次序为牛奶>羊奶>水牛奶,并且不同品种奶的9c,11t-CLA与10t,12c-CLA比例差异显著(P<0.05)。

提高腐竹筋力的工艺优化

[目的]研究腐竹生产的工艺条件对腐竹筋力的影响。[方法]精选5个大豆品种,探讨大豆各组成含量与腐竹筋力的关系;选取腐竹提膜温度、浆液pH值、煮沸时间、浆液浓度4个主要影响因素为研究对象,腐竹膜拉伸力为考察目标,通过单因素试验和正交分析确定腐竹生产的优化工艺参数。[结果]东农42大豆品种蛋白质含量最高、脂肪含量最低,生产的腐竹膜拉伸力最大,达0.726 N。4个主要因素对腐竹筋力影响由大到小的顺序为:浆液浓度、浆液pH值、腐竹提膜温度、浆液煮沸时间。在煮沸时间3 min、腐竹提膜温度90℃、浆液pH值7.5、浆液浓度6%的工艺条件下,生产的腐竹膜拉伸力最大,为0.743 N。[结论]优选出的最佳工艺条件可以增强腐竹的筋力,改善腐竹的口感,为企业生产安全优质腐竹提供了技术支持。

橙色红曲菌pyrG缺陷株的筛选及鉴定

[目的]筛选和鉴定橙色红曲菌pyrG缺陷株。[方法]以橙色红曲菌AS3.4384(Monascus aurantiacus)为出发菌株,运用紫外照射致基因突变,随后对尿嘧啶依赖型菌株的pyrG基因进行测序比对,筛选pyrG基因突变株,最后用含有米曲霉pyrG基因的pAOP互补质粒对其进行基因转化试验。[结果]经紫外诱变得到一株尿嘧啶依赖型的5-FOA抗性菌株UM28。扩增其pyrG基因并进行测序,发现UM28的pyrG基因在核苷酸序列+220bp的位置发生了突变,进而导致氨基酸水平上Pro→Ser的突变,造成了乳清苷-5'-磷酸脱羧酶的失活。UM28通过基因转化能够接受含有米曲霉pyrG基因的互补质粒恢复野生表型,且回复突变率低于10-8,能够用于红曲菌同源转化系统的构建。[结论]获得了一株红曲菌pyrG基因缺陷株UM28,它可被用作基因工程的受体菌。

橙色红曲菌As3.4384 orf7基因缺失株的构建及其功能分析

红曲菌能产生多种有益的次级代谢产物,但红曲菌也产生一种对人和哺乳动物肝和肾有毒害的毒素,即桔霉素。因此控制毒素的产生是保障红曲产品安全性所必须的。故对桔霉素的合成途径及相关的基因做深入了解。6个桔霉素合成相关的基因成簇位于21 kb的DNA片段上。克隆了一个新基因(orf7基因),其位于该基因簇的外侧。采用基因敲除技术,构建红曲菌orf7基因缺失菌株。并采用紫外分光光度法检测orf7基因缺失菌株的红曲色素产量,HPLC法检测其桔霉素产量。orf7缺失菌株产红曲色素能力与出发菌株As3.4384相比没有变化;产桔霉素培养13～19 d,桔霉素的产量与出发菌株As3.4384相比增加了142.4%。从而证实orf7基因与桔霉素代谢相关。

链球菌G蛋白IgG结合域(GBx)的融合表达及其IgG结合活性的比较分析

链球菌G蛋白的IgG结合域能够特异性地结合IgG的Fc区,是制备免疫微阵列的一种理想的IgG固定材料。克隆表达了具有IgG结合活性的3种IgG结合域的GST融合蛋白(GST-GBx),该3种蛋白分别含有1个、2个和3个IgG结合域。采用ELISA对三蛋白IgG结合能力进行了比较分析。结果表明在含B-Domain的量相同的情况下,GST-GB3蛋白固定IgG的量最多,其次为GST-GB2,GST-GB1最弱;对IgG的灵敏度也是GST-GB3最强,GST-GB1最弱,提示GST-GB3固定IgG的能力较其他两蛋白具有明显优势。

两种水生动物抗菌肽的原核表达及活性分析

将两种水生动物分泌的抗菌肽基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建了pGEX-Y18和pGEX-CEC1两个融合蛋白表达载体,转化至E.coli Rosetta中进行表达,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在。融合蛋白经复性、酶切处理获得抗菌肽Y18和CEC1。抑菌实验结果表明:融合蛋白GST-Y18和GST-CEC1、抗菌肽Y18和CEC1都能有效地抑制E.coli DH5α、S.aureus、B.subtilis和S.cerevisiae的生长。

发酵工艺条件对豆粕中过敏蛋白降解的影响

为了降低豆粕的致敏性,探讨生物发酵对豆粕中主要过敏原降解的影响。通过固态法发酵豆粕,采用单因素试验优化发酵工艺条件,并利用SDS-PAGE电泳评估发酵条件对豆粕中过敏蛋白降解的影响。结果表明:枯草芽孢杆菌:干酪乳杆菌:酵母菌接种比例为2:1:1,接种量为12%,发酵温度为30℃,豆粕含水量为60%,先接种枯草芽孢杆菌发酵24 h,再接种干酪乳杆菌和酵母菌继续发酵48 h后,发酵豆粕中过敏蛋白降解显著,确定该条件为优化的发酵条件。验证试验表明,在优化发酵条件下固态发酵可较好地降解豆粕中主要过敏原。