神经生长液促大鼠坐骨神经再生的实验研究

目的评价一种新型中药-神经生长液对大鼠坐骨神经损伤后神经再生的影响。方法SD大鼠50只雌雄各半,采用随机数字表法将其随机分成5组:神经生长液低、中、高剂量组,弥可保组和空白对照组。采用坐骨神经夹伤模型,于术后每5d测定坐骨神经功能指数(sciaticnerveindex,SFI),术后第20天行电生理,组织学检测及超微结构观察。结果术后5d时实验组(-72±9)与对照组(-79±8)间SFI差异无显著性意义(F=1.58,P>0.05),10d时高剂量组(-60±9)和弥可保组(-61±7)优于对照组(-75±7)(F=5.1,P<0.05),15d和20d时低、中、高剂量组及弥可保组均优于对照组(F=6.83和9.92,P<0.05)。坐骨神经干动作电位传导速度,小腿三头肌最大收缩力检测,及脊髓前角运动神经元记数、再生有髓纤维数、肌细胞截面积等指标神经生长液低、中、高剂量组及弥可保组均优于空白对照组(F=26.29,51.35,7.86,37.38,11.11,P<0.05)。超微结构观察实验组有髓神经纤维的髓鞘形态、厚度、成熟度均优于对照组,变性纤维的数目少于对照组。结论神经生长液能促进周围神经再生及功能的恢复。

神经再生素激活PC12细胞ERK1/2的实验研究

本实验初步探讨了神经再生素 ( NRF)作用于 PC12细胞的信号传导途径。采用 MTT法检测 NRF对无血清培养的PC12细胞存活率的影响 ;用磷酸化的 Elk单克隆抗体 ,通过 Western blot法观察 NRF的不同浓度 ( 10、10 0、10 0 0 ng/ m l)及不同作用时间 ( 0 min、15 min、3 0 min、1h、2 h)对无血清培养的 PC12细胞 ERK1/ 2活性的影响 ;还运用 MEK1/ 2阻断剂 U0 12 6,观察NRF激活 ERK1/ 2是否需要其上游信号蛋白 MEK1/ 2的激活。结果表明 ,NRF作用于无血清培养的 PC12细胞 ,可以激活ERK1/ 2 ,存在明显的剂量效应关系和时间依赖作用 ,在 10 0 0 ng/ ml浓度下最大 ,作用 2 h时达峰值 ;U0 12 6作用后 ,可抑制 NRF作用于 PC12细胞引起的 ERK1/ 2的激活。由此可见 ,NRF对无血清培养的 PC12细胞具有保护作用 ,可能通过激活 ERK1/ 2磷酸化级联途径来介导这些作用。

神经再生素对神经细胞生长影响的实验研究

目的 :探讨神经再生素 (NRF)对离体培养的 PC12细胞、背根神经节细胞、大脑皮层细胞生长影响的分子生物学机制。方法 :采用细胞体外培养、半定量 RT- PCR、Western blot方法 ,观察和比较 NRF组 (添加 NRF)、NGF组 (添加 NGF)和空白对照组 (基础培养基 )中细胞生存状况及相关基因 m RNA及其蛋白水平的表达变化。结果 :NRF作用于离体培养的 PC12细胞 ,可促使其分化 ;作用于背根神经节细胞 ,GAP- 4 3和 NF- L m RNA表达在不同时间呈不同程度的上调 ;作用于大脑皮层细胞 ,GAP- 4 3和 NF蛋白亦比对照组表达量为高。结论 :NRF具有维持细胞生存和促进神经细胞突起生长的作用 ,并可使神经元 GAP- 4 3和 NF m RNA表达及其蛋白合成上调。

神经再生素对皮层细胞基因表达影响的基因芯片研究

目的 :采用基因芯片技术 ,观察神经再生素对体外培养的胚鼠大脑皮层细胞基因表达的影响。方法 :取ICR胚鼠 (15d)大脑皮层细胞 ,无血清培养。实验组加入神经再生素 (2 μg/ml) ,对照组加入等量基础培养液。培养 6h后 ,抽提实验组和对照组皮层细胞总RNA ,经反转录分别用Cy5、Cy3荧光标记成cDNA探针。将荧光标记的cDNA与MGEC 40s基因表达谱芯片杂交 ,芯片扫描、数据处理。结果 :实验组和对照组大脑皮层细胞出现 64条差异性表达的基因。呈现上调的基因有 :钙调素结合蛋白、锌指蛋白激酶、核糖体蛋白等基因 ;下调基因有 :抑制细胞分裂因子等基因。结论 :神经再生素可作用于体外培养的胚鼠大脑皮层细胞 。

神经再生素对PC12细胞Caspases-3的影响

目的 :探讨神经再生素抑制PC12细胞凋亡的作用机制。方法 :采用流式细胞仪和RT PCR ,观察神经再生素对无血清状态下PC12细胞Caspases 3活力及Bax、Caspases 3mRNA的影响。结果 :与对照组相比 ,神经再生素可抑制无血清培养的PC12细胞Caspases 3活力 ,并可使Bax、Caspases 3mRNA的表达减少。结论 :神经再生素可以通过抑制Caspases 3基因表达和活化 。

神经再生素对PC12细胞凋亡的影响

目的 研究神经再生素 (NRF)对PC12细胞凋亡的影响并初步探讨其机制。 方法 通过观察细胞形态的变化、MTT微量比色法、流式细胞仪AnnexinV和caspase 3活力检测等方法 ,了解NRF对低浓度血清培养下PC12细胞凋亡的影响。NGF和RPMI16 40作对照。 结果 培养细胞的突起生长数量和长度、MTT微量比色的A值、AnnexinV PE 7AAD显示的凋亡细胞比例、caspase 3活力的检测等指标 ,在NRF组和NGF组间无明显差异 ;而与空白对照组间差异有显著性意义。 结论 神经再生素对低血清培养下PC12细胞的凋亡有抑制作用。

神经再生素对PC12细胞凋亡的影响

目的 :研究神经再生素 (NRF)对PC12细胞凋亡的影响。方法 :通过多种方法 ,了解NRF对低浓度血清培养下PC12细胞凋亡的影响。结果 :培养细胞的突起生长数量和长度、MTT微量比色、AnnexinV -PE/7AAD显示的凋亡细胞比例、caspase -3活力的检测等指标 ,在NRF组和NGF组间无明显差异 ;和空白对照组间差异有显著性意义。结论

大鼠陈旧性坐骨神经缺损修复期限的实验研究

目的探讨大鼠陈旧性坐骨神经缺损的修复期限,观察自体神经移植对大鼠陈旧性坐骨神经缺损的修复作用。方法清洁级SD大鼠36只,随机分为6组,每组6只。切除大鼠左侧部分坐骨神经,制作神经缺损模型。神经损伤后1、3、6个月用对侧自体神经修复神经缺损作为A1、B1、C1组,不予修复作为对照A2、B2、C2组。术后每周观察步态、足趾皮肤及腿部肌肉的变化。第2次术后3个月,进行电生理检查、荧光金(fluorogold,FG)逆行示踪、腓肠肌Masson染色、再生神经亮绿-变色酸2R-磷钨酸法染色与透射电镜观察。结果神经损伤后各组大鼠均有足部溃疡、跛行等失神经表现,修复术后2个月,A1、B1组溃疡愈合,跛行改善,其余各组仍有溃疡、跛行。修复术后3个月,A1、B1、C1组的运动神经传导速度分别为(21.84±6.74)、(20.02±4.17)、(16.09±8.21)m/s,组间差异无统计学意义(P>0.05)。复合肌肉动作电位(compound muscle actionpotential,CAMP)波幅分别为(12.68±4.38)、(9.20±3.43)、(1.22±0.39)mV,A1、B1组与C1组比较差异有统计学意义(P<0.05);A2、B2、C2组未记录到CAMP。FG逆行示踪观察,A1组阳性细胞最多,胞体较大,B1组居中,C1组阳性细胞最少,胞体最小。腓肠肌Masson染色示A1、B1组腓肠肌纤维形态接近正常,C1、A2、B2、C2组肌纤维明显萎缩。A1、B1、C1组肌纤维横截面积为(340.73±118.46)、(299.88±119.75)和(54.33±53.43)μm2,A2、B2、C2组为(78.60±51.38)、(65.62±25.36)和(40.93±28.22)μm2。A1、B1组与C1、A2、B2组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。神经形态观察,A1组再生有髓神经纤维数量多,直径粗,髓鞘厚;B1组再生神经纤维的数量和形态与A1组相似;C1组中再生的有髓神经纤维数量少,纤维细,髓鞘薄;A2、B2、C2组则仅见SC及增生的胶原纤维。结论自体神经移植能不同程度修复缺损1个月和3个月的大鼠坐骨神经,但对缺损6个月的大鼠坐骨神经修复作用不明显。

大鼠坐骨神经缺损半个月后人工组织神经移植物修复的实验研究

为了观察人工组织神经移植物对大鼠坐骨神经非新鲜损伤的修复作用。我们在成年SD大鼠左侧股中部切除部分坐骨神经制造神经缺损模型。15d后,实验组(9只)用人工组织神经移植物修复神经缺损,自体神经修复作为阳性对照(6只),保持神经缺损为阴性对照(6只)。第二次手术后3个月,电生理学、形态学结果显示实验组的再生神经虽略差于自体对照组,但明显优于缺损对照组,腓肠肌的萎缩形态学指标变化则较接近自体对照组。实验结果表明人工组织神经移植物对已缺损15d的大鼠周围神经具有较好修复作用。

周围神经损伤后相关结构组织学变化的实验研究

目的 :观察大鼠周围神经损伤后不同时期 ,神经元胞体、损伤神经远端及靶器官的形态学变化。方法 :于股中部切除成年SD大鼠右侧坐骨神经 6mm ,建立坐骨神经缺损伤模型 ,左侧不做手术作为对照。在术后不同时期取材 ,观察脊髓前角运动神经元、损伤远端神经结构及损伤侧肌肉的改变。结果 :周围神经损伤后 1个月 ,脊髓前角运动神经元数目减少 ,但伤后 1个月 ,损伤神经远端施万细胞增生并形成B櫣ｎｇｎｅｒ带 ;3个月时B櫣ｎｇｎｅｒ带断裂 ,成纤维细胞明显增生 ;6个月时成纤维细胞减少 ,胶原纤维呈致密平行排列。伤后 1个月时损伤侧腓肠肌纤维明显萎缩 ,结缔组织增生 ;2个月后肌纤维萎缩速度减慢 ,以结缔组织增生为主。电镜下 ,神经切断后 1月、2月、3月时 ,髓鞘消失 ,原来有髓神经纤维轴突部位出现大量巨噬细胞样细胞 ;4个月和 6个月时 ,巨噬细胞样细胞消失 ,形成无髓神经纤维样结构 ,周围由胶原纤维填补。结论 :周围神经损伤早期神经元即明显减少 ,晚期趋于稳定。肌纤维萎缩以损伤早期为主 ,以后转为结缔组织增生。损伤神经远端在损伤早期以施万细胞增生为主 。

周围神经损伤后Tropic 1808基因表达蛋白的免疫组织化学研究

目的 研究Tropic 180 8基因表达蛋白在受损大鼠坐骨神经中的表达与分布。 方法 用酶联间接法和双重免疫荧光法进行免疫组织化学染色。并通过计算机图像处理技术 ,测量阳性区域的强度与面积。 结果 损伤神经的近侧端和远侧端中施万细胞均有Tropic 180 8基因表达蛋白的阳性免疫反应 ,阳性免疫反应物主要分布于施万细胞膜上 ,远侧端的阳性反应物强度和面积强于和大于近侧端。 结论 周围神经损伤后 ,Tropic180 8基因表达蛋白分布于损伤近侧端和远侧端的施万细胞膜上 ,并且远侧端中该蛋白的表达强于近侧端。

神经生长液对兔周围神经损伤的修复作用研究

目的:研究神经生长液(nerve growth decoction,NGD)促进兔周围神经损伤的修复作用。方法:大耳白兔40只,雌雄各半,行腓总神经夹伤术。实验分为五组:NGD低、中、高剂量组,弥可保组(阳性对照),空白对照组。口服给药四周后行电生理、组织学检测和超微结构观察。结果:NGD高、中剂量组和弥可保组在腓总神经传导速度恢复率,脊髓前角运动神经元的存活率及再生髓鞘计数均明显好于空白对照组(P<0.01)。超微结构观察给药组有髓神经纤维的髓鞘形态、厚度、成熟度均优于对照组,变性纤维的数目少于对照组。结论:神经生长液能促进损伤周围神经的再生和功能的恢复。

中药合剂神经生长液的促神经生长作用

目的观察中药合剂神经生长液对神经元生长的促进作用,为神经生长液用于治疗神经损伤、促进损伤神经修复提供实验依据。方法新生大鼠背根神经节无血清培养,在基础培养液中加入神经生长液,观察实验组与空白对照组背根神经节细胞生长状况和突起生长的长度。胎鼠大脑皮质神经元无血清培养,在基础培养液中加入神经生长液,采用3-(4,5-dimethylthiaz-2-y1)-2,5-dijohenyltetrazoliumbromide(MTT)法,观察实验组、神经生长因子(阳性对照)、空白对照组大脑皮质神经元的生长状态。结果与对照组相比,实验组背根神经节细胞突起生长明显,突起长度(314±43)μm显著大于对照组(76±26)μm(F=313.69,P<0.01);与对照组相比,神经生长因子、神经生长液均可显著提高无血清培养条件下大脑皮质神经元对MTT的代谢率(F=82.54,P均<0.01),且存在明显的剂量效应关系。结论神经生长液在体外可促进背根神经节和大脑皮质神经元生长。

大鼠发育过程中脊髓组织CAPON与Dexras1 mRNA表达的实验研究

为探讨大鼠发育过程中神经型一氧化氮合酶羧基末端PSD-95/DLG/ZO-1（PDZ）结合配体（carboxy-terminal PDZ ligandof nNOS,CAPON）与Dexras1 mRNA的表达及二者的相关性,本实验采用大鼠发育模型,通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Realtime-PCR）及原位杂交组织化学（ISH）与免疫组织化学相结合的技术检测脊髓组织中CAPON及Dexras1 mRNA的表达变化。结果表明：在胚胎14~18d的脊髓组织中,CAPON mRNA呈低水平表达,生后1d表达升高并达到高峰。从形态上看,表达于尚未分化成熟的前角,随后呈逐渐下降趋势。在生后12w,表达于脊髓后角。而Dexras1 mRNA在胚胎14d呈低水平表达,16~18d时表达升高,同样在生后1d出现表达高峰并定位于尚未分化成熟的前角,随后表达逐渐下降。生后12w,在后角有表达。根据Real-time PCR结果作直线相关分析,在生后脊髓发育过程中CAPON与Dexras1 mRNA表达呈高度相关,于生后1d共定位于脊髓前角。形态学结果显示CAPON与神经型一氧化氮合酶（nNOS）表达于相同细胞,但亚细胞定位不同。本研究表明,大鼠发育过程中,脊髓组织中CAPON及Dexras1 mRNA存在共表达,提示CAPON可能通过调节nNOS,进而激活Dexras1,在神经元的分化、突触的可塑性及突触发生过程中发挥一定的作用。

生长相关蛋白及其mRNA在大鼠损伤坐骨神经中的表达

为了研究大鼠周围神经损伤后远侧端组织中生长相关蛋白 (GAP-4 3 )及其 m RNA的表达 ,采用正常 SD大鼠坐骨神经横断损伤的模型 ,于术后不同时间取坐骨神经远侧端组织 ,以 Western Blot和 RT-PCR法检测 GAP-4 3及其 m RNA的表达。RT-PCR法检测结果显示 ,正常大鼠坐骨神经组织中 GAP-4 3 m RNA表达量较低 ,而损伤坐骨神经的远侧段 GAP-4 3 m RNA的表达量明显增加 ,于损伤第 2周时达高峰。用抗 GAP-4 3抗体进行 Western Blot检测 ,结果表明 ,正常坐骨神经 43 k Da处出现弱阳性反应的蛋白区带 ,而损伤后坐骨神经远侧段 43 k Da处阳性反应条带着色明显加深 ,损伤后第 3周时阳性反应着色最强。本研究结果提示 ,GAP-4 3及其 m RNA在大鼠损伤坐骨神经远侧段组织中表达增强 ,其 m RNA表达上调高峰在神经损伤后的第 2周 ;而其蛋白合成增加最为明显的时间是在神经损伤后的第 3周。

人工组织神经移植物对大鼠陈旧性坐骨神经缺损(60天)的修复作用

目的观察人工组织神经移植物对陈旧性大鼠坐骨神经缺损的修复作用。方法切除成年SD大鼠部分左侧坐骨神经,饲养60d形成陈旧性坐骨神经缺损后,以人工组织神经移植物修复缺损,同时设自体神经修复和不修复两对照组。修复术后3个月做神经-肌复合电位、腓肠肌湿重及再生神经形态学检测。结果人工组织神经移植物修复组实验侧的运动神经传导速度、腓肠肌湿重、移植物远侧再生神经有髓神经纤维髓鞘厚度等结果与自体神经修复组相似。不修复对照组则未记录到神经-肌复合电位,未观察到再生神经纤维结构,腓肠肌湿重明显小于人工组织神经移植组和自体神经移植组。结论人工组织神经移植物在一定程度上能修复缺损60d的大鼠坐骨神经。

施万细胞对骨髓基质干细胞向神经组织细胞分化诱导的作用

背景:骨髓基质干细胞具有向神经组织细胞分化的多潜能特性。以往实验以化学试剂作为诱导剂加入细胞培养液中,在体外成功地诱导出神经组织细胞。目的:观察大鼠施万细胞和骨髓基质干细胞体外共培养后,骨髓基质干细胞能否被诱导向神经组织细胞分化。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-09/2008-10在南通大学医学院组织学与胚胎学教研室及江苏省神经再生重点实验室完成。材料:SPF级新生1～3d龄SD大鼠用于制备施万细胞,SPF级成年雄性SD大鼠用于制备骨髓基质干细胞,动物均由南通大学实验动物中心提供。方法:将传2代培养的骨髓基质干细胞和施万细胞分别以1×105和1×106的密度接种于transwell双层6孔细胞培养板的皿底和板底,两种细胞间隔以PET膜,其膜孔径为0.4μm,于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中进行非接触性共培养14d。另外,将施万细胞培养上清作为条件培养基,培养骨髓基质干细胞14d。主要观察指标:光镜下观察共培养后骨髓基质干细胞的形态变化;MTT检测共培养前后骨髓基质干细胞的活性;免疫荧光染色鉴定共培养后骨髓基质干细胞S-100蛋白的表达,流式细胞仪测定S-100蛋白阳性率;免疫荧光染色检测条件培养基培养后骨髓基质干细胞S-100,P75,GFAP的表达。结果:共培养后的骨髓基质干细胞形态发生改变,原来宽大扁平的胞体开始收缩,细胞胞体呈梭形,部分细胞类似施万细胞呈线性排列。共培养前后及条件培养基培养后,骨髓基质干细胞的活力无明显差异(P>0.05)。共培养14d后,骨髓基质干细胞表达施万细胞表面标记S-100蛋白,阳性率达(22.54±2.36)%。条件培养基培养14d后,骨髓基质干细胞表达施万细胞表面标记S-100蛋白,P75,GFAP。结论:施万细胞分泌因子可以诱导部分骨髓基质干细胞向神经组织细胞分化,并表达施万细胞表面标记。

N-糖链合成相关β-1,4-半乳糖基转移酶在大鼠坐骨神经损伤后的表达变化

为了分析与 N-糖链合成相关β-1,4-半乳糖基转移酶 - 、 、 (β-1,4-galactosyltransferase , , ,β-1,4-Gal T- , , ) m RNA在正常和损伤坐骨神经组织的表达变化。本研究采用 RT-PCR方法 ,分析 β-1,4-Gal T- 、 、 在小鼠坐骨神经中的表达存在。以扩增的 c DNA片断标记探针 ,Northern blot分析β-1,4-Gal T- 、 、 m RNA在正常和损伤大鼠坐骨神经的表达变化。结果表明 :通过 RT-PCR方法 ,检测到 β-1,4-Gal T- 、 、 在小鼠坐骨神经中的表达存在 ;采用 Northern blot方法 ,发现β-1,4-Gal T- 、 、 在正常大鼠坐骨神经中有表达 ,并在坐骨神经损伤后发生表达变化 ,但三种同功酶的表达变化各不相同。结论 :本实验发现 β-1,4-Gal T- 、 、 在坐骨神经有表达 ,并在坐骨神经损伤后发生表达变化。提示与

神经生长液活血化瘀药理作用及对小鼠耐力的影响

目的 :研究神经生长液的药理作用 ,以及对小鼠耐力的影响。方法 :大鼠随机分成 5组 :神经生长液高、中、低剂量组 ,华佗再造丸组 (阳性对照 ) ,空白对照组。灌胃法给药 15天。心脏取血 ,采用凝固比浊法对APTT、PT进行测定 ,用Derive法测定FIB ;全自动血细胞计数仪测定血小板数。小鼠随机分成 5组 :神经生长液高、中、低剂量组 ,刺五加组 (阳性对照 ) ,空白对照组。以灌胃法给药 15天。测定各组小鼠负重 10 %体重游泳时间。结果 :神经生长液高剂量能显著延长APTT(P <0 .0 5 )及显著延长小鼠负荷游泳时间 (P <0 .0 1)。但对PT、FIB和血小板数无明显影响。结论 :神经生长液具有活血化瘀的作用 ,表现内源性凝血时间延长。神经生长液可增强小鼠的耐力。