B6-Co与B6小鼠眼睑角质形成细胞的原代无血清培养及比较研究

为进一步研究B6-Co小鼠眼睑发育缺陷机制,首次培养了小鼠眼睑角质形成细胞,并对B6-Co和B6小鼠眼睑角质形成细胞的迁移能力进行划痕实验分析,FITC-phalloidin染色比较B6-Co和B6小鼠肌动蛋白细胞骨架。结果表明,B6-Co小鼠眼睑角质形成细胞迁移的数目和距离明显少于B6小鼠,细胞骨架异常,B6-Co小鼠眼睑闭合不全(EOB)是由小鼠眼睑角质形成细胞迁移缺陷造成的。

纤维母细胞生长因子10基因在角膜混浊小鼠中的克隆测序与表达研究

目的研究纤维细胞生长因子10(Fgf10)基因在角膜混浊小鼠(B6-Co)中的克隆测序及表达。方法正常小鼠(C57BL/6,B6)和B6-Co小鼠交配,取胚胎16.5dB6和B6-Co小鼠皮肤组织,提取总RNA并逆转录,采用逆转录聚合酶链反应(PCR)技术分段扩增目的基因,连接T载体,转化感受态细胞,筛选阳性克隆,并测序分析;采用实时荧光PCR的方法进一步检测该基因在B6-Co小鼠中的表达。结果测序发现在Fgf10基因第三外显子1 914bp和1 915bp之间插入了碱基A;实时荧光PCR结果显示Fgf10在B6-Co小鼠中的表达明显下降(P<0.05)。结论 Fgf10与B6-Co小鼠出生时眼睑开放(EOB)表型有关,其表达调控机制有待进一步研究。

雷公藤红素对裸鼠肝癌皮下移植瘤抑制作用的研究

目的研究天然活性化合物雷公藤红素(celastrol)对裸鼠移植肿瘤的抑制作用。方法建立人源肝癌HepG2细胞的裸鼠皮下移植肿瘤模型。20只裸鼠随机分为4组,即空白对照组和雷公藤红素高剂量组、中剂量组和低剂量组,每组分别按4.0 mg/kg、2.0 mg/kg、1.0 mg/kg雷公藤红素腹腔给药,每日一次,每周5 d,共给药30 d,实验中每5 d测量一次肿瘤体积的变化。结果雷公藤红素高剂量组、中剂量组和低剂量组的体积抑瘤率分别是89.52%、65.60%和12.21%,与空白对照组相比,高剂量组、中剂量组的差异具有统计学意义(P<0.05)。高剂量雷公藤红素给药后对裸鼠肝脏和肾脏等产生严重的毒性反应。结论雷公藤红素对裸鼠肝癌皮下移植瘤具有良好的体内抗肿瘤效果,应进一步开展药物新剂型及分子结构优化方面的研究,减少其毒副反应。

不同剂量青霉素致SD大鼠癫痫的实验研究

目的:建立不同剂量青霉素诱导的急性癫痫大鼠模型并观察其行为和脑电图变化。方法:将24只SD大鼠随机分为对照组、青霉素模型Ⅰ组和青霉素模型Ⅱ组,每组8只。对照组注射生理盐水,模型Ⅰ、Ⅱ组分别于大鼠腹腔按500万U.kg-1、700万U.kg-1注射青霉素,观察并比较大鼠行为变化和脑电图记录。结果:两个剂量青霉素组均能成功诱发大鼠癫痫,癫痫大鼠的行为以强直和阵挛为主,同时其脑电图上具有明显的痫样放电。结论:500万U.kg-1、700万U.kg-1的青霉素诱导的急性癫痫大鼠模型是一种稳定而可靠的动物模型。

B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞增殖、凋亡及迁移能力实验研究

目的探讨B6-Co小鼠出生时眼睑闭合不全的形成机制。方法分离、培养并鉴定B6-Co小鼠及其背景品系C57BL/6J(B6)眼睑成纤维细胞,CCK8法检测B6-Co、 B6小鼠眼睑成纤维细胞的增殖水平,Annexin V-FITC法检测B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞的凋亡水平,Transwell检测B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞的迁移能力。结果成功培养出B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞,B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的增殖能力和迁移能力极显著低于B6小鼠(P<0.01),B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的凋亡水平极显著高于B6小鼠(P<0.01)。结论 B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的增殖能力、凋亡水平及迁移能力均与B6小鼠有极显著差异。

B6-Co小鼠眼睑体外培养的形态学研究

目的:通过体外组织培养,研究小鼠眼睑体外生长发育情况。方法:剖宫产取18.5dpc胎鼠,分别切取正常彼此融合的上下眼睑及开裂的眼睑,在琼脂小岛上做组织培养,动态观察眼睑外形变化,并作HE染色观察。结果:18.5dpc胎鼠正常眼睑经过14d的培养未发生分离,睑裂沟处的组织松散,细胞凋亡呈无序性;开裂眼睑上皮细胞增殖受阻,周皮与间质部位发生分离。结论:琼脂小岛法体外培养小鼠眼睑,其组织结构及细胞增殖与迁移都不能完全重现体内情况,可能还需要添加多种生长因子。

B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞生长曲线及HSP70表达研究

目的探索B6-Co小鼠与正常C57BL/6小鼠眼睑成纤维细胞增殖能力与HSP70蛋白表达的差异。方法C57BL/6(B6)小鼠按雌雄小鼠2∶1的比例配种获取孕鼠;B6-Co小鼠按B6(雄)×B6-Co(雌)=1∶2或B6(雌)×B6-Co(雄)=2∶1比例配种获得孕鼠,取18.5 d的孕鼠腹中胚胎,再取胚胎眼睑组织培养小鼠眼睑成纤维细胞;用免疫荧光、HE染色鉴定原代细胞、观察成纤维细胞形态。根据血球计数板直接计数法观察两种细胞生长曲线的差异,用Real-time PCR和Western blot检测两种细胞中HSP70的表达量。体外构建HSP70基因siRNA干扰载体,Lipofectamin2000转染B6小鼠眼睑成纤维细胞;Real-time PCR和Western blot实验从mRNA和蛋白水平分别检测HSP70的相对表达量,测定其干扰效率;Transwell实验检测B6小鼠眼睑成纤维细胞的迁移能力。结果小鼠眼睑成纤维细胞生长曲线结果表明,B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞增殖速度慢于B6小鼠眼睑成纤维细胞(P<0.01)。B6-Co小鼠成纤维细胞中HSP70表达量远远低于B6小鼠成纤维细胞,具有显著性差异。B6小鼠眼睑成纤维细胞转染HSP70 siRNA干扰载体后,siRNA-HSP70-3干扰效率最强,mRNA和蛋白水平均被有效抑制,干扰效率高达70%(P<0.05);siRNA-HSP70组在迁移能力上亦显著低于对照组(P<0.05)。结论HSP70基因及蛋白表达下调影响B6-Co的成纤维细胞生长曲线,构建的siRNA-HSP70-3干扰载体能够有效抑制B6小鼠眼睑成纤维细胞中HSP70基因的表达,并显著抑制细胞迁移。HSP70可能参与成纤维细胞胚胎期发育的调控,是造成其EOB表型的重要原因之一。

小鼠上皮细胞培养及其在EOB研究中的应用

小鼠眼睑发育需要表皮角质形成细胞的增殖、分化、凋亡及迁移的协调作用。表皮角质形成细胞是研究眼睑闭合不全机制重要的细胞模型。表皮角质形成细胞培养时,贴壁差,增殖力低,生活力弱,生长条件要求高,传代次数有限。对近年来表皮角质形成细胞的体外培养方法及其在遗传性眼睑闭合不全研究中的应用进行综述,以期为表皮角质形成细胞的长期培养和研究人类先天性眼睑发育缺陷机制提供参考。

HSP70基因对B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞生物学功能的影响

为了研究热休克蛋白70(HSP70)基因对C57BL/6J-角膜混浊(B6-Co)小鼠眼睑成纤维细胞生物学功能的影响,本试验将前期研究并验证的siRNA-HSP70转染C57BL/6J(B6)小鼠眼睑成纤维细胞敲低HSP70基因,体外构建HSP70基因过表达载体转染B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞过表达HSP70基因,通过实时荧光定量PCR和Western blot验证转染效率;CCK8法检测B6和B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的增殖水平;Annexin V-FITC法检测B6和B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的凋亡水平,Transwell试验检测B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的迁移能力。结果显示,B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞转染HSP70基因过表达载体后,HSP70在mRNA和蛋白水平的表达均极显著提高(P<0.01);siRNA-HSP70组B6小鼠成纤维细胞增殖水平极显著低于siRNA-NC组(P<0.01),凋亡水平显著高于siRNA-NC组(P<0.05或P<0.01);pcDNA3.1-HSP70质粒转染组B6-Co小鼠成纤维细胞增殖水平和细胞迁移能力均极显著高于pcDNA3.1-NC组(P<0.01),凋亡水平极显著低于pcDNA3.1-NC组(P<0.01)。结果表明,B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞转染过表达质粒后,HSP70基因表达显著提高,并显著促进细胞增殖和迁移,抑制细胞凋亡;B6小鼠眼睑成纤维细胞中敲低HSP70基因表达后,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡;故HSP70表达水平显著影响成纤维细胞的生物学行为。

SNP标记对角膜混浊小鼠突变相关基因的精细定位

为深入研究前期工作中以ENU诱变技术建立的遗传性角膜混浊突变系小鼠(B6-Co)的遗传机制,利用SNP标记对其突变基因进行精细定位,将该品系中具有角膜混浊表型的小鼠(B6-CoP)与DBA/2小鼠(简称D2)配种得到F1代,再回交D2亲本品系得到F2代,提取F2代角膜混浊小鼠鼠尾DNA。在MGI数据库中选取小鼠13号染色体已定位区间附近5个在C57BL/6(简称B6)和D2两个品系之间有差异的SNP,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术及连锁分析方法对B6-Co小鼠突变基因进行精细定位。结果表明:B6-Co小鼠突变基因定位于13号染色体上112 546 283～113 397 654bp之间,因该区间内有5个已知基因,其中Map3k1基因与小鼠眼睛形态生成和眼睑闭合密切相关,提示Map3k1是B6-Co小鼠突变的强力候选基因。

角膜混浊小鼠突变候选基因Map3k1克隆与序列分析

对具有角膜混浊表型的B6-Co突变系小鼠突变候选基因Map3k1进行克隆及测序分析,寻找该突变系小鼠Map3k1基因的突变位点。以小鼠Map3k1基因的mRNA、全长及上游5 kb序列设计引物,分别以基因组DNA和mRNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术分段扩增目的基因,将目的片段连接在T载体上,转化至感受态细胞,筛选阳性克隆,质粒DNA分子提取,电泳检测,EcoRⅠ酶切释放目的片段,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。成功扩增出Map3k1基因的20个外显子和上游调控序列,B6-Co小鼠测序结果与基因组数据库序列比对,该基因位于13号染色体第112 559 574的碱基由T突变为A,编码的蛋白质第314氨基酸由亮氨酸变为谷氨酸,但是该基因的表达调控及蛋白质剪切机制仍有待深入研究。

TGFα/EGFR通路相关蛋白在B6-Co小鼠眼睑中的表达

目的研究转化生长因子α(transforming growth factorα,TGFα)/表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)通路相关蛋白在B6-Co胎鼠眼睑中的表达情况,探讨B6-Co小鼠眼睑发育异常的原因。方法取胚胎16.5 d、17.5 d、18.5 d的B6和B6-Co胎鼠头部,做冰冻切片,通过免疫荧光法检测各时间点TGFα在眼睑部位的原位表达情况;提取蛋白,采用Western blot法检测TGFα表达及EGFR、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)磷酸化蛋白表达情况。结果免疫荧光检测结果示,TGF氉α主要表达于眼睑间质区,3个时间点B6-Co胎鼠眼睑中TGFα表达的荧光强度均高于同一时间点在B6胎鼠眼睑中的表达。Western blot检测结果示,3个时间点B6-Co胎鼠眼睑中TGFα、p-EGFR的表达与B6胎鼠相比,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。p-ERK在胚胎16.5 d和17.5 d时,B6-Co胎鼠眼睑中的表达量分别为3.79±0.32和3.77±0.16,均显著高于在相应时间点B6胎鼠眼睑中的表达量1.48±0.11和1.45±0.07,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 TGFα/EGFR通路的下游因子ERK可能是导致B6-Co小鼠眼睑异常发育的重要因子。

B6-Co小鼠角膜病的细菌学因素探讨

目的探讨B6-Co小鼠角膜浑浊形成的细菌学因素。方法以正常B6和B6-Co小鼠为研究对象,从不同日龄组的小鼠眼部取角膜分泌物或角膜刮片,分别接种到血平板和营养肉汤上,恒温培养24h。挑取菌落或肉汤管内的悬浮液涂片,革兰氏氏染色,镜检,记录结果。将纯化培养获得的细菌进行鉴定。结果正常B6小鼠与角膜浑浊小鼠存在角膜细菌学差异。结论B6-Co小鼠角膜混浊与微生物感染有关。

C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养与纯化鉴定

为了建立一种易于操作,能够获得高纯度、高活力C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养体系,并对分离提取的细胞进行纯化鉴定,试验在无菌环境下取E12.5胎鼠皮肤,剪碎至1 mm2大小,均匀铺于皿中,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基连续培养4 d,以胰蛋白酶消化-再贴壁法分离纯化目的细胞,分别以NIH3T3、角质形成性细胞作为阳性与阴性对照,采用免疫荧光、Western-blot检测Vimentin及Keratin的表达情况,以鉴定所分离的细胞及其纯度。结果表明:组织块培养24 h即可见成纤维样细胞爬出,培养96 h细胞生长爬满全皿,经胰酶消化、筛网过滤再贴壁接种后能够获得形态均一、活力旺盛、具有成纤维细胞形态学特征的目的细胞;所分离细胞Vimentin表达阳性率为100%,而Keratin表达阳性率为0;与阴性对照角质形成性细胞相比,C57BL/6分离成纤维细胞和NIH3T3细胞均高表达Vimentin,且差异极显著,有统计学意义。说明以E12.5胎鼠皮肤为材料建立成纤维细胞分离培养体系,所分离培养的成纤维细胞具有更高的细胞活力和细胞纯度。

IGF-1基因多态性与汉族青年体质指数和肺活量相关

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因5’调控区CA重复微卫星片段长度多态性与汉族人体质的关系,寻找能够用于基因选材和个性化保健指导的生物标记。方法测定60名19～20岁汉族学生的身体形态发育、心肺机能、运动素质方面的代表性指标。同时采集口腔脱落细胞,提取基因组DNA,PCR扩增目标片段,分析基因位点的多态性情况。用一般线性模型估算基因型与各项体质指标的关系。结果身高、体质量、800 m(女)、1 000m(男)、仰卧起坐、掷实心球指标,不同基因型组间差异不显著(P>0.05),而体质指数、肺活量的测定值,基因型组间差异显著(P<0.05)。CA重复片段长度与体质指数和肺活量负相关。结论本研究的数据显示:IGF-1基因5’调控区CA重复微卫星多态性与汉族青年的体质指数和肺活量显著相关,是预测肺活量和体质指数的有效基因标记,可以用于运动选材和个性化保健指导。

B6-Co突变系小鼠混浊角膜组织蛋白的二维凝胶电泳分析

背景:从蛋白质组学水平研究B6-Co突变系小鼠浑浊角膜与正常B6小鼠角膜组织的异同,有利于阐释人类角膜混浊的发生机制,开辟从表型驱动研究基因功能的新途径。目的:应用二维凝胶电泳分析技术比较分析B6和B6-Co小鼠的角膜蛋白质组学差异。方法:分别提取B6与B6-Co突变系小鼠角膜组织蛋白,将所获得的蛋白质样品进行二维凝胶电泳和凝胶染色,分析电泳图谱,比较正常角膜组织与混浊角膜组织的蛋白质异同。结果与结论:实验成功建立了对小鼠两种角膜组织蛋白的提取及二维凝胶电泳的基本方法和条件,二维凝胶电泳图谱清晰,通过比较分析发现B6-Co突变系小鼠混浊角膜蛋白质组中有13个蛋白质点显著下调,6个表达显著上调。B6小鼠和B6-Co突变系小鼠角膜蛋白质组有显著差异表达,提示由于基因的突变导致了相关信号通路的基因表达上调、下调或沉默。

遗传性角膜病小鼠生物学特性观察

目的:研究通过ENU诱变手段获得的遗传性角膜病小鼠B6-Co的生物学特性。方法:观察比较遗传性角膜病小鼠与正常B6小鼠的繁殖学指标、生长发育参数,B6-Co不同表型间脏器重量、脏器指数、血常规、尿常规以及行为学方面的异同。结果:B6-Co小鼠不育率22%、平均产仔数5.62±2.55只、离乳成活率56.59±41.22显著低于正常的B6小鼠,而胎间隔29.50±10.50天比正常B6小鼠短。B6-Co小鼠出生后2周内生长发育与正常B6小鼠基本一致,2周后,其生长发育慢于正常B6小鼠。B6-Co小鼠雌雄间的眼球、肺、胸腺、肾上腺的脏器指数差异有统计学意义。B6-Co表型异常小鼠与B6-Co表型正常小鼠相比,肺、肾上腺、子宫、睾丸的脏器系数差异有统计学意义。B6-Co小鼠表型异常小鼠在血红蛋白和红细胞数量上异于B6-Co表型正常小鼠。平衡木的成绩得分:B6-Co表型正常小鼠3.50±0.69、B6-Co单眼小鼠2.17±0.78、B6-Co双眼小鼠1.87±0.80依次降低,且与角膜病变的程度呈负相关。在抓绳和筑巢实验中,三组成绩差异无统计学意义。结论:由于基因突变导致遗传性角膜病小鼠的繁殖性能下降,生长发育受到影响。B6-Co小鼠各表型间脏器系数有差异,血常规的多项指标有差异。B6-Co表型异常小鼠运动协调能力、探索能力受到一定的影响。

应用16S rDNA克隆文库法分析B6-Co小鼠角膜炎细菌组成

目的鉴定B6-Co突变系小鼠角膜的病原菌组成,并与人类细菌性角膜炎病原菌组成进行比较分析。方法选取10 d龄B6小鼠和B6-Co小鼠各6只为实验动物,提取小鼠角膜组织刮取物细菌基因组DNA,通过PCR扩增构建16S rDNA克隆文库,采用随机测序法分析B6-Co小鼠角膜细菌组成,B6小鼠作为对照。结果 B6-Co角膜混浊小鼠中共鉴定出20种细菌,隶属于15个属,包括葡萄球菌属、假单胞菌属、链球菌属、微球菌属、棒状杆菌属等。葡萄球菌属和假单胞菌属为优势群,葡萄球菌属丰度为19.7%~53.1%,假单胞菌属的丰度为17.4%~32.8%。其中葡萄球菌属主要是表皮葡萄球菌,丰度为13.8%~20.9%;缓慢葡萄球菌,丰度为14.0%~30.9%;金黄色葡萄球菌,丰度为7.4%~20.3%。此外,棒状杆菌和微球菌也比较常见。10 d龄B6小鼠未检测出细菌。结论 B6-Co突变系小鼠角膜细菌组成与人类角膜炎病原菌相似,是研究人类角膜炎诊断方法、发病机理及临床用药的很好的动物模型。

B6-Co与B6小鼠眼睑胚胎发育的形态观察

目的:探讨遗传性角膜混浊突变系小鼠(B6-Co)胚胎期眼睑发育形态学差异。方法:将B6-Co小鼠与B6小鼠对照,取胚胎期16.5天(E16.5)的胚胎,切取整个头部固定、脱水,冷冻切片。采用HE染色观察胚胎期眼睑闭合状况;FITC-鬼笔环肽染色眼睑部位的细胞骨架;Hoechst染色眼睑部位细胞核。结果:B6小鼠在E16.5天眼睑完成闭合,而B6-Co小鼠眼睑不能闭合,眼睑细胞骨架异常,无微丝束形成,不利于细胞迁移。结论:B6-Co小鼠由于眼睑边缘部位细胞迁移障碍引起的眼睑发育缺陷,造成出生时眼睑开放。

不同胚期B6-Co小鼠眼睑组织中血清反应因子的表达变化

背景 C57BL/6角膜混浊表型的突变系（B6-Co）小鼠具有出生眼睑闭合不全（EOB）表型,是研究眼睑发育机制的良好动物模型.探讨血清反应因子（SRF）与B6-Co小鼠EOB表型形成的关系可为人类先天性眼睑发育缺陷产生机制的研究提供理论依据.目的 检测SRF在B6-Co小鼠胚胎眼睑发育关键时期的表达.方法 采用肌内注射戊巴比妥钠安乐死术,分别剖取B6-Co母鼠以及表型正常B6母鼠体内胚胎期（E）16.5 d、E17.5 d和E18.5 d小鼠各9只,分离眼睑组织,分别采用实时定量PCR法和Western blot法检测小鼠眼睑组织中SRF mRNA及其蛋白的相对表达水平.取各胎龄的B6-Co小鼠和B6小鼠制作组织冰冻切片,利用免疫荧光技术检测并比较2种小鼠SRF在眼睑组织中的定位和表达强度.结果 B6-Co小鼠E16.5 d和E17.5 d眼睑组织中SRF mRNA的相对表达水平分别为0.41±0.06和0.24±0.17,明显低于B6小鼠的1.03±0.17和1.01±0.09,差异均有统计学意义（P=0.025、0.017）;B6-Co小鼠E16.5 d和E17.5 d眼睑组织中SRF蛋白的表达水平分别为0.08±0.01和0.08±0.01,明显低于B6小鼠的0.12±0.03和0.13 ±0.02,差异均有统计学意义（P=0.036、0.024）;而2种小鼠间E18.5 d时眼睑组织中SRF mRNA及其蛋白的表达量差异均无统计学意义（P=0.387、0.774）.免疫荧光染色显示,SRF蛋白多表达于B6-Co小鼠和B6小鼠眼睑组织的角质层细胞,但B6-Co小鼠眼睑角质形成细胞中SRF蛋白表达的荧光强度明显弱于B6小鼠.结论 SRF在B6-Co小鼠眼睑组织中的表达量明显下调,SRF可能参与眼睑发育缺陷的发生过程.