外科综合实验室开放运行下面临的问题及解决途径

本院外科综合实验室成立于2009年8月,旨在为临床相关科室的研究生及临床医生提供较好的科研平台。自成立以来,利用该科研平台从事科研的人员逐步增多,目前已达到近40人,并有持续增多的趋势。面对日益增多的科研人员进入该平台,存在的问题也日益突出,如何较好的发挥该平台的功能,完善管理,已然呈现面前。本文将就实验室在开放运行下所面临的问题进行简单介绍,并针对所存在的问题提出一些切实有效的解决办法。

Src抑制的蛋白激酶C底物在实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓中的表达及其意义

目的研究Src抑制的蛋白激酶C底物(Src-suppressed C kinase substrate,SSeCKS)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)进程中的表达情况,探讨其在EAE病理过程中可能的功能及意义,为多发性硬化(multiple sclerosis,MS)和EAE提供新的治疗靶点。方法构建EAE大鼠模型,进行临床打分评估;用HE染色检测EAE大鼠脊髓组织的炎性浸润情况;用western blot检测SSeCKS的表达变化;用免疫组织化学观察SSeCKS在脊髓组织中的分布。结果髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)诱导单相的EAE过程:Lewis大鼠经MBP免疫后7～10d开始有临床症状,13～16d达到发病高峰,之后自发地恢复,至30d左右恢复到病前水平;EAE病程高峰期,大鼠脊髓炎性浸润情况显著;SSeCKS蛋白表达在EAE起始E1期显著增加,E3期达到高峰,之后开始下降,恢复期基本恢复到正常水平。结论本实验成功构建了Lewis大鼠的EAE模型;EAE病理过程中,SSeCKS蛋白表达水平发生变化,提示SSeCKS可能参与了EAE过程。

以问题为基础教学法培养神经外科研究生临床思维能力思考

培养正确临床思维的能力是神经外科研究生临床教学的关键,但如何更好的开展这方面教学工作存在一定难度。PBL是一种"基于问题学习"的教学模式,以学生作为教学主体,通过在教学中提出问题、研究探索、讨论归纳并得出结果这一过程实现教学目标。PBL教学模式具有充分发挥学生的主观能动性,激发学生学习兴趣,提高学习效率的特点。针对神经外科研究生临床思维培养教学的特点,我们在神经外科研究生教学中对PBL教学方式进行了尝试,取得了良好的教学效果。

MicroRNAs 作为结直肠癌潜在标记物的研究进展

微小 RNA（miRNAs）是一种非编码的内源性 RNA 分子，miRNAs 的异常表达与疾病，尤其与恶性肿瘤的发生、发展存在密切的关系。研究证明，miRNAs 可以作为结直肠癌（colorectal cancer，CRC）早期诊断、治疗、预后的新的分子生物学标志物，同时，miRNAs 可作为体内 CRC 治疗的靶点。该文旨在对与 CRC 相关的 miRNAs 的表达、功能、作用机制、靶基因等及其在临床应用前景等方面作一综述。

游离DNA检测对结直肠癌诊断价值的研究

目的探讨游离DNA(cell-free DNA,CFD)检测在结直肠癌(CRC)诊断中的价值。方法用分支DNA技术检测CRC、结肠息肉患者和健康人对照组血清中的CFD含量,同时检测血清CEA和CA19-9含量,结合临床资料进行统计分析。结果与健康人对照组血清CFD水平[M(P25,P75)]的[181.9(109.5,328.7)ng/mL]和结肠息肉组的[178.2(85.5,377.5)ng/mL]相比,CRC患者为1 245.4(578.2,1 798.3)ng/mL,差异有统计学意义(U=416.00,282.00,P<0.05);CRC患者血清CEA和CA19-9水平显著高于结肠息肉组和健康人对照组(P均<0.05);不同年龄、性别、肿瘤部位和TNM分期的CRC患者CFD水平无统计学差异(P>0.05);CRC患者血清CFD水平与CEA(r=0.190,P>0.05)和CA19-9(r=0.046,P>0.05)均无相关性;CRC患者血清CFD的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.926,cut off值为768.9 ng/mL时,诊断CRC敏感性为70.5%,特异性为98.9%。结论血清CFD可作为CRC辅助诊断的分子标志物。

循环游离DNA完整性检测的临床应用研究进展

循环游离DNA(ccfDNA)是一种新的肿瘤标志物。现普遍认为细胞凋亡产生DNA短片段,长度为185～200 bp;而肿瘤细胞坏死产生的DNA片段,由于不完全消化而呈现长度多样化,以长链DNA片段为主。ccfDNA完整性检测广泛应用于多种肿瘤。DNA完整性一般以DNA长、短片段扩增产物的浓度比值来表示,其对肿瘤早期诊断、肿瘤分期、分级、放疗和化疗疗效监测等有重要意义。本文就ccfDNA完整性检的检测方法及其临床应用作一综述。

SSeCKS调节激活的星形胶质细胞炎症因子TNF-α和NO的释放

目的:星形胶质细胞是CNS中主要的胶质细胞类型,维持着CNS内环境的稳态。慢性激活的星形胶质细胞被认为参与了包括MS在内的神经免疫学疾病。SSeCKS在EAE病程中表达显著上调,并且主要表达于神经元和胶质细胞中,参与EAE炎症的调节。本实验探讨SSeCKS对星形胶质细胞炎症因子释放的影响,为MS和EAE的治疗寻找新的靶点。方法:本实验通过培养原代星形胶质细胞,脂质体介导SSeCKS基因沉默,并采用ELISA检测星形胶质细胞中肿瘤坏死因子-α以及一氧化氮的分泌情况。结果:原代培养的星形胶质细胞纯度达到了95%以上,SSeCKS干扰后星形胶质细胞炎症因子分泌显著降低。结论:SSeCKS参与星形胶质细胞炎症因子的分泌,可能为MS和EAE治疗提供新的思路。

游离DNA完整性检测对良恶性胸腹腔积液鉴别诊断的价值研究

目的探讨游离DNA(cfDNA)的完整性(ALU247/ALU115)检测对良恶性胸腹腔积液鉴别诊断价值。方法采用实时荧光定量PCR方法,测定86份良恶性胸腹腔积液标本中ALU115和ALU247片段浓度并计算完整性;同时对标本中LDH、AFP、CEA、SF、SCC等传统指标进行检测。绘制受试者工作曲线(ROC曲线),根据曲线下面积评估各标记物诊断意义;运用统计学方法,与传统指标进行对比,评价cf DNA完整性在良恶性胸腹腔积液鉴别诊断中的应用价值。结果恶性组DNA完整性指数(ALU247/ALU115)显著高于良性组,差异具有统计学意义(P<0.01),ROC曲线下面积为0.70。cfDNA浓度和完整性联合检测的灵敏度、特异度及准确度均显著高于其他各项指标单独或联合检测。该联合检测方式与cfDNA联合传统指标在鉴别诊断良恶性胸腹腔积液方面比较差异无统计学意义。结论 cfDNA完整性检测是良恶性胸腹腔积液鉴别诊断可能的良好靶标。ALU115、ALU247片段浓度和完整性(ALU247/ALU115)三项联合检测诊断价值更高。

Oct4和Nanog在胰腺癌干细胞中表达的研究

目的:研究Oct4和Nanog基因在人胰腺癌细胞系及干细胞中的表达情况。方法:用流式细胞仪,以CD44+CD24+和CD44+CD24+ESA+为表面标记,在胰腺癌Panc-1细胞中分选肿瘤干细胞,RT-PCR、定量PCR及免疫荧光法检测肿瘤干细胞中Oct4、Nanog基因的表达情况。结果:分选出的胰腺癌CD44+CD24+细胞约占细胞总量的1%～3%,CD44+CD24+ESA+约占细胞总量的0.1%～0.8%,Oct4及Nanog基因在两种分选出的细胞中表达均高于未分选细胞,在CD44+CD24+ESA+细胞中的表达高于CD44+CD24+细胞。结论:干细胞相关基因Oct4、Nanog高表达于胰腺癌干细胞中,其表达量与干细胞纯度成正相关。

胃癌患者血清miR-486的表达水平及其意义

目的：探讨胃癌患者血清mi R-486的表达水平及其辅助诊断的价值。方法：收集经病理确诊的100例胃癌患者、30例胃息肉患者及50例健康对照者的血清标本。采用荧光定量PCR方法定量检测血清mi R-486的表达水平,用化学发光法检测CEA、CAl99、CA724的含量。采用Mann-Whitney U检验比较不同组间血清mi R-486水平的差异,采用χ2检验分析胃癌患者血清mi R-486水平与其临床病理特征之间的关系。采用Spearman相关性分析胃癌患者血清mi R-486水平与CEA、CA199及CA724的关系,应用ROC曲线及AUC（95%CI）评估它们作为诊断指标的诊断效能。结果：胃癌、胃息肉患者和健康对照者血清mi R-486的含量分别为0.454（0.225,0.653）、0.121（0.083,0.166）和0.063（0.013,0.119）;胃癌患者血清mi R-486的含量显著高于胃息肉患者和健康对照者,差异均具有统计学意义（P均〈0.001）;而胃息肉患者与健康对照者血清mi R-486的含量差异无统计学意义（P〉0.05）。胃癌患者血清mi R-486的表达水平在不同年龄、性别、胃癌部位无统计学差异（P〉0.05）,在分化程度（P=0.046）、TNM分期（P=0.013）、淋巴结是否转移（P=0.006）差异均有统计学意义。胃癌患者血清mi R-486含量与CEA（r=0.213,P=0.034）、CA724（r=0.297,P=0.003）有相关性,与CA199（r=0.037,P=0.714）无相关性。胃癌组与健康对照组比较,血清mi R-486的AUC 0.839,95%CI为0.774~0.904。结论：胃癌患者血清mi R-486含量显著高于胃息肉患者和健康对照者,mi R-486可能是胃癌辅助诊断的一个重要生物学指标。

宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p的表达及其意义

目的探讨宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p的表达水平及其对宫颈癌的辅助诊断价值。方法收集55例宫颈癌患者、32例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者、39例子宫肌瘤患者及47例健康对照者血清样本,分别测定hsa-miR-200a-3p的表达水平及糖链抗原125(CA125)和人鳞状细胞癌相关抗原(SCCAg)水平。分析血清hsa-miR-200a-3p的表达水平与临床病理特征、CA125和SCCAg之间的关系。用受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价3项指标单独及联合检测对宫颈癌的辅助诊断价值。结果宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量均高于子宫肌瘤患者和健康对照者,差异有统计学意义(P<0.001)。CIN患者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量均高于子宫肌瘤患者和健康对照者,差异有统计学意义(P<0.05)。子宫肌瘤患者和健康对照者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p的表达水平在年龄大小、是否绝经、肿瘤最大直径、FIGO分期间差异均无统计学意义(P>0.05),宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p相对表达量与CA125(r2=0.012,P=0.421)、SCCAg(r2=0.004,P=0.647)无相关性。ROC曲线分析血清has-miR-200a-3p检测对宫颈癌患者的辅助诊断价值,宫颈癌区分于子宫肌瘤时,ROC曲线下面积(AUC)为0.753;宫颈癌患者区分于健康对照者时,AUC为0.771。结论宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p相对表达量高于子宫肌瘤组和健康对照组,有可能成为宫颈癌辅助诊断的重要生物学指标。血清hsa-miR-200a-3p的表达水平或可用于CIN的辅助诊断。

人胃癌细胞株CDX2基因表达与其启动子区甲基化的关系

目的:探讨人胃癌细胞株CDX2基因表达与其启动子区甲基化的关系。方法:不同浓度5-aza-CdR处理MKN45细胞株,甲基化特异性PCR(MSP)检测用药前后CDX2启动子甲基化状态;实时荧光定量RT-PCR和WesternBlot分别检测CDX2和DNMT1 mRNA和蛋白表达。结果:MKN45细胞株CDX2基因启动子区域高甲基化,CDX2 mRNA表达极低,蛋白不表达;经3种浓度5-aza-CdR处理MKN45细胞72 h后,细胞中CDX2 mRNA和蛋白表达均出现上调,而DNMT1表达出现下调。结论:CDX2基因表达下调与其启动子CpG岛高甲基化有关,DNMT1可能参与该过程的调节。

B淋巴细胞刺激因子及其受体与多发性骨髓瘤

B淋巴细胞刺激因子(BAFF)属于肿瘤坏死因子家族的成员,通过与3个受体(TACI、BCMA、BAFF-R)结合,发挥生物学功能,参与B、T淋巴细胞增殖和功能的调节;BAFF过度表达与受体结合后,可促使B淋巴细胞不断增殖并分泌自身抗体,从而导致一系列自身免疫性疾病的发生;BAFF过度表达,也会使淋巴细胞增殖失控,导致B细胞恶性肿瘤的发生。多发性骨髓瘤是骨髓内浆细胞异常增生的1种B细胞恶性肿瘤,恶性B细胞自分泌产生BAFF,在MM发病过程中起重要作用。

miR-34a调控Survivin表达对膀胱癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨miR-34a调控生存素(Survivin)表达对人膀胱移行细胞癌T24细胞生物学行为的影响。方法:以实时定量逆转录PCR技术(qRT-PCR)和Western Blot免疫印迹技术分别检测人膀胱移行细胞癌T24细胞在转染miR-34a模拟物前后miR-34a和Survivin蛋白的相对表达量。同时以四甲基偶氮唑盐比色法(methyl-thiazol-tetrazolium,MTT)实验、划痕实验和Transwell实验分析转染后T24细胞生长、迁移及侵袭能力的改变。结果:与正常人膀胱上皮细胞SV-HUC-1细胞相比,T24细胞miR-34a丰度明显降低而Survivin蛋白表达明显上调(P<0.05)。在稳定转染miR-34a模拟物后,随着T24细胞中miR-34a表达丰度上升,Survivin蛋白的表达明显受抑(P<0.05)。而转染miR-34a模拟物后的T24细胞与转染前相比,其细胞增殖率、迁移和侵袭能力也显著降低(P<0.05)。结论:miRNA-34a可以通过抑制其靶基因Survivin影响人膀胱移行细胞癌T24细胞的多种生物学,是膀胱癌潜在的治疗靶点。

两种游离DNA检测方法的比较研究

目的:对比评价人血清游离DNA的分支DNA(b DNA)检测和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-q PCR)检测方法。方法:收集44例人血清标本,分别运用b DNA技术和荧光定量PCR检测其游离DNA浓度,对2种方法检测结果做分析比较。同时采用b DNA技术分别检测其中10例血清和血浆游离DNA含量。结果:b DNA技术的检测结果和荧光定量PCR具有较高的相关性(r=0.7077,P<0.0001);血清较血浆具有较高的游离DNA的水平。结论:b DNA操作简便且结果可信,适用于人群大规模筛查游离DNA水平。

抑制热休克蛋白gp96对HepG2细胞中hTERT表达及细胞增殖的影响

目的:探讨热休克蛋白90抑制剂戈尔德霉素(geldanamycin,GA)对HepG2细胞中gp96、人端粒酶逆转录酶(hTERT)表达的影响及对HepG2细胞增殖的抑制作用。方法:以Western blot方法检测不同浓度GA作用下,HepG2细胞中HSP90α、gp96及hTERT的表达。用MTT法检测GA作用下HepG2细胞的增殖抑制情况。同时构建HSP90αsiRNA质粒,转染HepG2细胞后观察对hTERT的影响。结果:HepG2细胞中HSP90α、gp96及hTERT的表达均明显高于正常肝细胞LO-2,导入HSP90αsiRNA质粒的HepG2细胞HSP90α表达减少,但gp96、hTERT的表达与对照组HepG2比较差异无统计学意义。加入GA后HepG2细胞中HSP90α、gp96及hTERT表达均显著减少,HepG2细胞增殖也明显受抑。结论:GA可通过gp96抑制HepG2细胞中hTERT表达及HepG2细胞增殖,gp96有望成为肝癌分子治疗新的靶点。

红景天苷类似物合成及微孔板定量法评估其抗氧化能力

目的:合成红景天苷类似物,并初步分析评价其抗氧化能力。方法:以O-乙酰基溴代葡萄糖、O-乙酰基溴代半乳糖为糖基供体,芳环不同取代的苯甲醇、苯乙醇为糖基配体通过Koenigs-Knorr法制备红景天苷类似物,并采用微孔板定量法分析测定其对2,2-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH.)的清除能力。结果:合成了10个类似物糖苷,确定了其在清除DPPH.反应达到50%时的IC50(μmol/L)。结论:所合成类似物3-(3,4,5-三羟基苯基)丙基-β-D-葡萄糖苷和3-(3,4,5-三羟基苯基)丙基-β-D-半乳糖苷具有较好的抗氧化能力,其IC50分别为36.7μmol/L和39.7μmol/L,优于阳性对照维生素CIC50(54.6μmol/L)。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷诱导CDX2基因表达对人胃癌细胞株MKN45增殖和凋亡的影响

背景:DNA甲基化导致基因表达沉默是胃癌发生的重要步骤。近年发现肠表型调节因子CDX2在胃癌中具有抑癌基因的作用。目的:探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-CdR)对人胃癌细胞株MKN45中CDX2基因表达的影响及其对细胞增殖和凋亡的作用。方法:以不同浓度5-aza-CdR(2.5、5、10 Iμmol/L)处理胃癌细胞株MKN45,甲基化特异性PCR(MSP)检测CDX2启动子区甲基化状态;实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测CDX2 mRNA和蛋白表达:CCK8法检测MKN45细胞增殖活性,Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡和Hoechst 33258染色观察其凋亡形态:比色法检测caspase-3活性。结果:MKN45细胞中CDX2基因启动子区高甲基化,CDX2 mRNA表达极低且蛋白不表达:经3种浓度5-aza-CdR处理72 h后,MKN45细胞CDX2基因启动子区高甲基化发生逆转,CDX2 mRNA和蛋白表达均上调。与对照组相比,5-aza-CdR呈剂量依赖性地抑制MKN45细胞增殖和促进凋亡(P<0.05);Hoechst 33258染色示细胞核致密浓染、细胞核碎裂;caspase-3活性随着5-aza-CdR浓度的增加而升高(P<0.05)。结论:MKN45细胞中CDX2基因表达缺失可能与其启动子区CpG岛高甲基化有关;5-aza-CdR能有效逆转CDX2基因的异常甲基化,诱导其再表达.并抑制MKN45细胞增殖和促进凋亡,该作用可能与caspase-3活性有关。

NF-κB抑制剂和IFN-γ对BAFF-R基因启动子活性的影响

目的:探讨IFN-γ和NF-κB抑制剂对人BAFF-R基因启动子活性的影响。方法:以人全血基因组DNA为模板,PCR方法扩增得到BAFF-R基因转录起始点上游5’端-1562^+261 bp的片段,与荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic连接构建8个序列缺失质粒。将重组质粒瞬时转染人多发性骨髓瘤细胞株KM3,通过检测荧光素酶的相对活性,确定启动子活性最强的区域;分别用NF-κB抑制剂(BAY11-7082)和IFN-γ对活性最强的启动子进行干预,测定并比较荧光素酶的相对活性;同时RT-PCR检测干预前后BAFF-R基因mRNA的表达水平。结果:IFN-γ对BAFF-R基因启动子活性有促进作用并且可以上调BAFF-R mRNA的表达,NF-κB抑制剂(BAY11-7082)对BAFF-R基因启动子活性有抑制作用并且可以下调BAFF-R mRNA的表达。结论:IFN-γ和NF-κB信号通路参与了BAFF-R基因的转录调控,为进一步研究BAFF-R的调节机制提供了基本的依据。

鸟苷酸环化酶C基因沉默对人胃癌裸鼠皮下种植瘤的影响

目的:探讨鸟苷酸环化酶C(GC-C)基因沉默对人胃癌裸鼠皮下种植瘤的影响及其机制.方法:将SGC-7901细胞(SGC-7901组)、空质粒转染的细胞(PRNA组)、GC-C基因稳定沉默的细胞(GC-C-shRNA组)悬液先在裸鼠皮下接种成瘤,再取瘤组织块分别接种到裸鼠皮下,建立3种胃癌裸鼠皮下种植瘤模型.观察裸鼠一般情况、肿瘤的成瘤率、生长速度,描绘肿瘤的生长曲线,计算肿瘤的抑瘤率;采用实时荧光定量PCR(RFQ-PCR),Western blot和免疫组织化学法检测GC-C和趋化因子受体4(CXCR4)在各组移植瘤组织中的表达.结果:与SGC-7901组和PRNA组比较,GC-C-shRNA组裸鼠移植瘤生长速度明显减慢、体积明显变小(抑制率分别为33.7%、33.2%),肿瘤异型性、坏死程度明显降低,差异具有统计学意义(均P<0.05),且移植瘤组织中GC-C和CXCR4 mRNA和蛋白均明显下调(GC-CmRNA:7.47±1.70 vs 11.18±0.60,11.28±0.85;GC-C蛋白:0.52±0.15 vs 1.04±0.19,1.03±0.24;CXCR4蛋白:0.67±0.13 vs 1.02±0.21,1.03±0.23,均P<0.05).结论:GC-C基因稳定沉默在体内能保持稳定,且能抑制裸鼠移植瘤生长,该过程可能与CXCR4下调有关.