Sema4D介导的IRS-1信号通路在抑制成骨细胞分化中的作用机制研究

目的通过siRNA干扰技术沉默轴突导向因子4D(Sema4D)基因,探讨Sema4D基因对成骨细胞分化的影响。方法采用RT-PCR、细胞免疫荧光法和Western blot测定Sema4D基因表达情况,分析沉默效率;采用ALP染色、VonKossa染色及ALP活性观测成骨细胞分化。结果 siRNA干扰技术下调了Sema4D的表达,成功构建了Sema4D基因沉默体系;Sema4DsiRNA中成骨细胞的分化明显增强,出现了一定程度的钙化。结论沉默Sema4D基因与成骨细胞的分化有关。

亲水改性聚乳酸基可降解骨支架的制备及性能研究

目的利用3-氨基-1.2-丙二醇对聚乳酸进行亲水改性,制备具有多孔形貌的亲水性仿生骨组织工程支架.方法利用氨解反应对聚乳酸进行亲水改性,利用热致相分离法结合冷冻干燥法制备亲水性多孔骨组织工程支架,研究不同凝胶化时间对多孔支架的微观形貌及亲水性能的影响.结果SEM图显示支架呈多孔状结构,支架的亲水性能增强.结论本研究开发的亲水性聚乳酸基多孔海绵状结构的骨组织工程支架适合于细胞生长,有利于细胞黏附,更有利于骨组织修复,有望应用于临床.

乙醇胺改性聚己内酯制备亲水性组织工程支架的研究

目的探讨聚己内酯材料亲水性能增强的改性方法及工艺条件,制备有利于细胞黏附的亲水性组织工程支架。方法通过碱性乙醇胺与聚己内酯间发生氨解反应形成酰胺键,在聚己内酯表面接枝亲水性的氨基和羟基,改善其亲水性能。在-80℃凝胶化相分离制备类细胞外基质的纳米纤维组织工程支架。结果扫描电子显微镜(SEM)图显示支架呈多孔状结构,支架的亲水性能增强。结论当凝胶化为-80℃时,类似于细胞外基质的纳米纤维状组织工程支架形成,支架孔隙率均大于80%,改性剂浓度增大支架的亲水性增强。

Sema4D基因沉默对骨髓间充质干细胞成骨及成脂肪分化相关基因表达的影响

为了探讨Sema4D基因对绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成骨及成脂肪分化能力的影响,设计3条Sema4D基因的siRNAs,分别通过显微观察和蛋白质免疫印迹(Western blot)鉴定其对BMMSCs生长形态以及对Sema4D蛋白表达的影响.进一步利用实时荧光定量PCR(real-time PCR)和Western blot检测Sema4D基因沉默对成骨指标抗碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)和成脂肪分化指标脂蛋白酶(LPL)、脂肪细胞结合蛋白2(AP-2)、瘦素(Leptin)表达的影响以及对骨保护素和可溶性细胞核因子-κB受体活化因子及配基(OPG/RANKL/RANK)系统的影响.结果显示Sema4D基因沉默后,绝经后骨质疏松患者BMMSCs中ALP、BGP、CollagenⅠ的表达水平明显升高,LPL、AP-2、Leptin的表达水平也明显升高;OPG的表达水平明显升高,而RANKL和RANK的表达水平明显下降.由上述结果可知,Sema4D基因可以抑制BMMSCs成骨分化和成脂肪分化相关基因的表达,可能通过下调OPG/RANKL/RANK系统相关基因的表达来实现.

白花蛇舌草中多糖抑制骨肉瘤的作用机制

为探讨白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)活性成分对骨肉瘤的作用及其机制,对白花蛇舌草中分别提取的黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类化合物,用噻唑蓝(MTT)法检测不同提取物对MG-63细胞活性的影响;同时建立裸鼠骨肉瘤移植瘤模型,观察不同提取物对移植瘤生长的抑制作用;并通过流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化,蛋白质免疫印记(Western blot)检测Bax及Bcl-2蛋白表达水平.结果显示:4种提取物都对MG-63细胞的增殖具有明显抑制作用,并呈现明显的剂量依赖性,最优药物质量浓度为80μg/mL;在此质量浓度下4种提取物对裸鼠移植骨肉瘤均具有抑制作用,其中多糖类对MG-63细胞活性和移植瘤生长的抑制作用最强,明显促进MG-63细胞凋亡,阻滞细胞周期;Bax表达量在48h内随着白花蛇舌草多糖类提取物作用时间延长而增加,而Bcl-2表达量则降低.由上述结果可知,白花蛇舌草活性成分中多糖类的抗肿瘤活性最强,其作用机制可能是通过抑制骨肉瘤细胞增殖、促进细胞凋亡和阻滞细胞周期来达到抑瘤效果.

基于ACE2和适配体CoV2-RBD-1C构建的比色传感方法用于新型冠状病毒S蛋白的检测

目的基于血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)和适配体CoV2-RBD-1C,结合DNA自组装技术,构建了一种简单、廉价和灵敏的比色传感方法,用于新型冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)的检测。方法通过ACE2特异性捕获新型冠状病毒S蛋白,再利用适配体CoV2-RBD-1C将固定探针T固定于S蛋白上,接着,探针T启动X1、X2和L探针的交联聚合形成具有大量DNA双链的DNA纳米枝。最后,利用DNA纳米枝嵌插大量的SYBR Green I(SG)作为信号分子,催化氧化显色底物四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine,TMB),实现S蛋白可视化检测。结果成功构建了一种基于ACE2和适配体CoV2-RBD-1C的可视化比色传感方法,其吸光度与S蛋白浓度在5~100ng/mL范围内成正比,检测限(S/N=3)为4.3053ng/mL,具有较高的灵敏度和选择性,已成功用于商业化新型冠状假病毒S蛋白的检测。结论成功构建的可视化比色传感方法,具有廉价、简单、灵敏、便携化、微型化等优点,有望用于新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病人的大规模筛查和新冠环境监测。

基于DNA纳米枝构建可视化比色传感器用于骨肉瘤相关miRNA检测

目的通过DNA纳米枝和DNA双链-SYBR Green I (SG)复合物构建可视化比色传感器,并将其应用于骨肉瘤标志物miR-135b-5p的检测。方法通过目标miR-135b-5p启动X探针聚合生成DNA纳米枝,接着,通过SG嵌入DNA纳米枝形成大量DNA双链-SG复合物催化氧化显色底物构建可视化比色传感器。结果成功构建了一种基于DNA纳米枝的可视化比色传感器,其吸光度与miR-135b-5p浓度的对数值在50pM~1 M范围内成正比,检测限(S/N=3)为4.98pM,具有较高的灵敏度和选择性。已成功应用骨肉瘤细胞143B和小鼠胚胎成纤维细胞3T3细胞内miR-135b-5p的检测。结论基于DNA纳米枝成功构建一种可视化比色传感器,可能用于骨肉瘤患者的早期筛查和预后监测。

白花蛇舌草抗骨肉瘤的有效部位筛选及对Bcl-2和Bax细胞因子表达的影响

目的 考察白花蛇舌草提取物对骨肉瘤细胞生长及Bcl-2和Bax细胞因子的影响.方法 对白花蛇舌草进行不同部位的分离提取,提取物分为A、B、C、D4组,采用MTT法检测各组对MG63细胞活性的影响;同时用不同部位提取物喂养裸鼠(骨肉瘤胫骨原位移植瘤模型),采用RT-PCR和Western blot分别检测移植瘤细胞中Bcl-2和Bax因子mRNA和蛋白表达水平.结果 白花蛇舌草的多部分提取物均能显著抑制MG63骨肉瘤细胞的生长(P<0.05),促进肉瘤裸鼠模型瘤细胞中促凋亡蛋白Bax因子mRNA和蛋白的表达(P<0.05),抑制凋亡蛋白Bcl-2因子mRNA和蛋白的表达(P<0.05),其中C组的效果最明显,与其他组比较有显著改变(P<0.05),A、B、D组间无显著变化(P>0.05).结论 白花蛇舌草提取物具有抑制MG-63细胞成长,促进Bax因子、抑制Bcl-2因子表达的作用.

Noggin基因过表达重组腺病毒载体的构建及其对骨肿瘤细胞MG63迁移侵袭能力的影响

目的:研究Noggin基因对骨肿瘤细胞MG63中Noggin,BMP-2,血管内皮生长因子(VEGF)及结缔组织生长因子(CTGF)的表达及细胞迁移侵袭的影响,探讨Noggin基因在骨肿瘤的发生和发展过程中的作用机制。方法:通过构建Noggin基因过表达重组腺病毒载体,并将其转染到骨肿瘤细胞MG63中,采用RT-PCR和Western blot分别检测空白对照组、过表达重组腺病毒组中Noggin,BMP-2,VEGF和CTGF的mRNA水平和蛋白水平,Transwell细胞迁移和侵袭能力实验考察两组细胞的迁移和侵袭能力。结果:成功构建Noggin基因过表达重组腺病毒载体,将其转染到骨肿瘤细胞MG63后,Noggin的mRNA及蛋白表达水平显著升高,BMP-2,VEGF及CTGF的mRNA及蛋白表达水平显著降低,转染Noggin基因过表达重组腺病毒的骨肿瘤细胞MG63迁移和侵袭的能力明显下降。结论:过表达Noggin基因能成功抑制骨肿瘤细胞MG63的侵袭和转移,有望成为骨肿瘤基因治疗的新方法。