艾滋病疫苗国家工程实验室的设计与筹建

从实验室的基础设施建设、人才与团队建设及实验室运行机制、制度建设等方面介绍了吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室的设计与筹建过程、实验室建设的整体思路和设计原则,以及细胞实验室和疫苗研究平台等功能实验室的建设。该实验室建设过程中注意节约资金,合理利用现有资源,打造出一个既具有产学研结合特色,又适合高科技人才培养与发展的,结构科学、布局合理、具备良好科研氛围和动力的疫苗国家工程实验室。

国家工程实验室疫苗工程技术平台建设与管理

国家工程实验室主要任务是重点产业核心技术的攻关和关键工艺的实验研究以及研究产业技术标准、培养工程技术创新人才、促进重大科技成果应用等。良好的工程技术平台为实现上述任务提供了机制保障。通过对艾滋病疫苗国家工程实验室的工程技术平台建设思路与运行情况总结分析,从基础设施建设、技术平台与功能实验室的建设、关键技术创新与成果转化、管理运行机制等方面,阐述了国家工程实验室对疫苗工程技术平台建设与管理方面在关键核心技术攻关及在本领域促进协同创新方面的辐射和带动作用。

科研实验室对本科生的开放与管理

高校科研实验室担负着国家高素质人才培养的重任,是集人才培养、科学研究、社会服务于一体的平台,科研实验室面向本科生开放共享,有利于提高学生独立思考和动手能力,激发科研热情,对应用型、复合型以及技能型人才的培养具有重要的现实意义。结合艾滋病疫苗国家工程实验室对本科生开放与管理的实践经验,从开放思路与内容,开放管理制度与流程,以及实验室对本科生开放创新实验提供的资源保障,开放共享所取得的成果与收益等几个方面,探讨了科研实验室对本科生开放的必要性和意义,阐述了科研实验室对本科生开放与管理在高素质应用型人才培养以及实验室可持续发展中的重要作用。

小鼠脑切片漂浮染色方法研究

为了提高小鼠脑组织学研究效率,解决传统石蜡切片和冰冻切片样品准备时间长、步骤复杂等问题,提出了振动切片结合漂浮染色快速进行小鼠脑组织切片形态学研究的方法。该方法通过小鼠心脏灌注后,获取脑组织,利用琼脂糖快速包埋固定;通过振动切片方法,40微米厚度连续获取脑组织切片,结合漂浮染色观测特征区域神经元形态;最后通过体视学方法,快速统计估算神经元数量。实验结果表明,振动切片联合漂浮染色可快速进行小鼠脑组织学研究,并具有较高的稳定性和可重复性。

共同装载吴茱萸碱和Fe3O4纳米粒子的磁性药物载体的制备

以单甲醚-聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(mPEG-PLGA)作为载体,采用溶液透析的方法共同装载抗癌药物吴茱萸碱和Fe3O4磁性纳米粒子.通过透射电子显微镜、红外光谱、紫外-可见光谱及体外释放实验、普鲁士蓝染色、体外毒性实验和磁靶向研究,综合评价了磁性纳米药物载体的性能.结果表明,磁性药物载体胶束分散性良好,粒径均一,有较高的载药量和包封率,能够实现药物缓释,具有磁靶向特性.

一次性填充床式生物反应器JY-CPB10C系统组成、操作及应用

生物反应器能够有效的提高细胞的培养密度、降低生产成本,保证大规模生产的产品质量;是细胞大规模培养的关键设备。本文以吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室的一台型号为JY-CPB10C一次性填充床生物反应器为例,对其系统组成、基本操作、常见问题处理及功能应用进行阐述,以期使初学者可以更加快速的掌握使用该系统进行动物细胞大规模培养的基本实验技术。

Accuri C6的系统组成、日常维护及故障处理

流式细胞仪是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器,广泛应用于免疫学、分子生物学和临床检验等领域。本文以吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室的BD Accuri C6流式细胞仪为例,对其系统组成、日常维护及常见故障的处理进行阐述,以期使初学者可以更加快速的掌握使用该仪器。

CelliGen^TM310型生物反应器功能组成、故障处理及应用

使用生物反应器进行大规模动物细胞体外培养,已经成为生物技术产品研究和开发的关键工艺步骤,为细胞生长提供了一个适宜的环境,能够显著提高动物细胞的培养密度,使之快速增殖作为制备生物制品的基质,从而保证工业规模生产的产品质量。本文以型号为CelliGenTM310生物反应器为例,对其基本结构、主要功能、常见问题处理及实际应用进行阐述,以期对使用者有所帮助。

百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳黏附素抗体间接ELISA检测方法的建立、验证及初步应用

目的建立小鼠血清中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)及百日咳黏附素(pertussis adhesin,PRN)抗体间接ELISA定量检测方法,并进行验证及初步应用,为百日咳疫苗生产工艺的优化提供参考。方法分别用PT、FHA及PRN抗原包被酶标板,加入百日咳抗小鼠血清标准品及待测小鼠血清,以HRP标记的山羊抗鼠IgG作为酶标二抗,通过TMB显色的指示程度定量检测小鼠血清中PT、FHA、PRN抗体含量。对建立的间接ELISA检测方法进行专属性、线性范围、准确性、精密性进行验证。采用建立的方法对百日咳疫苗及效价合格的内部参比品免疫小鼠血清进行检测。结果采用PT、FHA、PRN抗体ELISA方法检测百日咳抗小鼠血清标准品及待测样品的结果为阳性,其余样本检测结果均为阴性。PT抗体ELISA检测方法的线性范围为0.0053~0.17 U/mL,回收率为90.91%~104.77%,重复性验证RSD为6.31%,人员间RSD为6.40%;FHA抗体ELISA检测方法的线性范围为0.0223~1.43 U/mL,回收率为95.84%~102.18%,重复性验证RSD为9.02%,人员间RSD为5.79%;PRN抗体ELISA检测方法的线性范围为0.0094~0.3 U/mL,回收率为86.27%~100.22%,重复性验证RSD为6.94%,人员间RSD为8.90%。采用建立的方法检测百日咳疫苗样品及效价合格的内部参比品免疫小鼠血清,6组样品PT抗体水平明显高于内部参比品,FHA、PRN抗体水平与内部参比品相当。结论建立的各抗体ELISA检测方法专属性强,线性相关性良好(R2>0.99),准确性高,精密性良好,可用于小鼠血清中百日咳(PT、FHA、PRN)抗体的定量检测,为百日咳疫苗生产工艺的优化提供了参考。

流感减毒活疫苗中 A 型流感病毒株生产用工作毒种遗传稳定性分析

目的：分析流感减毒活疫苗的生产用工作毒种A／17／California／2009／38（H1N1）、A／17／Perth／09／87（H3N2）的遗传稳定性。方法将流感减毒活疫苗生产用工作毒种接种鸡胚尿囊腔进行传代，扩增第2、3、5、10代毒株的全基因组进行测序分析，其中每个代次的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS测序结果分别与冷适应供体毒株进行比对分析，血凝素（ HA）和神经氨酸酶（ NA）基因的测序结果分别与世界卫生组织（ WHO）推荐的适用于北半球的2011—2012年流行毒株进行比对分析，从而判断疫苗生产用工作种子毒株的基因遗传稳定性。结果扩增至10代次后，H1N1疫苗毒株基因总突变率为0．035％，H3N2疫苗毒株基因总突变率为0．022％，突变位点均未发生在冷适应性（ ca）、温度敏感性（ ts）和减毒性（ att）表型的决定位点。结论生产用工作毒种具有良好的基因遗传稳定性，扩增至第10代次的疫苗毒株同原始种子代次的同源性大于99％，工作种子批毒种符合2010年版《中华人民共和国药典》的要求。

重组腺病毒疫苗插入基因表达产物鉴别方法的建立及验证

目的建立重组腺病毒疫苗插入基因表达产物的鉴别方法,并进行验证。方法采用Western blot法对重组腺病毒感染后的细胞上清液进行检测,鉴别插入基因表达产物是否表达。对方法的专属性和耐用性进行验证,并采用该方法鉴别3批重组腺病毒疫苗样品插入基因表达产物的活性。结果重组腺病毒疫苗插入基因表达产物能被黏蛋白1-生存素[mucin 1(MUC1)-Survivin]的两种抗体分别识别,在相对分子质量约37000处可见特异性条带,大小和组成与实际值相符,方法的专属性和耐用性均符合要求。3批重组腺病毒疫苗插入基因表达产物也均能被MUC1-Survivin的两种抗体分别识别,在相对分子质量约37000处可见特异性条带,而阴性对照不能被识别。结论采用Western blot法检测插入基因表达产物的活性,专属性和耐用性均较好,适用于重组腺病毒疫苗产品的鉴别试验,可为疫苗制备过程中的质量控制及产品检定提供参考。

重组人肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗外源DNA残留量检测方法的建立

目的建立重组人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗原液中昆虫细胞宿主DNA残留的地高辛探针杂交检测方法。方法抽提昆虫细胞sf9基因组DNA,经分子筛纯化后作为阳性对照品;分别以1 000~5 000 bp和100~1 000 bp的基因组DNA超声随机小片段为模板,制备地高辛探针,与阳性对照进行杂交试验。同时验证方法的检测范围、灵敏度和特异性,并采用该方法对3批重组EV71 VLPs疫苗原液中宿主DNA残留量进行测定。结果纯化后DNA样品浓度为47. 5 ng/μL,A260/A280值为1. 86,可作为阳性对照。以100~1 000 bp DNA超声随机小片段作为模板,探针标记效率更高,杂交显色更清晰。该法检测范围为10 pg^10 ng,灵敏度达1 pg,特异性强。3批重组EV71 VLPs疫苗原液中每人份剂量的宿主细胞DNA残留均<50 pg。结论本实验建立的方法特异性强,灵敏度高,可用于重组EV71 VLPs疫苗制备过程中的原液检定及质量控制。

IFNγ释放试验评价水痘减毒活疫苗的细胞免疫效果

目的应用IFNγ释放试验评价水痘减毒活疫苗的细胞免疫效果。方法利用IFNγELISA定量试剂盒检测不同灭活抗原(热灭活、紫外灭活、甲醛灭活)刺激、不同孵育时间(24、48、72 h)、不同个体(12人接种水痘减毒活疫苗前后)对IFNγ释放水平的影响。结果紫外灭活方式制备的刺激抗原及新鲜全血与刺激抗原共孵育48 h,IFNγ释放水平最高;12人接种疫苗后全血中IFNγ释放水平均有不同程度提高,接种前后几何平均值(GMT)分别为6.13和234.75 pg/ml,增长倍数和GMT值在个体间均存在较大差异。结论 IFNγ释放试验操作简便、快速,可定量,适用于水痘疫苗细胞免疫效果的评价。

阈值法检测人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量

目的建立人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量的阈值检测法,并进行验证。方法验证阈值法的线性范围、准确性及精密度。采用阈值法和DNA探针杂交法分别对3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量进行测定,并进行比较。结果DNA标准品浓度为3~200pg时,与检测信号(μV/s)呈良好的线性关系,直线回归方程为y=10.812x-36.761,R^2=0.9945;加入100和25pgDNA标准品的样品回收率为88%~110%,CV分别为7.7%和7.4%;精密度各次检测CV均<10%。阈值法检测3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量分别为181.9、104.2和64.6pg/mL,DNA探针杂交法检测结果分别为约250、约100和<100pg/mL,二者检测结果相符。结论阈值法有望应用于生物制品宿主细胞残留DNA含量的常规检测,且具有良好的准确性及精密度。

壳聚糖复合纳米基因载体的制备

目的制备壳聚糖复合纳米基因载体,并探讨其理化性质、细胞毒性、稳定性及体外转染效率。方法采用复凝聚法制备包封聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)/DNA复合物的壳聚糖复合纳米基因载体,用纳米粒度分析仪测定其粒径和Zeta电位;透射电镜观察其形态;MTT法检测其细胞毒性;在PBS溶液(pH 7.4)及含10%小牛血清的RPMI1640培养基中,于37℃条件下放置0、1、3、5 d,1%琼脂糖凝胶电泳检测其稳定性;体外转染CNE细胞,评价其转染活性。结果当N(PEI的氨基)/P(DNA的磷酸根)≥6时,能够形成稳定的壳聚糖复合纳米粒,平均粒径约为300 nm,表面电荷约为30 mV;壳聚糖复合纳米基因载体呈球形,圆整且分散性好;复合纳米基因载体的细胞毒性较低;1%琼脂糖凝胶电泳分析显示,DNA被完全包裹在复合纳米载体中,且5 d内无游离DNA释放;体外转染活性与壳聚糖/DNA复合物相比,提高了约1 000倍,且转染能力不受血清的干扰。结论制备的壳聚糖复合纳米基因载体是一种高效、低毒的非病毒载体,具有作为体内基因治疗载体的应用潜力。

抗肺炎链球菌溶血素蛋白单克隆抗体的制备及表征

肺炎是导致全球5岁以下儿童发病或死亡的常见疾病。目前市售疫苗均为多糖或多糖结合组分，难以对90多种肺炎链球菌进行广谱的覆盖，且随着疫苗的广泛应用，血清型替代现象也日趋严重。为解决这些问题，以肺炎链球菌蛋白作为疫苗组分的蛋白疫苗被寄予厚望。肺炎链球菌溶血素蛋白（ Ply）在所有肺炎链球菌株中均表达且高度保守，成为广谱肺炎蛋白疫苗的候选组分。前人研究表明，Ply在肺炎链球菌感染模型上，与野生型相比较，Ply的缺失与肺部损伤的降低、细菌菌落数的降低、肺部中性粒细胞的减少及延长生存时间等具有直接关联。天然结构的 Ply （Plywt）溶血活性极强，对细胞毒性很大，无法直接作为免疫原，本实验室制备了Plywt的减毒突变体Plym2。本研究利用Plym2研制了Ply的单克隆抗体，用于建立准确简便的检测Ply的方法。

HBcrAg的研究进展

乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病。患者血中的HBeAg、HBcAb以及血清HBV DNA等含量常用来反映病情的发展及预后。近年来,HBcrAg作为一种新的血清学标志在患者病情的发展评价中被寄予厚望。本文就HBcrAg分析方法的发展、在临床上诊断中的优势以及临床应用等方面作了概述。

人乳头瘤病毒6型L1蛋白的原核表达及免疫原性评价

目的确定原核表达系统中人类乳头瘤病毒6型(human papillomavirus 6,HPV6)L1蛋白的最佳表达条件,并对HPV6 L1 VLP免疫小鼠后产生的中和抗体水平进行评价。方法将密码子优化的HPV6 L1基因片段与原核表达载体pET30a(+)连接,构建重组表达质粒pET30a-6L1,在大肠埃希菌中表达HPV6 L1蛋白,并通过添加分子伴侣(TF、GroES-GroEL、DnaK-DnaJ-GrpE)筛选能够增加目的蛋白表达的最佳条件。将表达的HPV6 L1蛋白经密度梯度离心、阳离子交换层析后获得纯化蛋白,对其形态进行表征。将纯化的HPV6 L1 VLP免疫BALB/c小鼠,采用假病毒中和试验检测小鼠血清中和抗体水平。结果质粒pET30a-6L1经双酶切鉴定证明构建正确;添加TF分子伴侣时HPV6 L1蛋白表达量最高;HPV6 L1 VLP是呈均一的、直径45~65 nm的球状结构,与HPV6天然病毒颗粒的形态、大小相似;HPV6 L1 VLP初次免疫小鼠第8周,血清抗体水平达到峰值,为105以上。结论分子伴侣TF促进了HPV6 L1蛋白的可溶性表达,纯化后的目的蛋白免疫原性良好。本研究为后续各型别HPV L1蛋白表达工艺的探索提供了思路,也为下一步的中试扩大培养奠定了基础。

芽孢杆菌污染导致绝缘油油质劣化的试验研究

为解决杂菌污染导致绝缘油油质劣化的问题,对分离杂菌进行鉴定,考察培养条件及其对介质损耗、pH、微水含量和表面张力的影响,从而提出解决方法。采用唯一碳源培养基分离杂菌并借助生化试验、16sDNA技术鉴定种属。通过吸光度的变化探讨杂菌适宜生存温度并在此条件下对上述4种指标进行70 d的检测。结果表明:成功分离1种芽孢杆菌,在绝缘油中最适生长温度为37℃。该菌能够导致绝缘油介质损耗变大且导致油质环境酸化。绝缘材料的使用能够维持介质损耗在合格范围内,并一定程度抑制杂菌生长。绝缘油的表面张力变化与杂菌和绝缘材料不存在明显关系。芽孢杆菌可在绝缘油中存活且最适生长温度为37℃,并导致油质劣化。

乙肝病毒C基因及其编码蛋白研究概述

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的一种严重危害人类健康的传染病。HBV核心蛋白在病毒的装配、肝炎的发生、发展中起重要作用。本文就HBV核心蛋白的编码C基因、蛋白的结构功能及所引起的细胞免疫应答特点,特别是HBV核心相关抗原(HBV,HBcrAg)作为一种重要的血清学指标在临床上的应用以及BCP(basal core promoter)双突变在对乙肝病情的影响等作了概述。