髓样抑制细胞免疫抑制机理的研究

目的:研究荷瘤小鼠来源的髓样抑制细胞(Myeloid derived suppressor cell,MDSC)在肿瘤免疫抑制中的作用机理。方法:用Percoll分离法从荷瘤小鼠的脾脏和骨髓中分离Gr-1+CD11b+MDSC;用流式细胞术检测MDSC对T细胞增殖的抑制作用;分别用生化法和ELISA技术检测MDSC体外培养上清中抑制性因子NO、ROS和IL-10、TGF-β的含量。结果:MDSC在荷瘤小鼠的脾脏和骨髓中聚集增多,且其在骨髓中所占的比例显著高于脾脏;MDSC可以明显抑制脾脏细胞的增殖,体外培养6小时的MDSC可以分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β。结论:本实验进一步证实MDSC可以通过分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β抑制T细胞增殖。

表达HLA-G1的K562细胞抵抗外周血NK细胞杀伤作用的研究

目的研究 HL A- G1分子对 NK细胞杀伤活性的影响。方法借助脂质体介导的 DNA转染技术 ,将本室构建的真核表达质粒 pc DNA3 - HL A- G1转染人 K5 62细胞 ;通过 G4 18筛选 ,获得克隆化细胞株 K5 62 - G1;应用 RT- PCR及流式细胞术分别在 RNA水平和蛋白质水平检测 HL A- G1的表达 ;最后 ,应用 MTT比色法检测转染细胞对不同个体外周血 NK细胞杀伤活性的抑制效应。结果与转染了空质粒的对照组相比 ,外周血 NK细胞对 K5 62 - G1的杀伤率降低 3 2 .4 3 % ( P <0 .0 1)。结论靶细胞表达 HL A - G1分子可明显抑制 NK细胞的杀伤效应。

六种肿瘤细胞株BLM基因转录水平的研究

BLM基因的不同突变是导致Bloom综合征(Bloom'ssyndrome)的病因。BLM基因突变使姐妹染色单体互换率(sisterchromaticexchange,SCE)增高,细胞DNA修复功能降低,这样受损的DNA很容易随细胞分裂而传入子细胞,细胞稳定性下降。临床表现为免疫缺陷,恶性肿瘤易患体质等等。本研究对BLM基因在肿瘤细胞株和正常人中表达的差异进行研究,以期发现肿瘤新的发生机制,为寻找新的特异分子治疗靶点提供线索。应用PTPCR方法检测正常人造血细胞和六种肿瘤细胞株中BLM基因的mRNA水平,并作序列检测。结果表明,六种肿瘤细胞株均高表达BLMmRNA,但未见BLM基因结构异常,而正常人表达量很低(P<0.01)。结论:在本研究中的6种肿瘤细胞株高表达BLMmRNA,肿瘤细胞株和正常人BLMmRNA表达水平有显著差异性。BLM异常可能参与肿瘤的发生或是导致耐药的原因之一。

复方抗病毒制剂体外抗流感病毒和呼吸道合胞病毒作用及毒性研究

目的测定复方抗病毒制剂体外对流感病毒和呼吸道合胞病毒的抗病毒作用。方法用鸡红细胞血凝素滴定法测定不同浓度复方抗病毒制剂在狗肾传代细胞(MDCK)中对流感病毒的抑制作用;用中和实验测定复方抗病毒制剂在Hep-2细胞中对呼吸道合胞病毒的活性。结果复方抗病毒制剂浓度<1.5 mg.mL-1时对MDCK细胞及Hep-2细胞无明显毒性。浓度>0.15 mg.mL-1能抑制流感病毒的血凝活性和呼吸道合胞病毒对靶细胞的攻击作用。结论复方抗病毒制剂体外对流感病毒和呼吸道合胞病毒具有较强的抑制作用,且有较大的安全性。

慢性荨麻疹与HLA-DRB1、DQB1基因的相关性研究

目的:探讨中国湖北汉族慢性荨麻疹(CU)的发生与HLA-DRB1、DQB1等位基因间的关系。方法:应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术对已经确诊的湖北汉族CU42例和正常对照组193例进行HLA-DRB1、HLA-DQB1基因多态性分析。结果:患者组HLA-DRB112、0901等位基因频率较正常对照组显著增高(RR=3.11,χ2=7.579,P=0.006;RR=2.47,χ2=5.684,P=0.017),HLA-DQB105等位基因频率较正常对照组显著降低(RR=0.26,χ2=6.683,P=0.01)。结论:CU与HLA-DRB112、0901以及HLA-DQB105等位基因关联,前者是中国湖北汉族人CU的易感基因,而后者对CU有抵抗性。

CTLA4-Ig在树突状细胞中的表达及效应研究

目的 获得CTLA4-Ig转基因修饰的DC细胞,分析表达产物CTLA4-Ig对T细胞活化功能的影响。方法 采用脂质体转染方法将CTLA4-Ig表达载体转入DC细胞,通过ELISA法鉴定转染DC细胞48和72h培养上清液及稳定表达的培养上清液,分离Balb/c小鼠和C57BL/10J小鼠淋巴细胞为反应细胞和刺激细胞,观察CTLA4-Ig对同种细胞混合培养反应的影响。结果 将鼠CTLA4-Ig表达载体转入DC细胞,获得瞬时表达及稳定表达,CTLA4-Ig可抑制单向混合淋巴细胞反应,且效应亦呈剂量依赖性。结论 鼠CTLA4-Ig表达产物对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用,其抑制作用随表达载体转染细胞培养上清液的增加而增强。同时获得了稳定表达CTLA4-Ig融合蛋白的CTLA4-Ig转基因修饰的DC细胞,为以后的工作奠定了基础。

mfgl2凝血酶原酶反义载体的构建及其效应研究

目的:从基因转录水平抑制小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞表达m fgl2(mouse fibrinogen like prote in 2/m fgl2prothrom inase,以下简称m fgl2)和其效应研究。方法:构建m fgl2反义载体(m fgl2-antisense-pcDNA3.0)并转染Raw264.7细胞,在IFN-γ刺激下,分别用RT-PCR、免疫组化、蛋白质印迹分析和m fgl2蛋白功能学检测方法(Procoagu lant activity,PCA)检测m fgl2基因转录和蛋白表达水平及PCA的变化。结果:转染m fgl2-antisense-pcDNA3.0可显著抑制Raw264.7细胞m fgl2基因转录和蛋白表达并使其生物学活性显著下降,并且m fgl2表达水平与其PCA活性变化呈平行关系。结论:m fgl2-antisense-pcD-NA3.0可有效抑制Raw264.7细胞表达m fgl2,同时其PCA也显著下降,表明Raw264.7细胞PCA与其表达m fgl2有关,此结果为探讨从基因水平治疗与fgl2高表达相关的疾病如重型乙型肝炎、同种移植排斥反应时脏器局部的微血栓形成、纤维素沉积、微循环障碍等病理学损伤寻找新的干预靶点提供了科学依据和手段。

产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌噬菌体分离及其生物学特性观察

目的分离、筛选宽噬产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌噬菌体,观察其生物学特性。方法以30株产ESBLs大肠埃希菌为宿主菌,从医院污水中分离获得噬菌体,筛选出宽噬噬菌体,进行吸附实验、一步生长实验、噬菌体DNA初步酶切分析和电镜观察。结果所筛选出的宽噬噬菌体φ9882其宽噬率为36.7%,滴度为8.1×1018pfu/mL。5分钟吸附率约为98%,潜伏期约为30～40min,裂解量约为110。φ9882的DNA约为30kb。电镜显示,φ9882具有直径70nm微球形颗粒头部,棱角不明显,可见100nm尾轴。结论分离、筛选所获得的φ9882为宽噬噬菌体,其裂解性较强,裂解谱宽,吸收率高,潜伏期短,可进一步用于相应耐药菌感染的治疗研究。

GFP-TNF融合蛋白的制备及在亲和力研究中的运用

目的:在TNF的研究中寻找一种取代同位素标记的检测亲和力的方法。方法:表达及纯化GFP-TNF融合蛋白;鉴定GFP-TNF融合蛋白;用GFP-TNF与TNF做TNF受体的竞争结合分析。结果:GFP-TNF与TNF可竞争结合U937细胞表面的TNFR。结论:GFP-TNF有望取代125I-TNF在TNF的研究中作为检测亲和力的工具。

移植免疫相关的转化医学研究进展

器官（组织）移植是20世纪临床医学一项重大成就,已成为治疗多种终末期疾病的有效手段。本文简述移植免疫相关的转化医学研究进展。

近交系海南五指山猪SLA经典I类和II类分子序列分析

为筛选适合我国异种移植研究的猪种提供参考依据 ,采集近交系海南五指山猪种全血标本 6例 ,利用RT PCR扩增得到cDNA产物 ,纯化、克隆、测序得到SLA经典I类P1、P14座位和II类DQA、DQB、DRA、DRB座位基因序列共 6个。与Genbank中相关序列进行比较分析发现 :所得序列是SLAI类和II类基因的新等位基因。在中国非协调性猪 人异种移植中 ,海南五指山猪种在与人类MHC遗传基因水平相似性方面有一定优势 。

不同粒径纳米血竭和普通血竭对肿瘤细胞的体外效应

目的观察不同粒径血竭纳米颗粒在体外对宫颈癌细胞株Hela、肺癌细胞株A549、肝癌细胞株SMMC7721、卵巢癌细胞株A2780和粒细胞白血病细胞株HL-60的杀伤作用,并探讨其作用机制。方法以不同浓度和不同粒径纳米血竭分别加入培养的上述肿瘤细胞株中,流式细胞仪检测各种细胞的死亡率、凋亡率及其细胞周期,并与普通血竭比较。结果粒径为171,167和23.8 nm的纳米血竭在浓度3.9～31.2 mg.L-1范围对细胞株HL-60的杀伤百分率明显高于普通血竭,其主要作用机制不是诱导细胞凋亡,细胞周期测定表明血竭纳米颗粒主要将HL-60细胞阻滞在G0/G1期。纳米血竭对其他肿瘤细胞的作用与普通血竭差别不明显。结论粒径为171,167和23.8 nm的纳米血竭对肿瘤细胞株HL-60有明显的杀伤作用,其效率高于非纳米血竭。

抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)的构建和表达

目的 :构建抗CD71人 鼠嵌合抗体的真核细胞表达载体并在真核细胞中表达嵌合抗体。方法 :将鼠源性抗CD71单抗 (75 79)重、轻链可变区基因 (VH 和VL)分别克隆至含有人IgG轻、重链恒定区的表达载体pγ Expr和pκ Expr中 ;将嵌合表达载体 (Chi75 79 pγ Expr和Chi75 79 pκ Expr)经电转染技术共转染至真核细胞 (SP2 0 )中。结果 :经ELISA法检验阳性转染瘤细胞培养上清 ,证明其表达蛋白产物中同时具有人IgG重链恒定区 (Cγ)和轻链恒定区 (Cκ)蛋白 ;通过间接免疫荧光流式细胞术 (FCM)和间接免疫荧光显微技术 ,证明该表达产物能够特异性识别和结合表达于靶细胞表面的CD71分子。结论 :抗CD71人 鼠嵌合抗体 (D2C)在体外真核细胞表达成功。

DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中的作用

目的 :研究DR5在介导TRAIL凋亡信号中的作用。方法 :用含人DR5细胞外全长结构域重组DR5免疫BALB C小鼠 ,制备抗DR5单克隆抗体 ;流式细胞仪检测Jurkat细胞表面DR5表达水平 ;采用TRAIL凋亡检测试剂盒 ,检测Jurkat细胞凋亡率及抗DR5单克隆抗体对TRAIL诱导细胞凋亡的阻断率。结果 :DR5在Jurkat细胞表面的表达率为 94 83% ,TRAIL和抗TRAIL单克隆抗体能够诱导Jurkat细胞凋亡 ,呈现明显的剂量相关性 ,TRAIL浓度在 5 0～ 10 0ng ml时 ,杀伤率达 90 %以上。预先用抗DR5单克隆抗体与Jurkat细胞作用后 ,TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎完全被mAb所阻断 ,其平均阻断率达90 4 9%。结论 :DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中起着十分关键的作用。

间隙连接细胞间通讯与胸苷激酶系统“旁观者效应”的关系及其调控

增强“旁观者效应”是提高单纯疱疹胸苷激酶/更昔洛韦(HSV-TK/GCV)基因系统治疗效果的关键手段。旨在探讨间隙连接细胞间通讯(GJIC)在HSV-TK/GCV系统“旁观者效应”中的作用及其化学调控。通过采用划痕标记染料示踪技术(SLDT)比较ACHN、HeLa、NIH-3T3、Cos-7及L-02等五种不同细胞系GJIC功能状况,四甲基偶氮唑盐酶反应比色法(MTT法)检测HSV-TK/GCV对其杀伤效应和“旁观者效应”,并比较GJIC上调剂apigenin和抑制剂18-α-glycyrrhetinic acid(AGA)对GJIC和“旁观者效应”的影响。结果表明,GJIC功能强大的NIH-3T3、Cos-7及L-02细胞对HSV-TK/GCV敏感性及“旁观者效应”程度远较GJIC功能低下的ACHN和HeLa细胞高(P<0.001)。Apigenin可显著提高ACHN细胞GJIC功能,对HeLa细胞则无影响;相反,AGA可显著抑制NIH-3T3、Cos-7和L-02等三种靶细胞的GJIC功能。相应地,apigenin可明显提高ACHN细胞的“旁观者效应”而对HeLa细胞的“旁观者效应”则无影响,AGA则可明显降低上述三种细胞的“旁观者效应”。因此认为,细胞内在的GJIC功能与靶细胞对HSV-TK/GCV的敏感性和“旁观者效应”程度有正向关系,人为调控细胞GJIC后,“旁观者效应”程度亦发生相应改变。

核苷酸切除修复基因XPA反义RNA表达载体的构建及其抑瘤功能

采用RT PCR方法扩增出 4 2 6bp着色性干皮病A(xerodermapigmentosumgroupA ,XPA)cDNA片段 (2～ 4 2 7bp) ,反向插入pcDNA3 1质粒构建XPA反义RNA表达载体 .经测序证实 ,该片段序列与XPAmRNA对应片段完全互补 .通过脂质体Lipofectamine 2 0 0 0将重组质粒转染肺癌A5 4 9细胞 ,RT PCR检测表明转染XPA反义RNA重组质粒能够抑制肺癌细胞XPAmRNA表达 ;MTT实验表明转染XPA反义RNA的肺癌细胞对顺铂敏感性增强 .

核苷酸切除修复基因XPA反义RNA增强肺癌细胞对顺铂的敏感性

背景与目的:目前认为,肿瘤细胞自身核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair,NER)能力增强是肿瘤细胞产生耐药性最重要的机制之一。着色性干皮病A(xerodermapigmentosungroupA,XPA)基因在核苷酸切除修复早期发挥核心作用。本研究拟探讨XPA基因表达与肺癌细胞株对顺铂敏感性的关系。方法:将XPA的反义RNA稳定转染人肺癌细胞株A549,用有限稀释法筛选阳性细胞克隆。分别用Northernblot和Westernblot法检测阳性细胞克隆XPAmRNA和蛋白水平;MTT法检测肿瘤细胞对顺铂敏感性;宿主细胞再活化反应(hostcellreactivation,HCR)检测肿瘤细胞DNA损伤修复能力。结果:筛选得到6个阳性克隆AS1～AS6,其中AS3～AS6细胞克隆的XPAmRNA和蛋白水平均明显降低。剂量依赖实验表明,顺铂对A549细胞与AS1～AS6细胞克隆的半数抑制浓度(IC50)分别为8.1、7.6、4.7、3.2、1.9、2.8、4.1滋g/ml。统计学分析表明,与A549细胞相比,AS3～AS6细胞对顺铂的敏感性明显增强(F=9.75、9.14、7.39、8.91,P=0.005、0.006、0.012、0.006),而且XPAmRNA表达水平与细胞IC50值呈显著相关(r=0.927,P=0.003)。处理24、48、72h后,AS3～AS6细胞对顺铂的敏感性同样显著增强。HCR实验结果表明,AS3～AS6细胞的NER能力显著减弱,而且XPAmRNA表达水平与细胞NER能力呈?