利用组织芯片研究p21^(WAF1/CIP1)和Rb基因在肝细胞肝癌中的表达

目的:利用组织芯片研究肝细胞肝癌(hepatocelluarcarcinoma,HCC)中p21WAF1/CIP1简称p21、Rb蛋白的表达及两者的关系。方法:建立含40例HCC肿瘤组织及其相应癌旁、远癌正常组织共120个微组织的组织芯片,应用免疫组织化学技术(SP法)检测HCC肿瘤、癌旁、远癌正常组织中p21、Rb蛋白的表达情况。结果:p21蛋白缺失率在HCC肿瘤组织中为27.5%,显著高于癌旁及远癌正常肝组织(P<0.05),并与HCC的组织学分级相关(P<0.05);Rb蛋白缺失率在HCC肿瘤组织中为42.5%,显著高于癌旁和远癌正常肝组织P<0.05,但与HCC肿瘤的大小和组织学分级均无统计学相关性(P>0.05)。HCC肿瘤组织中p21与Rb的表达呈负相关P<0.05。结论:p21、Rb蛋白表达缺失可能与HCC的发生有密切联系,p21与Rb基因在HCC中可能通过负反馈机制相互调节。组织芯片是可高效进行肿瘤分子病理研究的技术平台。

四种乙肝核酸疫苗质粒的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建四种乙肝核酸疫苗质粒pCI/S、pCI/S2S、pCI/S1S2S、pCI/S2SS2,并检测其转染真核细胞后的蛋白表达。方法:从慢性乙肝患者的混合血清中制备HBV DNA模板,分别扩增和连接,得到四个基因片段S、S2S、S1S2S、S2SS2,与pCI载体进行连接,得到四个重组质粒pCI/S、pCI/S2S、pCI/S1S2S、pCI/S2SS2,将其分别转染SP2/0细胞,检测目的抗原蛋白的表达情况。结果:四种重组质粒转染细胞后,裂解液中均可检测出目的抗原蛋白的表达。结论:所构建的四种重组质粒均能在哺乳动物细胞内表达相应的目的抗原蛋白,可用于下一步动物实验。

乙肝DNA疫苗pCI/S的构建及诱导小鼠的免疫反应

目的:构建乙肝DNA疫苗pCI/S,观察其接种小鼠后所诱生的免疫应答效果。方法:构建重组质粒pCI/S,将其免疫BALB/c小鼠,在动态观察小鼠血清抗-HBs的诱生,并于第12周时检测体外CTL活性,同时以免疫组织化学法检测小鼠接种部位HBsAg的表达情况。结果:小鼠肌肉接种pCI/S后,1周时血清抗-HBs开始阳转,阳转率于6周、8周达高峰,且能诱生特异性CTL应答。此外,免疫组织化学法能在小鼠接种局部检测出HBsAg的表达。结论:乙肝DNA疫苗pCI/S能在小鼠体内诱生特异性的体液免疫和细胞免疫应答。

乙肝核酸疫苗pCI/S_2S接种小鼠后的免疫应答研究

目的构建乙肝核酸疫苗pCI/S2S,研究其接种小鼠后,接种局部肌肉特异性抗原蛋白的表达以及所诱生的免疫应答反应。方法从慢性乙肝患者的混合血清中制备HBV DNA模板,扩增出基因片段S2S,与pCI载体进行连接,得到重组质粒pCI/S2S。将其肌肉注射接种BALB/c小鼠,在不同的时间点检测血清中抗-HBs及抗-preS2;并于第12周时用细胞毒性检测试剂盒(LDH)检测体外细胞毒性T细胞(CTL)活性,同时以免疫组织化学法检测小鼠接种部位HBsAg的表达。结果小鼠肌肉接种pCI/S2S完成后1周血清抗-HBs、抗-preS2开始阳转,阳转率于6周或8周达高峰,且能诱生特异性CTL应答。此外,免疫组织化学法能在小鼠的接种局部肌细胞中检测出目的抗原蛋白的表达。结论乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后,能在小鼠体内诱生特异性的体液免疫和细胞免疫应答。

雌激素受体核酸适配体在乳腺癌免疫组织化学检测中的应用

目的筛选出能应用于乳腺癌免疫组织化学检测的雌激素受体(ER)核酸。方法制备ER蛋白,用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术筛选出对ER具有高亲和力和特异性的核酸适配体。采用配体-受体相互反应实验来测定合成的ER适配体复合物的亲和力,用生物素化ER适配体和ER单克隆抗体分别作为一抗对105例乳腺癌组织进行免疫组化染色,以检测合成的ER适配体在癌组织中的特异性表达。用Kappa检验进行一致性检验。结果线性回归法计算获得生物素化适配体与ER复合物的解离常数Kd值为(0.34±0.05) nmol/L (n=3,r=0.989),最大结合力(B_(max))为769.23 fmol/(mg prot·nmol^(-1)·L^(-1))。实验结果表明,分别用生物素化ER适配体和ER单克隆抗体分别作为一抗进行免疫组化染色的结果具有高度一致性。其中ER阳性和阴性样本n=105,kappa值=0.943,95%可信区间=0.879～1.006,P<0.05;而ER弱阳性和中度/强表达样本n=75,kappa值=0.805,95%可信区间=0.642～0.967,P<0.05。进一步观察发现,ER适配体和ER抗体能使乳腺癌组织同一部位出现阳性表达,而阴性对照组均无表达。2例子宫内膜癌用生物素化ER适配体检测,癌细胞ER表达均为阳性。结论我们合成的ER适配体在体外能高度结合ER,ER适配体和ER抗体都能检测乳腺癌组织中ER的特异性表达。