结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的高效表达及免疫原性研究

目的高效表达结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原靶(6kDaearlysecretoryantigenictarget,ESAT6)和培养滤液蛋白10(culturefiltrateprotein10,CFP10)的融合蛋白,通过免疫动物,获得CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,扩增cfp10-esat6融合基因,将其与表达质粒pET32a(+)构建成重组质粒pET-cfp10-esat6。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达带组氨酸标签的融合蛋白,经亲和层析得到纯化CFP10-ESAT6蛋白。用该蛋白免疫成年家兔,获得的抗CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,作Western-blot和ELISA分析。结果重组质粒pET-cfp10-esat6构建成功,融合蛋白CFP10-ESAT6大量表达,多克隆抗体制备成功(1∶106)。结论成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合蛋白,制备了大量的CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,为发展新型结核病疫苗和临床血清学检测奠定了实验基础。

四川地区结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因突变研究

目的 研究结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物的分子机制 ,探索四川地区耐喹诺酮结核分枝杆菌临床分离株的耐药基因突变特征。方法 采用绝对浓度法检测结核分枝杆菌临床分离株的最小抑菌浓度 (MIC) ,再通过聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR- SSCP)和直接测序检测结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物临床分离株 gyr A耐药决定区 (QRDR)突变 ,并和标准株 H 37Rv比较。结果 6 8株临床分离株中 ,14株喹诺酮药物敏感株和 8株低耐药株未发现 gyr A耐药决定区基因突变 ,2 5株高耐药株、11株低耐药株和 10株药物敏感株检测到 gyr A基因突变 ,高耐药株突变率为 10 0 % ,低耐药株突变率为 5 8% ,敏感株突变率为 4 2 % ,总的突变率为 6 8%。根据 SSCP条带 ,gyr A突变可分成 4种类型 ,测序发现分别为 Ser95 Thr、Asp94 Gly、Ala90 Val、Ala83Val突变。结论 结核分枝杆菌耐喹诺酮与 gyr A基因突变密切相关 ,gyr A基因突变是耐喹诺酮结核分枝杆菌耐药性的主要分子机制。

结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究

目的 为结核病新型疫苗研制提供靶基因和靶抗原。方法 根据结核杆菌 H 37Rv株免疫保护性抗原 Ag85 A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物 ,以结核杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增获得具有完整开架读码框 (ORF)的 Ag85 A抗原基因 ,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体 p BK- CMV构建重组质粒 ,重组质粒转入大肠杆菌后 IPTG诱导表达 ,并对其表达产物进行 Western- blotting分析。结果 PCR扩增获得了具有完整开架读码框的 Ag85 A抗原基因 ;构建了 Ag85 A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体 ;Ag85 A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达。结论 成功地对结核杆菌免疫保护性抗原 Ag85 A进行了基因克隆与表达 。

人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4片段的克隆和在寻常型天疱疮中免疫识别的初步研究

目的扩增人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4(desm og le in 4,D sg4)胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4的核酸序列,为寻常型天疱疮(pem ph igus vu lgaris,PV)发病机制的研究提供依据。方法根据G enB ank中的D sg 4序列(登录号为AY 177664)分析,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人正常皮肤组织中抽提RNA,逆转录合成cD-NA,聚合酶链反应(PCR)扩增皮肤组织桥粒芯糖蛋白4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4目的基因;应用基因重组技术将目的基因分别与质粒pET 32a在T 4 DNA连接酶作用下相连接,转化E.coli DH 5α感受态细菌,用含氨苄青霉素的LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子DNA序列测定鉴定;重组融合蛋白经EL ISA法与PV患者、正常对照组血清进行反应。结果RT-PCR扩增产物经凝胶电泳得到均约为350 bp的4条条带;质粒载体pET 32a连接的目的基因经序列测定后与在G enB ank登录的D sg4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4核酸序列完全一致,4个D sg4胞外区域cDNA读码框架正确;D sg4 EC1、EC2、EC3和EC4与患者血清反应,而不与正常对照组血清反应。结论D sg4胞外区域多肽片断在PV发病中可能有作用。

卡介苗胞壁蛋白增强肺抗铜绿假单胞菌感染防御功能的研究

目的观察卡介苗胞壁蛋白组分能否提高大鼠肺组织对铜绿假单胞菌的清除率。方法密度梯度离心和分子筛方法分离卡介苗胞壁蛋白组分。用Northern杂交和RT-PCR检测卡介苗全菌体及其胞壁蛋白组分对肺上皮SPC-A-1细胞β防御素hBD-1 mRNA表达的刺激作用;腹腔注射卡介苗胞壁蛋白组分48h后,经气管滴入铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌,24h后处死大鼠,取肺组织进行菌落计数。结果卡介苗胞壁蛋白经分子筛层析后主要得到两大组分,Tricine-SDS-PAGE鉴定组分2相对分子质量约为18×103～30×103。Northern杂交显示热灭活卡介苗能提高肺上皮细胞β防御素hBD-1 mRNA表达,RT-PCR显示胞壁蛋白组分2刺激作用明显强于全菌体。经胞壁蛋白组分2治疗的大鼠肺组织铜绿假单胞菌数低于阴性对照组(P<0.01),而对金黄色葡萄球菌感染无明显抵抗作用。结论卡介苗胞壁蛋白组分可提高肺组织对铜绿假单胞菌的清除率,增强肺抗感染防御能力。

结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因重组穿梭质粒的构建及其在BCG中的融合与分泌表达研究

通过SOE法(重叠延伸,Genesplicingbyoverlapextension),扩增cfp10-esat6融合基因,与穿梭整合质粒pMV361构建成重组质粒。另将BCGα抗原(α-Ag)信号肽序列与上述重组质粒构建成另一重组质粒。将两种重组质粒分别导入BCG菌构建融合型重组卡介苗和分泌型重组卡介苗,热诱导后分析其表达产物。本研究成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合及分泌表达的重组BCG,为发展新型结核病疫苗打下了一定的基础。

中国强毒赖型钩端螺旋体新基因OmpL17的表达及其免疫原性

将Omp L17基因克隆于p GEX- 1λT载体,在大肠杆菌JM10 9中表达分子量约为5 4 KDa的GST-Omp L17融合蛋白,凝血酶切割后得到了大小约2 8KDa的Omp L17蛋白。用纯化的Omp L17蛋白免疫大白兔,制备了高滴度的特异性抗体(1∶4 896 )。本研究获得了纯化的Omp L17及其特异性抗体,为该外膜蛋白致病作用及免疫保护力研究奠定基础。

结核分枝杆菌联合DNA疫苗初免—BCG加强的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌免疫保护性抗原DNA(Ag85A和ESAT-6)疫苗联合免疫,BCG免疫以及联合DNA疫苗初免—BCG加强免疫等不同的免疫策略,诱导免疫应答效果观察。方法:健康雌性BALB/c小鼠24只,随机分成PBS阴性对照组,DNA初免—BCG异源加强组,DNA(Ag85A和ESAT-6)初免DNA同源加强组和BCG阳性对照组,共进行3次免疫,初免2次,最后1次加强,间隔2周1次。PBS组3次均注射PBS溶液;DNA/BCG组以质粒DNA免疫2次,最后1次以BCG加强免疫;DNA/DNA组3次均以质粒DNA进行免疫;BCG组则注射PBS溶液2次后以BCG免疫。末次免疫后4、6、8周分别分离血清测定总IgG水平,同时分离小鼠脾细胞,体外经TB-PPD刺激后进行淋巴细胞增殖实验(XTT法)并测定脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平。结果:DNA/BCG、DNA/DNA、BCG组体外经TB-PPD刺激后均检测到特异性IgG抗体产生,3组平均效价为1∶120、1∶160、1∶80,DNA/DNA组的抗体效价高于另外2组;小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,均能产生特异性淋巴细胞增殖并诱生较强的IFN-γ反应,其中DNA/BCG组IFN-γ的分泌水平高于DNA/DNA组和BCG组(P<0.05)。结论:联合DNA疫苗初免—BCG加强的免疫策略能在小鼠体内诱导较强的特异性细胞免疫反应,产生高水平的IFN-γ。

结核杆菌检测基因芯片的制备研究

目的 建立结核杆菌检测基因芯片的制备技术。方法 制备和标记靶基因 ,用点样仪将靶基因点于玻片介质上 ,并经点样后处理制成基因芯片 ,用扫描仪测定处理前后芯片上荧光强度的变化 ,计算 DNA固定率 ,同时测定和比较两种不同玻片、不同点样液和三种不同点样后处理方法的 DNA固定率。结果 制备结核杆菌检测基因芯片 ,用醛基修饰玻片作为介质 ,用 DMSO溶液作为点样液 ,点样后芯片处理以水合 1小时再干燥 30分钟为佳。

IL-12联合结核杆菌DNA疫苗初免-BCG加强免疫的免疫效果观察

目的研究并比较IL-12联合结核分枝杆菌(TB)DNA(Ag85A和ESAT-6)疫苗初免-BCG加强免疫的应答效果。方法将小鼠随机分成PBS阴性对照组和4组免疫组:BCG组、DNA(Ag85A和ESAT-6)初免-BCG异源加强组、DNA+IL-12初免-BCG异源加强组和DNA初免-BCG+IL-12异源加强组。末次免疫后4、6、8周分别测定血清总IgG水平,同时分离小鼠脾细胞,进行淋巴细胞增殖实验(流式细胞仪检测),测定脾细胞培养上清中IFN-γ分泌水平,并检测小鼠脾脏淋巴细胞表型。结果4组免疫组体外经TB纯蛋白衍生物(TB-PPD)刺激后均检测到特异性IgG抗体产生,且抗体水平在末次免疫后4～8周逐渐增加,4组平均效价为1∶80,1∶120、1∶160、1∶160,各组抗体水平增加无明显差异(P>0.05);小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,4组免疫组均能产生特异性淋巴细胞增殖并诱生较强的IFN-γ反应,且DNA+IL-12/BCG和DNA/BCG+IL-12组特异性淋巴细胞增殖活性和IFN-γ分泌水平均明显强于BCG,DNA/BCG组(P<0.05),但DNA+IL-12/BCG和DNA/BCG+IL-12组间差异不明显;4组免疫组小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞较PBS组有较大升高(P<0.05),且DNA+IL-12/BCG和DNA/BCG+IL-12组CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比大于BCG以及DNA/BCG组(P<0.05)。结论IL-12联合DNA疫苗初免-BCG加强的免疫策略较BCG免疫以及单纯的DNA疫苗初免-BCG加强免疫能在小鼠体内诱导更强的特异性细胞免疫反应,产生高水平的IFN-γ。

人抗菌肽FALL-39基因定点突变体的构建及其大肠杆菌表达产物的抗菌活性研究

目的 构建人抗菌肽 FAL L - 3 9定点突变子及研究其抗菌活性。方法 采用 PCR体外定点突变技术( PCR- SDM) ,设计两对引物 ,引入一个突变点 ,通过重叠延伸法两次 PCR扩增 ,使 FAL L - 3 9第 3 2位密码子由AAT突变为 AAG,将扩增片段克隆入 PGEXλ1T质粒中 ,转化大肠杆菌 JM10 9,并用 IPTG诱导 ,表达的 FAL L -3 9- lys3 2经纯化后与 FAL L - 3 9进行抗菌活性比较。结果 DNA测序结果表明在预期位点发生突变 ,突变后的FAL L - 3 9- lys3 2蛋白对大肠杆菌 ML - 3 5 p的抗菌活性明显增强 ,其最低抑菌浓度 ( MIC)和最低杀菌浓度 ( MBC)分别由 FAL L - 3 9蛋白的 18.75和 3 7.5 0μg/ m l降低为 FAL L - 3 9- L ys- 3 2的 10 .94和 2 1.88μg/ m l,对绿脓杆菌ATCC2 785 3的 MIC和 MBC值分别为 FAL L - 3 9蛋白的 3 1.2 5和 3 7.5 0μg/ m l降低为 FAL L - 3 9- L ys- 3 2的 18.75和 3 1.2 5μg/ ml。两种蛋白均在含 Medium E的 L B培养基中表现出较高活性 ,在 L B培养基中抗菌活性最低 ,但在同一种培养基中 FAL L - 3 9- L ys- 3 2蛋白抗菌活性要高于 FAL L - 3 9蛋白。结论 用两步 PCR定点突变技术获得一个 FAL L - 3 9- L ys3 2突变子 ,其表达分子的抗菌活性明显增强 ,提示在 FAL L - 3 9分子中增加碱性?

赖型钩端螺旋体OmpA外膜基因Loa22重组卡介苗的构建及其免疫蛋白表达

目的以赖型钩端螺旋体外膜蛋白A(OmpA)膜蛋白基因Loa22去信号肽基因片段构建重组卡介苗并对其免疫蛋白进行表达分析。方法以赖型钩端螺旋体56601株全基因组DNA为模板,PCR扩增出Loa22成熟肽基因片段,与大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭整合质粒pMV361一起分别经过双酶切,连接,转化。筛选鉴定出阳性重组质粒rpMV361-loa22,电转化入BCG,经筛选鉴定后,热诱导表达,通过SDS-PAGE及Western Blotting鉴定其表达产物。分别用BCG、rBCG-pMV361、rBCG-loa22、Loa22蛋白、灭活全钩体免疫小鼠两次后,脱臼处死小鼠分离脾淋巴细胞,XTT比色法检测体外脾淋巴细胞增殖活性。结果PCR扩增获得516 bp的片段,成功构建重组穿梭质粒rpMV361-loa22,经电转化构建重组卡介苗成功,热诱导表达出相对分子质量约19×103特异条带。体外脾淋巴细胞增殖实验证实rBCG-loa22可引起细胞反应,其增殖活性与BCG组和rBCG-pMV361组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了赖型钩端螺旋体重组卡介苗rBCG-loa22并高效表达具有免疫学活性的外膜蛋白Loa22,为新一代钩端螺旋体疫苗研究打下了基础。

赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白LipL32基因重组质粒的构建及其细胞毒性的研究

目的构建赖型钩端螺旋体(钩体)017株外膜蛋白LipL32基因的重组质粒,并研究其细胞毒性。方法从钩体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌,诱导表达LipL32蛋白,将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western Blotting鉴定其免疫原性。将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞,通过检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)、NO释放量研究其细胞毒性。结果扩增出816bp的LipL32基因,重组质粒经双酶切、PCR鉴定、测序均表明重组载体构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约52×103,主要以包涵体的形式表达,经免疫动物制备得到多克隆抗体,ELISA检测效价达1:32000,Western Blotting显示在目的蛋白位置处有特异性阳性条带。经过LipL32蛋白作用的ECV304细胞LDH、NO释放量和对照组比较有明显升高。结论成功构建LipL32基因重组质粒,该质粒能在大肠杆菌中表达,表达的目的蛋白对细胞有一定的毒性效应。

HMGN2分子体外抗乙型肝炎病毒活性研究

目的:我们先前的研究证明HMGN2(high mobility group nucleosomal-binding domain2)是人LAK细胞抗菌的一个新的效应分子,本研究欲检测其体外抗乙型肝炎病毒的活性。方法:应用反向高效液相色谱技术从人淋巴结组织酸溶性提取物中分离纯化批量HMGN2分子,用质谱精确分子量测定、Western blotting和抗菌试验对分离纯化得到的HMGN2分子进行分子鉴定。采用MTT法检测HMGN2分子对稳定转染复制型HBV重组质粒的肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞的细胞毒性;用不同浓度HMGN2分子作用于HepG2.2.15细胞,分别在第3d和第6d收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中HBV表面抗原(HBsAg)及e抗原(HBeAg),采用实时荧光定量PCR法检测上清液HBVDNA的含量。结果:从人淋巴结组织中分离纯化获得纯度较高的HMGN2蛋白;在检1-100mg/L范围内,HMGN2分子对HepG2.2.15细胞无细胞毒性;HMGN2分子在1-5mg/L水平即可显著抑制HBeAg和HBsAg的表达,可显著降低HBVDNA拷贝数。结论:HMGN2分子在体外具有较强的抗HBV活性。