二肽基肽酶4基因沉默对脂多糖诱导肺泡巨噬细胞焦亡的促进作用及其机制

目的观察二肽基肽酶4(DPP-4)基因沉默对脂多糖(LPS)诱导肺泡巨噬细胞焦亡的促进作用,并探讨其可能的机制。方法取对数生长期的MH-S肺泡巨噬细胞系(简称MH-S细胞),随机分为Control siRNA组(转染Control siRNA)、DPP-4 siRNA组(转染DPP-4 siRNA)、Control siRNA+LPS组(转染Control siRNA后加入LPS)、DPP-4 siRNA+LPS组(转染DPP-4 siRNA后加入LPS)。倒置显微镜下观察各组细胞形态是否呈焦亡表现(细胞空泡化、发生聚团及细胞膜破裂),CCK-8法观察细胞增殖活性,乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性实验观察焦亡所致细胞毒性(以LDH释放量表示),Calcein-AM/PI双染法观察细胞死亡情况(以PI阳性细胞率表示),Western blotting法检测细胞焦亡通路标志蛋白核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1 p20亚基(Caspase-1 p20)、焦孔素D-N端(GSDMD-N)及炎症因子白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素1β(IL-1β)蛋白相对表达量。取对数生长期的MH-S细胞,随机分为Control siRNA+LPS作用组(转染Control siRNA后加入LPS)、DPP-4 siRNA+LPS作用组(转染DPP-4 siRNA后加入LPS)、Control siRNA+SB203580+LPS作用组(转染Control siRNA后加入p38抑制剂SB203580、LPS)、DPP-4 siRNA+SB203580+LPS作用组(转染DPP-4 siRNA后加入p38抑制剂SB203580、LPS),采用Western blotting法检测细胞p38活化相关指标及焦亡通路标志蛋白表达。结果Control siRNA组细胞无焦亡表现,DPP-4 siRNA组可见少量细胞呈焦亡表现,Control siRNA+LPS组和DPP-4 siRNA+LPS组可见大量细胞呈焦亡表现,以DPP-4 siRNA+LPS组细胞焦亡表现更明显。Control siRNA组、DPP-4 siRNA组、Control siRNA+LPS组、DPP-4 siRNA+LPS组细胞增殖活性依次降低,LDH释放量、PI阳性细胞率及细胞NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD-N、IL-18、IL-1β蛋白相对表达量均依次升高,组间两两比较P均<0.05。与DPP-4 siRNA+LPS作用组比较,Control siRNA+LPS作用组、Control siRNA+SB203580+LPS作用组、DPP-4 siRNA+SB203580+LPS作用组p-p38/p38、p-NF-κB/NF-κB及NLRP3、Caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白相对表达量均降低,以Control siRNA+SB203580+LPS作用组、DPP-4 siRNA+SB203580+LPS作用组降低更明显(P均<0.05)。结论DPP-4基因沉默可促进LPS诱导的肺泡巨噬细胞焦亡,其机制可能与促进p38、NF-κB磷酸化后启动NLRP3炎症小体形成及炎症因子释放,从而调控Caspase-1介导的经典细胞焦亡通路有关。

转染DPP-4 siRNA或(和)加入SP600125的小鼠肺泡巨噬细胞极化及JNK/AP-1信号通路激活情况观察

目的观察转染二肽基肽酶-4(DPP-4)siRNA或(和)加入c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制剂(SP600125)的小鼠肺泡巨噬细胞极化情况、JNK/AP-1信号通路激活情况。方法体外培养小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S),并随机分组:Control组转染空载siRNA、siDPP-4组转染DPP-4 siRNA、LPS组转染空载siRNA+LPS、siDPP-4+LPS组转染DPP-4 siRNA+LPS、LPS+SP600125组转染空载siRNA+LPS联合SP600125、siDPP-4+LPS+SP600125组转染DPP-4 siRNA+LPS联合SP600125。采用Western boltting法检测巨噬细胞中M1型和M2型极化标志物CD86、CD206蛋白及JNK、激活蛋白-1(AP-1)转录蛋白(c-Jun、c-Fos)磷酸化,RT-qPCR法检测巨噬细胞中M1型标志物(CD86、TNF-α、iNOS、IL-1β)和M2型标志物[CD206、精氨酸激酶-1(ARG-1)、IL-4、IL-10]mRNA,一氧化氮(NO)测定试剂盒、免疫荧光检测巨噬细胞上清液中M1型促炎因子NO和细胞内活性氧(ROS)生成情况。结果与Control组比较,LPS组M1型促炎型因子NO、ROS生成含量及M1型极化标志物(CD86蛋白及CD86、TNF-α、iNOS、IL-1βmRNA)表达升高,M2型极化标志物(CD206蛋白及CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA)表达降低,P均<0.05。与LPS组比较,siDPP-4+LPS组M1型促炎型因子NO、ROS生成含量及M1型极化标志物(CD86蛋白及CD86、TNF-α、iNOS、IL-1βmRNA)表达升高,M2型极化标志物(CD206蛋白及CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA)表达降低,P均<0.05。与LPS组比较,siDPP-4+LPS组p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相对表达量升高,P均<0.05。与siDPP-4+LPS组比较,siDPP-4+LPS+SP600125组p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相对表达量降低,P均<0.05。结论转染DPP-4 siRNA可促进LPS诱导的小鼠肺泡巨噬细胞M1型极化,抑制肺泡巨噬细胞M2型极化,并增加JNK、c-Jun、c-Fos蛋白磷酸化表达;加入JNK抑制剂后,可降低由转染DPP-4 siRNA引起的JNK、c-Jun、c-Fos蛋白磷酸化表达升高。转染DPP-4 siRNA促进LPS诱导的小鼠肺泡巨噬细胞M1型极化的作用机制可能与激活JNK/AP-1信号通路有关。

安全头盔对电动车驾驶员道路交通伤害的影响

目的研究道路交通伤害发生时安全头盔对电动车驾驶员伤员损伤类型、伤害结局及住院日的影响,为论证佩戴安全头盔对驾驶员有保护作用提供依据。方法回顾性分析2020年4月至2022年12月急诊科接诊的在电动车与机动车交通事故中受伤的电动车驾驶员的伤情。统计伤员损伤类型及人数、留观或处置后回家人数、住院人数、转院人数、死亡人数及住院伤员住院日。在明确电动车驾驶员伤员在道路交通事故发生时是否佩戴头盔后,将伤员分为佩戴头盔组和未佩戴头盔组进行数据比较分析。结果共纳入伤员228例,佩戴头盔组57例,未佩戴头盔组171例。两组伤员的腹部损伤、胸部损伤、骨折、皮肤软组织损伤及其他损伤的发生率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。佩戴安全头盔组的颅脑损伤发生率低于未佩戴安全头盔组(P<0.05)。两组的转院比例和死亡比例比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。佩戴安全头盔组的住院比例和住院日均低于未佩戴安全头盔组(P<0.05),留观或处置后回家比例则高于未佩戴安全头盔组(P<0.05)。结论安全头盔可有效减少电动车驾驶员道路交通伤害发生时的颅脑损伤、住院率及住院日,并改善伤害结局,电动车驾驶员在行驶中正确佩戴安全头盔非常重要。

趋化因子CCL2在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用

目的:探讨趋化因子CCL2在实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)中的作用及其可能机制。方法:选取CCL2^(-/-)敲除小鼠和C57BL/6小鼠,利用髓鞘少突细胞糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG33-35)建立EAE小鼠模型,观察小鼠发病情况,并根据Konot神经功能评分标准对其进行评分;待模型组小鼠发病评分普遍为4~5分时,收集CCL2^(-/-)、C57BL/6模型组和C57BL/6空白组小鼠(n=10)脊髓组织进行HE染色观察和免疫组化检测,分析小鼠脊髓组织的病理变化和CD4^+、CD8^+T淋巴细胞数量改变。结果:CCL2^(-/-)、C57BL/6模型组小鼠发病率分别为0%、100%;其中,1只CCL2^(-/-)模型组小鼠在免疫后第21天出现轻微拖尾随后恢复正常。免疫后第21天时,CCL2^(-/-)模型组小鼠的神经功能评分明显低于C57BL/6模型组(P<0.05)。HE染色结果显示,C57BL/6模型小鼠的脊髓组织中脱髓鞘现象明显,其炎性细胞数目显著高于CCL2^(-/-)组(P<0.05);同时,免疫组化结果表明,CCL2^(-/-)小鼠脊髓组织中CD4^+T淋巴细胞、CD8^+T淋巴细胞均分别低于C57BL/6小鼠对照组(P<0.05),尤其CD8^+细胞量改变存在显著差异(P<0.05)。结论:趋化因子CCL2可能通过抑制T淋巴细胞的浸润抑制EAE的发生发展。