促进科学与伦理的良性互动——国家人类基因组南方研究中心伦理学部工作体会

介绍了国家人类基因组南方研究中心伦理学部自成立以来开展的主要工作:开展生命伦理前沿研究,为主管部门制订政策和规范提供参考;普及生命伦理知识和理念;参与伦理评审,推进伦理委员会建设;开展国内外学术交流。并表达了工作体会,科学家与伦理学家需要携手合作,共同促进科学技术与伦理道德的良性互动。在伦理审查和监督中,尽可能地把科学与伦理统一起来,确保研究的科学性。

全基因组关联分析在人类复杂疾病研究中的应用

早在1996年,Risch和Merikangas[1]首先提出了常见疾病可能是由于常见基因变异引起的,关联分析通常比连锁分析具有更高的检测效率,而全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）是发现人类复杂疾病相关遗传变异最有力和最有效的研究方法。

人类基因组计划现状与展望

人类基因组计划（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ，ＨＧＰ）是美国科学家于１９８５年在能源部（ＤＯＥ）的一次会议上讨论酝酿诺贝尔奖获得者Ｒｅｎａｔｏ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ于１９８６年在《科学》（Ｓｃｉｅｎｃｅ）杂志上发表的一篇短文中率先提出的，旨在阐明人类基因组ＤＮＡ长达３×１０＾９碱基对（ｂａｓｅ ｐａｉｒ，ｂｐ）的序列，发现所有人类基因并阐明其在染色体上的位置，从而在整体上破译人类遗传信息，

人类基因组伦理:问题与前景

人类基因组计划 (HGP)试图在分子层次上更深入、更全面地认识人体 ,为战胜疾病增进健康提供科学依据 ,从而造福人类。这是人类认识生命、认识自身的自然而又必然的结果。必须反对“基因决定论” ,保护基因隐私 ,防止基因歧视 ,警惕“优生运动”死灰复燃。HGP与生老病死密切相关 ,对伦理特别敏感 ,尤其要强调伦理的规范和引导作用 。

人类新基因CHID1的克隆与功能初步研究

使用生物信息学手段,从人公共蛋白质数据库的蛋白质序列中筛选到新的分泌蛋白基因CHID1(Chitinase domain containing 1),该基因定位于人11号染色体短臂15区5带(11p15.5),cDNA长1 182 bp,其编码蛋白共有393个氨基酸。转染COS-7细胞后Western blot实验显示:在细胞培养液中没有检测到CHID1蛋白。对CHID1基因在mRNA水平上进行组织分布考察发现:它在肺、肾、肝、心、胸腺中都有表达,肝中最高。细胞生长曲线揭示,Lovo-CHID1稳定细胞株有生长抑制的现象,而细胞周期分析发现细胞株在G1期发生阻滞。这表明CHID1有可能是个潜在的抑癌基因。

全基因组扫描寻找强直性脊柱炎的易感基因位点

为了寻找中国人群强直性脊柱炎 (ankylosingspondylitis ,AS)的易感基因位点 ,采用全基因组扫描法对 9个强直性脊柱炎家系进行基因分型、参数连锁分析和非参数连锁分析。在参数连锁分析中 ,D6S2 76位点的最大LOD值为 3 882 1(θ =0 0 ) ,精细分析显示距D6S2 76位点附近的D6S1691和D6S1618的LOD值分别为 1 5717(θ =0 1)及2 0 0 56(θ =0 1)。在非参数连锁分析中 ,位于D6S2 76附近的LOD值高达 5 0 62 3 ,非参数连锁分析的NPL值为3 7561,最小P值为 0 0 0 0 2 3 3。上述结果提示 ,D6S2 76与强直性脊柱炎之间存在较强的连锁关系 ,D6S1691 D6S2 76 D6S1618区域可能存在强直性脊柱炎的易感基因位点。此外 ,D3S12 92、D4S153 5和D18S64的最大LOD值分别为1 2 768(θ =0 2 )、1 12 46(θ =0 2 )和 1 1851(θ =0 1) 。

草菇全基因组框架图

采用Roche 454 GS FLX测序技术和Solexa测序技术相结合,进行了草菇(Volvariella volvacea)全基因组的测序,最终获得了长度为35.67Mb的草菇全基因组序列。通过生物信息学预测,获得了11097个蛋白编码基因,其中5516个基因有明确的功能注释信息。这是在国际上首次报道的草菇基因组框架图。

系统性红斑狼疮患者Toll样受体9基因多态性的初步研究

目的研究Toll样受体9(TLR9)基因在系统性红斑狼疮(SLE)中是否存在多态性。方法提取26例SLE患者mRNA并逆转录为cDNA,扩增产物经3730 DNA自动测序仪测定TLR9基因序列。结果TLR9 mRNA自起始位点起第1783、2269和3222位碱基存在二态性(A或G),这3个位点为单核苷酸多态性(SNP)位点,分别称之为SNP1、SNP2和SNP3,其中SNP1是我们新发现的多态性位点,SNP2和SNP3为美国国立生物技术信息中心(NCBI)SNP数据库中公布的位点,它们均不改变氨基酸编码。SNP2在人群中可表现为AA纯合、GG纯合或AG杂合3种基因型,在SLE患者中以AG型为主(50%),而在正常人中以GG型为主(75%)(P<0.05);SNP1和SNP3只在一名男性SLE患者中发现,表现为AG杂合,其余个体均为GG纯合。结论TLR9基因编码区中的一个单核苷酸多态性与SLE发病相关联。

雌激素受体基因单核苷酸多态性与特发性矮小的相关性研究

目的分析中国汉族人群的特发性矮小(ISS)患儿以及正常人群中雌激素受体(ER)基因的多态性,并结合临床资料比较分析,以探讨ISS的可能发病机制。方法对355例ISS患儿和345位正常对照的ER基因的单核苷酸多态性(SNP)进行分型,分析此位点的等位基因频率及基因型频率在两组人群之间的差异。并对不同基因类型的临床指标进行差异分析比较。结果rs6557177T等位基因病例组较对照组降低,差异有统计学意义(P=0.021,OR=0.624)。2种不同基因型的临床指标进行差异分析比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ERα位点rs6557177与ISS相关,此位点等位基因T可能为矮小的保护性基因,可降低矮小风险。C基因和T基因分组临床指标(身高、体质量、BMI、IGF-1、IGFBP3)分析比较,差别不大。

遗传性对称性色素异常症:一例家系报道及DSRAD基因突变的研究

目的报道1例遗传性对称性色素异常症家系,并对家系成员的DSRAD基因突变进行检测。方法PCR扩增该家系患者和健康对照个体DSRAD基因的全部外显子,并进行DNA测序,以100例无亲缘关系的正常人作对照。结果该家系患者DSRAD基因的第14外显子3388碱基发生了一个T→C的杂合突变,导致第1130位半胱氨酸被精氨酸替代,该区域可能存在DSRAD基因的脱氨基酶。家系中健康对照个体及无亲缘关系的正常人均未发现该突变。结论该遗传性对称性色素异常症家系中存在DSRAD基因的特异性突变,该突变引起编码蛋白功能缺陷,导致出现皮肤色素异常的临床表型。

华东地区汉族脂肪分化相关蛋白基因SNP的研究

目的研究华东地区汉族 2型糖尿病病人脂肪分化相关蛋白 (ADRP)基因的单核苷酸多态 (SNP)。方法使用PCR测序方法 ,对ADRP基因的启动子、外显子以及临近的内含子进行测序 ,确定该基因在华东地区汉族2型糖尿病病人中所存在的SNP。 结果所测ADRP基因片段总长度为 5 0 0 3个碱基 ,有 2 1个SNP ,高频、低频分别是 5、16个。 结论ADRP基因在华东地区汉族 2型糖尿病病人中存在SNP ;对某些SNP进行基因分型可以进一步确定ADRP基因中与 2型糖尿病相关的SNP存在情况。

多基因遗传病基因研究的策略和方法

基因在决定个体表型方面起着决定性的作用。虽然单基因疾病的致病基因的克隆工作取得了显著的进展 ,但对于多基因疾病来说 ,仍然存在许多问题 ,同时也是巨大的挑战。本文综述了多基因疾病的遗传特点和多基因疾病易感基因识别、分离和克隆的一般步骤和存在的问题 ,介绍了人类基因组计划在此过程中的作用和单核苷酸多态性的应用前景 ,提出了最有可能克隆出多基因疾病易感基因的策略和方法。

基因芯片技术研究肝纤维化相关基因

目的 通过对大鼠肝纤维化发生过程中基因表达差异性的分析 ,探讨肝纤维化的发生机制。方法 采用四氯化碳 (CCl4)诱导大鼠肝纤维化 ,于用药 2周、4周、6周、8周分别取肝组织提取总RNA ,分离纯化 poly(A) +RNA ,逆转录并用 [α 33P]dATP制备探针 ,与含 1176个基因的大鼠cDNA微阵列杂交及洗涤 ,信号检测 ,微阵列图像分析和计算机软件处理数据。结果 用药 4周时 ,筛选出的 16 6条差异表达基因中 ,上调基因 15 6条 ,主要为细胞骨架和动力蛋白基因、激素受体基因、细胞内蛋白磷酸化酶基因和ras相关蛋白基因等 ;下调基因主要为P4 5 0相关基因、核糖体蛋白基因、脂肪酸结合蛋白基因和生长因子受体基因等。用药 8周时 ,筛选出差异表达基因中上调基因 2 4 6条 ,主要为细胞外信息传导基因、生长因子相关基因、细胞周期相关基因、凋亡相关蛋白基因和激素受体基因等 ;下调基因主要为脂质代谢基因、激素受体基因和氨基酸受体基因等。其中部分差异表达基因用RT PCR和Northern印迹法加以证实。结论 肝纤维化形成过程中存在多个表达水平不同的基因 ,涉及丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信号通路 ,同一基因在不同时期表达水平也不一样 ,值得进一步研究。

霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列的测定与分析

测定并分析了霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列,为VP2生物学特性和功能研究提供分子遗传学基础。为此构建了VP2DNA随机文库,鸟枪法(shot gun)测定其全基因组序列。测序结果用软件Phrad Prap拼接成最小重叠群(contig),引物步移法测定contigs间的缝隙(gap)序列,拼接后获得VP2全基因组序列。利用生物信息学技术分析VP2基因组,最后对VP2和相关噬菌体做DNA聚合酶(DNApol)基因的进化树分析。结果:VP2属短尾噬菌体科,基因组全长39853bp,为环状双链DNA,G+C含量为50.56%,较高于霍乱弧菌测序菌株N16961基因组G+C含量;VP2的基因组有碱基使用偏性;预测和注释了45个开放读码框(ORF),分析了DNA复制基因、衣壳蛋白和DNA包装基因、侵染相关基因。DNApol进化树比较结果,VP2与链球菌噬菌体Cp 1和芽孢杆菌噬菌体GA 1分为一群。根据对VP2基因组序列的测定和分析预测了VP2的ORF,并分析了其中的功能基因,推测VP2在进化关系上属于噬菌体phi29样噬菌体。

大鼠CCl_4所致肝纤维化自发逆转的基因表达谱研究

目的:利用cDNA微阵列杂交筛选肝纤维化自发逆转过程中的差异表达基因,从而揭示纤维化逆转的基因表达谱. 方法:通过四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)注射SD大鼠8 wk,随后停药6 wk建立肝纤维化自发逆转的动物模型.提取纤维化逆转过程中不同时间段的肝组织mRNA,与cDNA微阵列杂交,筛选表达水平明显上调或下调的差异基因,并结合Cluster分析等进行分类.此外选择α共核蛋白、A-raf、早老素2及β肌动蛋白作RT-PCR以验证检测结果. 结果:CCl4诱导的肝纤维化在停止毒剂注射后出现进行性消退.cDNA微阵列杂交证实,肝纤维化消退过程中共有254条基因出现转录水平改变,占基因总数的21.59%. 其中8,10,12,14 wk的差异表达基因分别为54, 85,97,132条.筛选所得的肝纤维化逆转相关基因主要涉及代谢相关酶、脂肪代谢相关蛋白、离子通道、转录因子、胃肠激素及受体、MAPK及PI3k/Akt信号转导通路等.RT-PCR检测与cDNA微阵列杂交一致,证实了结果的可靠性. 结论:肝纤维化逆转过程中基因表达谱发生显著改变, 主要涉及代谢相关酶、转运蛋白/协同转运蛋白、胃肠激素及受体、脂蛋白/脂肪酸结合蛋白、转录因子/ 核因子、MAPK信号转导通路等6类基因.

小鼠Nucleophosmin基因的克隆及基因组结构分析

Nucleophosmin(NPM)是主要的核仁磷酸化蛋白,在一些退行性大细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓性白血病等病人中可见累及NPM基因的染色体易位。建立NPM基因剔除的小鼠模型对于研究NPM基因的生物学功能及其在淋巴瘤及白血病发病中的确切作用有非常重要的意义。为获得包含NPM基因组全长序列的噬菌体克隆,以小鼠NPMcDNA为探针对129S1系小鼠λ噬菌体基因组文库进行筛选,经3轮筛选鉴定出一个包含小鼠NPM基因组全序列的噬菌体克隆。用鸟枪法对这个λ噬菌体克隆全长15.3kb进行了测序,序列经BLAST分析显示,该克隆所包含的129S1系小鼠NPM基因组序列与GenBank中C57BL/6系小鼠序列约99.8%相同。根据测序获得的基因组序列,应用生物信息学方法对小鼠NPM的基因组结构及NPM基因5′启动子区可能的转录因子结合位点等进行了分析。

运用siRNA建立稳定低表达IGF1R基因的肝癌细胞株的实验研究

目的运用siRNA技术在肝癌细胞株中建立稳定低表达人胰岛素样生长因子1类受体(IGF1R)基因的细胞株。方法构建包含封闭IGF1R基因的真核表达载体pSUPER-IGF1R-siRNA,转染SMMC7721和Hep3B细胞,G418筛选表达稳定的细胞株。通过RT-PCR、Western-blot分析与鉴定IGF1R mRNA和蛋白及cyclin D1、cyclinB1蛋白的表达,并绘制细胞生长曲线。结果在SMMC7721和Hep3B细胞中成功建立低表达IGF1R基因的细胞株,其生长明显减慢(P<0.05),且其cyclinD1表达亦明显下降(P<0.05)。结论pSUPER-IGF1R-siRNA能抑制SMMC7721和Hep3B细胞的生长。

利用基因免疫进行日本血吸虫Sj22蛋白抗体制备的研究

应用基因免疫方法制备日本血吸虫Sj22蛋白的抗体,并研究CpG佐剂和蛋白加强策略在增强基因免疫效果中的作用。采用肌肉注射的方法免疫小鼠,实验动物分为4组:A组注射pVAX1-sj22质粒100μg/只;B组注射pVAX1-sj22质粒50μg/只,同时注射CpG佐剂20μg/只;C、D组注射pcDNA3.1-sj22质粒100μg/只。分别在0、3、6周进行免疫,第9周A、B、C组用30μg重组sj22蛋白加强免疫,D组则用pcDNA3.1-sj22质粒100μg加强免疫。第0、9、10周割尾采血,使用ELISA方法进行抗体效价测定,Westernblot验证抗体的特异性。结果表明:使用基因免疫的方法获得了针对Sj22的特异性抗血清,CpG佐剂能够有效降低质粒用量,基因免疫-蛋白加强的策略使得抗体的滴度提高了40～1280倍。