采用定量蛋白质组学技术筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关蛋白

淋巴道转移是上皮来源恶性肿瘤转移的早期阶段,其发生机制不清,一直是肿瘤学研究面临的难题,为寻找淋巴道转移相关蛋白,以一对来源于同一亲本细胞,且淋巴道转移潜能显著不同的小鼠肝癌腹水型细胞株为研究对象,其中Hca-F为高淋巴道转移力细胞株,Hca-P为低淋巴道转移力细胞株,采用定量蛋白质组学技术——荧光差异双向凝胶电泳,建立了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞荧光差异蛋白表达图谱,高通量筛选与肿瘤淋巴道转移相关的蛋白质.经DeCyde软件分析,共得到163个有统计学差异的蛋白质点,选择2倍以上的差异性蛋白质点23个,经质谱鉴定得到17个蛋白质,在Hca-F中高表达的蛋白质有7个:转羟乙醛酶、波形蛋白、肌酸激酶(脑)、膜联蛋白7、膜联蛋白5、烯酰辅酶A水合酶1(过氧化物酶体)、核内异质核糖核蛋白A2/B1异构体1.而在Hca-F中低表达的蛋白质有10个:真核翻译延长因子2、Ero1样蛋白、乙醛脱氢酶2(线粒体)、苹果酸盐脱氢酶2(NAD)、β-内酰胺酶2、谷胱甘肽S转移酶"1、泛素C末端水解酶同工酶L3、内质网蛋白29(前体)、溶血磷脂酶1、微管不稳定蛋白.这些差异性蛋白质的功能涉及到代谢、蛋白质分泌、蛋白质结合、核苷酸结合,钙离子结合、凋亡和调节生长等过程.对这些蛋白质功能的进一步验证,将有助于解析肿瘤淋巴道转移的分子机制.

核糖核酸酶抑制因子对小鼠S_(180)的抑制作用机制研究

目的研究核糖核酸酶抑制因子对小鼠实体瘤生长的影响以及ＲＩ抑制肿瘤生长的机理。方法经硫酸铵盐析，ＤＥＡＥ－离子交换层析和Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－ＲＮａｓｅ亲和层析，从人胎盘中提取纯化核糖核酸酶抑制因子（ｒｉ－ｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＲＩ），将其注射给荷瘤小鼠。５天后处死小鼠，取瘤组织，称重；组织切片后观察瘤内毛细血管、组织坏死状况及核分裂数的改变。结果注射ＲＩ后，小鼠实体瘤Ｓ１８０的生长受到抑制，瘤组织毛细血管减少，坏死加强。结论ＲＩ抑制肿瘤的血管生成。

PCNA、P16、MMP9在人参皂甙Rg3抗肝癌淋巴道转移中的表达及意义

目的 :通过检测PCNA、P16及MMP 9在人参皂甙Rg3抗荷瘤小鼠淋巴道转移中的表达 ,探讨人参皂甙Rg3抗肿瘤作用的机制。方法 :建立小鼠肝癌淋巴道转移模型 ,应用免疫组织化学方法检测PCNA、P16及MMP 9在各实验组 (Rg3预防组、Rg3治疗组、Rg3+DDP合用组、DDP阳性对照组和生理盐水阴性对照组 )的原发瘤及相应转移瘤 (淋巴结 )中的表达水平。结果 :应用人参皂甙Rg3组较未用药组 ,PCNA及MMP 9在原发瘤的表达减少 ,P16的表达增加 ,差异显著 (P <0 0 0 1) ;而在转移瘤中的变化不明显。结论 :人参皂甙Rg3抗淋巴道转移作用的机制与上调P16表达及下调PCNA和MMP9表达有关。

壳寡糖抑制肿瘤作用的研究

本文通过对几种寡聚糖对S180癌细胞的抑制作用试验,筛选出其中有较强抑瘤作用的壳寡糖。并对不同工艺制备的壳寡糖用体外抑瘤方法进行抑瘤活性比较,结果表明:3种壳寡糖中对癌细胞DNA合成的抑制作用效果最好的是C-Ⅲ-2,抑制率达98.5%。壳寡糖C-Ⅲ-2对多种肿瘤细胞体外的抑制作用试验表明:壳寡糖对肝癌细胞有明显抑制作用,抑制率平均达76%,高于顺铂组及对照组;同时对小鼠肝癌腹水细胞的生长也有一定的影响。

核糖核酸酶抑制因子基因在人乳腺癌中的表达及突变分析

目的 通过核糖核酸酶抑制因子 (ribonucleaseinhibitor,RI)基因在人乳腺癌中的表达及其是否突变的分析 ,进一步探讨RI与肿瘤细胞生长的关系。方法 采用Westernblotting方法检测人乳腺癌组织中RI的表达量 ;采用SSCP的方法分析肿瘤细胞RI基因中是否有突变。结果 人乳腺癌组织中RI的表达明显低于同体癌旁正常组织 ,但用MboI酶切及SSCP分析未发现人乳腺癌组织中RI基因有突变。结论 乳腺癌的生长可能与RI表达的下降有关 ,从而可能使癌组织周边新血管的形成未受到有效抑制的结果。

18种中草药中痕量锗的定量测定

用混酸（发烟硝酸＋浓硫酸）回流消化中草药样品，Fe（OH）3共沉淀富集锗，苯基荧光酮－溴化十六烷基三甲胺（CTMAB）胶束增溶分光光度法测定了18种中草药中的锗含量，灵芝和白花蛇舌草含量较高，分别为2．46和0．35μg／g。本法检出界限为193ng／g，变异系数为0．89％，在不同中草药中的回收率为91％～93％。

四种中药复方乙醇提取物对酪氨酸酶抑制作用的研究

目的将13味对酪氨酸酶具有不同抑制作用的中药根据中医理法组成4种方剂,观察中药复方对酪氨酸酶的影响,以探讨中医理法和实验药效的关系及其可能的作用机制,为临床优化组方提供实验依据。方法Ⅰ方,活血化瘀,柔肝疏肝,针对肝郁型;Ⅱ方,补气行气,健脾祛湿,针对脾虚型;Ⅲ方,补肾阴、补肾阳,针对肾虚型;Ⅳ方,补益气血,调和阴阳。通过离体实验测定中药复方对酪氨酸酶抑制率。结果实验结果显示,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ方显著抑制酪氨酸酶活性,按作用强弱依依次为Ⅳ、Ⅱ、Ⅰ方(P<0.05)。结论在临床治疗黄褐斑时,要选择具有实验药效的药物,但不可忽视中医理论的指导。

平滑肌肌球蛋白轻链激酶的非激酶作用及对ATP酶活性的调节

肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,以进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制.采用PCR技术构建MLCK部分氨基酸缺失的重组表达载体pGEX-F6·5/D,经大肠杆菌表达得到可溶性GST融合蛋白,利用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达的MLCK在细胞中的分布,结果还显示,提取液的上清和沉淀中均有MLCK片段的表达.运用亲和层析技术分离并纯化删除前、后表达的MLCK片段(F6·5和F6·5/D),经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B纯化,SDS-PAGE鉴定显示为单一表达条带.应用EnzChek磷分析试剂盒和孔雀绿两种方法分别测定不同浓度的MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响.两种MLCK的片段均具有激活ATP酶活性的作用,并随MLCK浓度的增加,酶的活性增加.比较删除前后不同MLCK片段对ATP酶活性的影响结果显示,删除MLCK片段1002位丙氨酸至1019位亮氨酸后,对ATP酶的激活作用较删除前明显降低,表明删除的部分氨基酸序列为MLCK非激酶活性所必需的区域.利用电镜技术观察到MLCK片段(F6·5)使非磷酸化肌球蛋白构象发生明显的变化.加入MLCK片段后肌球蛋白的构象由非活性型转化为活性型,并且MLCK片段还具有促进肌球蛋白单体形成肌丝的作用.

RI基因真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞生长的影响

目的 :通过构建核糖核酸酶抑制因子 (ribonucleaseinhibitor ,RI)基因的真核表达载体———pLNCX ri,并转染C6神经胶质瘤细胞 ,探讨RI抑制肿瘤生长的作用机制。方法 :用NdeI Xho从已构建的 pET ri上切下1.4kb的RI基因片段 ,再构建到 pLNCX上 ,获得真核表达载体 (pLNCX ri) ,采用LipofectAMINE辅助转染大鼠C6神经胶质瘤细胞 ,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆 ,用Westernblotting检测RI基因的表达水平。将转染阳性的C6神经胶质瘤细胞接种于大鼠皮下 ,观察肿瘤的生长情况。结果 :在转染的C6神经胶质瘤细胞中 ,RI基因的表达量明显高于未转染的C6神经胶质瘤细胞 ,转染阳性的C6神经胶质瘤细胞在大鼠体内的成瘤潜伏期 2 3±5 7天 (对照组 14± 3 5天 ) ,瘤组织重量 :转染组 1 35± 0 4 3g比对照组 2 4 0± 0 6 1g(P <0 0 1)明显下降 ,瘤组织的血管密度 :转染组 2 7 2± 4 31比对照组 47± 6 5 4(P <0 0 1)明显减少。结论 :RI基因的转染对肿瘤的生长有明显抑制作用 ,其作用机制可能是抑制肿瘤组织血管的形成。

六种中药复方乙醇提取物对酪氨酸酶激活作用及动物致色素作用的研究

目的探讨中医理法和实验药效的关系及其可能的作用机制,为临床治疗白癜风优化组方提供实验依据。方法离体实验为中药复方乙醇提取物对酪氨酸酶的影响;动物实验选用棕色豚鼠为模型,观察中药致色素作用。结果Ⅰ方、Ⅱ方、Ⅲ方、Ⅵ方对酪氨酸酶有激活作用(P<0.05);6种中药复方均使豚鼠表皮基底层中含黑素颗粒细胞增多(P<0.05);Ⅱ方、Ⅲ方、Ⅵ方中药使豚鼠表皮内Dopa阳性细胞增多(P<0.05)。结论对酪氨酸酶具有激活作用的中药组成复方并不一定对酪氨酸酶有激活作用;中药复方在离体和活体上的作用并不完全平行,提示中药对黑素生成的机理,不仅限于对酪氨酸酶的激活作用。

榄香烯对肝癌腹水瘤细胞系Hca-F_(25)/CL-16A_3的抗肿瘤作用机理研究——Ⅰ.对小鼠NK细胞毒性、巨噬细胞活性及脾细胞增殖的影响

本文研究了榄香烯对小鼠移植性肿瘤的作用。结果表明:用榄香烯针剂腹腔给药组和瘤内注射给药组的实体瘤重均明显地比对照组轻。两种途径给药的实验组小鼠 NK 细胞对 Hca-F_(25)/CL-16A_3细胞的毒性较对照组增强,腹腔巨噬细胞对该瘤株的杀伤力亦较对照组显著增强。实验组小鼠由 ConA 诱导的脾细胞增殖率较对照组显著增强。上述结果提示榄香烯可能具有增强细胞免疫功能,从而抑制肿瘤生长的作用。

基质金属蛋白酶酶谱分析法

基质金属蛋白酶酶谱分析法刘煜张嘉宁朱正美基质金属蛋白酶（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ＭＭＰｓ）是一组重要的蛋白水解酶，可以水解细胞外基质中胶原、纤维连接蛋白等多种成分［１］，参与了人体内许多生理和病理过程，如骨的重建［２］、肿瘤转...

放置IUD后异常出血子宫内膜的基质金属蛋白酶酶谱分析

本文应用酶谱法,观察了正常月经周期及IUD异常出血时子宫内膜.经5h组织块培养后分泌的MMPs.结果可见月经周期的三个不同阶段MMPs的表达明显不同.与增生期及分泌期酶活性比较,月经期酶活性及种类显著增加.IUD异常出血时,多种MMPs的活性明显低于正常月经期.结果提示置IUD后引起的月经期延长和出血量增加可能与子宫内膜中MMPs酶量减少及其活性降低有关.

在共培养体系中单克隆抗体AH_6对小鼠胚泡着床的影响

以单克隆抗体ＡＨ６［特异结合ＬｅＹ寡糖，Ｆｕｃα１２Ｇａｌβ１４（Ｆｕｃα１３）ＧｌｃＮＡｃ］以及其它３种与ＬｅＹ寡糖结构近似的寡糖特异结合的单克隆抗体αＬｅａ、αＬｅｂ和ＦＥＡ５为工具，采用小鼠体外着床模型，研究细胞表面ＬｅＹ寡糖抗原与着床的关系及其在着床过程中的具体作用环节。结果显示：不论子宫上皮细胞表面还是胚胎滋养层细胞表面的ＬｅＹ寡糖抗原被封闭后，都能导致胚胎在单层子宫上皮细胞表面粘附和扩展生长的延迟，但对胚胎最终的扩展程度并无影响，而其它３种单克隆抗体对胚胎的粘附则均无影响。说明这种作用具有明确的寡糖结构特异性。另外，运用免疫荧光方法观察到，胚胎在单层子宫上皮细胞表面的粘附与ＬｅＹ寡糖在细胞表面的消长密切相关。因而认为ＬｅＹ寡糖抗原在胚胎着床中可能是作为一种中介分子参与着床始发阶段的胚胎与母体间的识别和粘着。实验中经单克隆抗体处理后胚胎和单层子宫上皮细胞与对照组比较，其形态与发育未见不同。

黄芪对肝癌耐药细胞株Bel/Fu化疗敏感性的影响

目的:评估黄芪对肝癌耐药细胞化疗敏感性的影响,探讨黄芪对血红素加氧酶调节作用的可能机制。方法:黄芪注射液作用于Bel/Fu肝癌化疗耐药细胞株,分别应用MTT、免疫细胞化学、流式细胞术、RT-PCR检测细胞株对化疗药物敏感性、P-糖蛋白表达量、P-糖蛋白功能、血红素加氧酶(HO-1)核酸水平表达量。结果:黄芪注射液作用于Bel/Fu细胞诱导24h后,化疗药物半数抑制浓度显著降低;P-糖蛋白阳性表达明显减少,黄芪组罗丹明荧光曲线明显右移,细胞化疗药物外排功能降低;HO-1 mRNA表达显著减少。结论:黄芪注射液可增强肝癌耐药细胞株Bel/Fu的化疗敏感性,下调P-糖蛋白表达,降低P-糖蛋白药物外排功能,实现这种作用的同时伴随有HO-1 mRNA表达的减少。

双歧杆菌对大肠癌细胞ccL_(187)cAMP、cGMP影响的实验研究

双歧杆菌对维持机体正常微生态平衡具有重要作用。本文研究了长双歧杆菌对大肠癌细胞ｃＬ１８７内第二信使ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ浓度的影响，对长双歧杆菌的对数期培养物分别进行下列处理：活菌、死菌、代谢产物作用ｃｃＬ１８７细胞２小时后分别收集ｃＬ１８７细胞内的ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ浓度。实验表明长双歧杆菌的不同状态及代谢产物对ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ产生显著影响，且存在时间依赖关系，三种处理作用ｃＬ１８７细胞内的ｃＡＭＰ值分别为１９２０５±１１５１ｎｍｏｌ／Ｌ、１３７０８±１００３ｎｍｏｌ／Ｌ、２８９８８±１２３ｎｍｏｌ／Ｌ，与对照相比表现出有意义的增高，ｃＧＭＰ浓度变化不明显。结果提示长双歧杆菌及其代谢产物参与ｃｃＬ１８７细胞内的信息传递过程，且具有一定的协同作用。植物血凝素（ＰＨＡ）对ｃＬ１８７细胞表面神经节苷脂的封闭显示ｃＡＭＰ的有意义变化，结果提示双歧杆菌对ｃｌ１８７细胞ｃＡＭＰ可能是通过作用于细胞神经节苷脂受体而发挥作用的。

降低氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫模型死亡率的实验研究

[目的]探讨有效控制氯化锂-匹罗卡品诱发癫痫持续状态,提高癫痫大鼠存活率的最佳条件。[方法]选用SD大鼠30只,腹腔注射氯化锂和匹罗卡品后,诱发大鼠癫痫持续状态1 h后,随机分为A组：只给东莨菪碱;B组：东莨菪碱＋安定;C组：东莨菪碱＋水合氯醛。比较3组大鼠间癫痫发作的持续状态、癫痫大鼠的死亡率、死亡发生的时间。[结果]A组大鼠癫痫发作的持续状态为16-20 h,死亡率为87.5%;B组大鼠在用药后15 min内可控制癫痫发作的持续状态,死亡率为62.5%;C组大鼠在用药后3-10 min可完全控制大鼠的癫痫发作持续状态,大鼠全部存活。[结论]水合氯醛可有效控制氯化锂-匹罗卡品诱发大鼠的癫痫持续状态,提高癫痫大鼠的存活率。

肝复康对PDGF介导的肝星状细胞信号转导的分子机制

目的:通过观察中药肝复康含药血清对肝星状细胞(HSC-T6)细胞株Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA基因表达的影响。探讨其抗纤维化的作用机制。方法:常规方法制备肝复康含药血清,并用不同浓度肝复康含药血清干预HSC-T6细胞株,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察分析Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA mRNA表达的变化。以Western blotting检测ERK蛋白在不同干预情况下的表达。结果:经肝复康含药血清处理,可下调HSC-T6细胞株Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA mRNA表达以及ERK蛋白表达水平,不同浓度含药血清作用强度也有所不同。结论:中药肝复康对肝纤维化具有明显的抑制作用,其作用机制可能是通过非特异性干扰PDGF功能,抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA mRNA的转录,以达到抗纤维化的作用。