大肠杆菌芳香族氨基酸代谢工程研究进展

芳香族氨基酸包括L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-酪氨酸(L-Tyr)和L-色氨酸(L-Trp),是生物体内非常重要的必需氨基酸,具有重要的生物学功能,广泛应用于医药、食品和饲料等领域。本文中,笔者介绍了芳香族氨基酸的生物合成途径以及代谢调控,综述了构建大肠杆菌芳香族氨基酸生产菌株的代谢工程策略。针对现阶段工业化生产芳香族氨基酸存在的问题,笔者对进一步应用代谢工程策略改造芳香族氨基酸菌株进行了展望。

谷氨酸棒杆菌分支链氨基酸合成的转录调控

谷氨酸棒杆菌中存在复杂的转录调控系统,其调控机制不清晰的问题严重制约着代谢工程策略的选择与应用.目前,针对谷氨酸棒杆菌分支链氨基酸合成的转录调控网络展开了一系列研究,发现了诸多转录调控因子及其靶向调控基因,而其具体调控机制及不同调控模块间的相互作用仍有待进行深入研究.随着转录调控网络的深入研究,将为谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造提供更有方向性的指导.目前,对谷氨酸棒杆菌中心碳代谢、分支链氨基酸合成过程中重要转录调控因子进行了相应的介绍.

氨基酸生产菌株的研究热点及发展动向

我国氨基酸产品的产量和贸易量已居世界前列,但我国氨基酸的主要生产指标与国际先进水平仍存在一定差距,同时新型氨基酸产品及衍生品的开发能力不足。从发酵原料的可利用性、发酵能力的稳定性、发酵环境的耐受性、生产方式的可变性、生产产品的多样性等方面综述了氨基酸生产菌株的研究热点及发展动向。

组学技术在氨基酸生产菌株选育中的研究现状与发展趋势

系统生物学研究手段包括基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白组学和通量组学等,可以获得研究对象整体代谢途径、调控网络的信息.将组学技术应用于氨基酸的发酵菌株优化过程,可以为菌株的进一步代谢工程改造提供信息基础与理论指导.介绍各种组学技术在氨基酸微生物发酵研究中的应用与发展趋势,通过综合运用各种组学数据信息,可以更好地指导氨基酸发酵优良菌株的理性设计与构建.

微生物同步利用葡萄糖和木糖代谢工程概述

现阶段,随着资源枯竭和环境污染问题的日益突出,利用农业废弃物等木质纤维素原料发酵生产生物产品、生物能源和生物材料已经成为学术界和社会的共识.微生物同步利用葡萄糖和木糖是木质纤维素生物炼制的重要内容,同时也有利于提高芳香族氨基酸等产品的发酵性能.然而,由于碳分解代谢物阻遏(葡萄糖效应)的存在,大多数微生物并不具备这种特性,迫切需要采用代谢工程手段构建高效同步利用葡萄糖和木糖的菌株.首先对微生物同步利用葡萄糖和木糖的意义进行了说明,然后阐述了氨基酸和核苷生产菌大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌葡萄糖效应的分子机制和破除策略,同时介绍了一些能够同步代谢葡萄糖和木糖的工程菌株的实际应用.

代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,利用基因重组技术替换ilv LXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilv A和ilv IH,以期获得L-异亮氨酸生产菌。将ilv LXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilv LXGM后获得ILE01菌株,于该菌株中分别过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilv IH及共表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilv A和ilv IH,获得菌株ILE02和ILE03,其L-异亮氨酸产量分别达到1.75 g/L和2.19 g/L。针对ILE03α-酮丁酸积累量过高的问题,通过改变操纵子中ilv A和ilv IH的顺序调节其转录水平,获得菌株ILE04,其L-异亮氨酸产量达2.85 g/L。利用ILE04于5 L发酵罐中进行发酵实验,L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/(L·h)及4.6%。

生物法合成5-氨基乙酰丙酸的研究进展

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)是血红素、叶绿素等吡咯化合物生物合成的重要前体,在农业和医药上得到广泛应用.5-氨基乙酰丙酸的生物合成途径主要包括C4和C5途径.对5-氨基乙酰丙酸的合成途径和调控机制以及利用大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌通过C4途径和C5途径合成5-氨基乙酰丙酸的代谢工程研究进展进行了综述.

Fe^(2+)螯合剂对羟脯氨酸发酵的影响

为解决反式-4-羟基脯氨酸发酵过程中Fe^(2+)供应不足、产酸效率低等问题。该研究以大肠杆菌HYP-08为供试菌株,首先通过单因素实验探究Fe^(2+)螯合剂种类及添加量对羟脯氨酸发酵生产的影响,并通过5 L发酵放大验证,以羟脯氨酸产量、生物量,糖酸转化率为指标,进一步探究其在放大过程中的影响,结果表明葡萄糖酸亚铁对羟脯氨酸发酵效果最好,流加发酵生产中,最终确定了10 h开始持连续流加的补料方式,反式-4-羟基脯氨酸生物量及产量达到最高,分别为146.2、118.6 g/L,较优化前提高了12.1%和4.2%,副产物乙酸减少到1.05 g/L,葡萄糖酸亚铁的添加有效增强了菌体活力,提高了羟脯氨酸的产量和糖酸转化率,为微生物发酵生产羟脯氨酸提供了依据。

底物及底物处理方法对胞磷胆碱发酵的影响

以氯化胆碱、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠为底物发酵法生产胞磷胆碱的过程中,后期高浓度盐离子导致菌体活力下降甚至衰亡,是限制胞磷胆碱产业化的主要问题。该研究为解决这一问题,首先确定了不同底物对胞磷胆碱发酵的影响。其次为了消除Cl^(-)、K^(+)、Na^(+)对发酵的影响,分别使用电渗析法和离子交换树脂对底物进行预处理,探究二者的分离效率,结果得知离子交换树脂在效率以及成本上均优于电渗析法。因此为了实现胞磷胆碱大规模生产,在此基础上探究不同强度的离子交换树脂,实验确定了最适树脂型号、上样体积、上样浓度、洗脱液浓度、再生溶液类型以及树脂的稳定性,解决了后期高盐离子导致的高渗透压问题,使得以廉价原料高效生产胞磷胆碱成为可能。最后通过5 L发酵罐放大验证,以胞磷胆碱产量、生物量、糖酸转化率为指标,最终胞磷胆碱产量达到了32.1 g/L,糖酸转化率为25.4%,为目前国内发酵法生产胞磷胆碱的最高水平。与直接使用磷酸胆碱作为底物生产胞磷胆碱相比成本降低了85%,也证明了该次实验的可行性,对胞磷胆碱大规模工业化生产有一定的指导意义。

L-酪氨酸连续发酵工艺研究

当前工业上用微生物发酵法生产L-酪氨酸的工艺中,基本都是前期向发酵罐内加入基础培养基,中后期再流加各类营养物质,虽然整个发酵过程中减少了取料和放料的操作,保证发酵中物料不被浪费,但是,随着流加物质的不断增加,发酵液体系不断扩大,该过程在发酵后期需要不断地人为调控发酵参数,而人为调控中,难以避免调控参数波动,并最终影响发酵结果。因此,实验采用高效连续发酵,该工艺可以大大提高菌体活力,并且有效延长产酸高峰期,为了优化L-酪氨酸的高密度连续发酵生产工艺,通过对大肠杆菌TYR-05发酵培养,考察了L-酪氨酸发酵过程并且分析了菌体量、产酸量、产酸效率、糖酸转化率的情况,确定L-酪氨酸高密度连续发酵过程中接种量、糖速率、糖耗量、底糖浓度等关键条件,以达到高密度连续发酵工艺控制条件优化。实验结果表明在5 L发酵罐中,选择30%的种子接种量,发酵起始时,底物氯化胆碱浓度为1 g/L并每4 h向罐内流加0.2 g/L的氯化胆碱,发酵至12 h时,底糖耗尽,开始以12 g/(L·h)的补糖速率向罐内提供葡萄糖,并在此时开始放液,放液速率为0.13 L/h,使得装液量恒定在20%左右,发酵25 h时开始流加复合营养液,发酵35 h时最高菌体OD_(600)达到65,产酸量为55.8 g/L,糖酸转化率为25.4%,为L-酪氨酸连续发酵工业化生产提供了重要参考。

金属离子及生长因子对核黄素发酵影响的研究

为提高发酵法生产核黄素的产量,解决发酵培养基中原料消耗高,发酵时间长等问题,该研究对枯草芽孢杆菌生产核黄素的培养基进行了优化。通过单因素试验、正交试验、5 L发酵罐过程控制,以菌体生物量、核黄素产量、糖酸转化率及副产物有机酸含量为指标,确定了发酵生产核黄素金属离子及生长因子的添加量,即:CuSO_(4)·5H_(2)O_(4)g/L,FeSO_(4)·7H_(2)O 10.2 g/L,ZnSO_(4)6.2 g/L,磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)4.2 g/L和维生素H 6.2 g/L,同时确定使用持续流加生长因子的策略。最终实验组菌体生物量(OD_(600)值)达到了256.1,较未优化前提高了29.1%,核黄素最终产量为23.1 g/L,较未优化前提高了53.0%,糖酸转化率达到12%,同时减少了有机酸的生成量。研究结果显示,优化后的培养基显著提高了核黄素的产量以及糖酸转换率,实现了降本增效的目的。

B族维生素对大肠杆菌发酵生产乳清酸的影响

为提高大肠杆菌发酵乳清酸的产率和糖酸转化率,以大肠杆菌(Escherichia coli)Ora-6为供试菌株,在原有培养基的基础上,通过单因素试验及正交试验探究维生素B_(1)、维生素B_(3)、维生素B_(5)、维生素B_(6)、维生素B_(7)、维生素B_(12)几种关键B族维生素对菌体生长及产酸能力的影响,并确定最佳组合添加量为维生素B_(1)6.8 mg/L,维生素B_(3)4.8 mg/L,维生素B_(5)4 mg/L,维生素B_(6)3.4 mg/L,维生素B_(7)1.4 mg/L,维生素B_(12)4 mg/L。在此条件下,经5 L发酵罐验证对比,此时优化后的培养基菌体量(OD 600)、乳清酸产量、糖酸转化率分别为134.32、121.41 g/L和25.73%,较原始培养基分别增长了13.16%、15.47%、12.96%。同时研究确定了B族维生素采取从10 h持续流加的发酵优化策略,使得5 L发酵罐发酵乳清酸最终菌体量和产量分别达到148.23、138.2 g/L,为工业化发酵生产乳清酸提供了参考依据。

玉米小分子肽在赖氨酸发酵中应用探究及工艺优化

为了降低赖氨酸发酵生产过程中“三废”的排放,减少成分复杂的玉米浆对发酵液的影响,提高分离提取良品率,该研究优化了L-赖氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌LS260的发酵条件,通过氮源分析,采用近似等效替代法,使用玉米小分子肽替代玉米浆,通过5 L生物反应器发酵试验探究清洁发酵工艺的可行性,通过单因素试验、响应面优化试验进一步优化了培养基营养成分,结合营养适量流加发酵控制工艺,确定了最适合LS260的发酵条件。结果显示,通过氮源等效替代试验,赖氨酸产量为124 g/L,转化率提高至71.5%;通过营养适量流加工艺将产量提高至136 g/L,发酵上清液透光率提高至84.4%;由单因素试验、响应面法优化试验可知,生物素、KH_(2)PO_(4)的最适添加量分别为3.2 mg/L、4.11 g/L,最适接种量为25.49%。在试验所得的最适条件下,赖氨酸产量达到160.3 g/L,转化率达到71.5%。结果显示,最终产量和转化率与模型数值基本相符,发酵液上清液透明度大幅降低,为提取工艺进一步优化创造了条件,试验结果具有较好的工业应用前景。

氯化胆碱对大肠杆菌发酵生产L-酪氨酸的影响

为提高大肠杆菌发酵生产L-酪氨酸的产量和糖酸转化率,降低副产物积累,试验对发酵培养基中氯化胆碱添加量进行了优化,并在此基础上探究出新的发酵工艺。试验结果表明,氯化胆碱的最佳添加量为0.4 g/L,最佳的发酵工艺为底物与流加培养基中氯化胆碱的添加比例为3∶7,流加培养基的流加速度随罐内溶氧值的波动而变化,以维持营养物质亚适量状态的全营养流加工艺。经过优化后,L-酪氨酸产量及糖酸转化率分别达到55.7 g/L、24.1%,副产物乙酸和谷氨酸产量分别为0.32,1.56 g/L,与原发酵策略相比,不仅实现了L-酪氨酸产量及糖酸转化率不同程度的提升,且副产物乙酸、谷氨酸的积累也大幅度降低,为今后工业化发酵生产L-酪氨酸提供了一定的参考依据。

L-酪氨酸高密度流加发酵工艺研究

为实现L-酪氨酸的大规模生产,提高L-酪氨酸的产量和糖酸转化率,供试菌株为大肠杆菌TYR-05,通过单因素实验、正交实验、流加发酵优化实验,以菌体密度、L-酪氨酸产量、糖酸转化率及代谢副产物为指标,探究MgSO_(4)·7H_(2)O、磷酸二氢钾、谷氨酰胺、甲硫氨酸、维生素B_(12)、维生素H、磷酸吡哆醛对L-酪氨酸发酵的影响,最后确定适合L-酪氨酸发酵的培养基为MgSO_(4)·7H_(2)O_(2).0 g/L、KH_(2)PO_(4)2.5 g/L、维生素B_(12)2.0×10^(-3)g/L、PLP 1.0×10^(-3)g/L、维生素H 0.8×10^(-3)g/L,利用5 L发酵罐进行流加发酵生产,在初始发酵工艺的基础上,采用从10 h持续流加发酵的优化策略。实验结果表明,最高菌体密度达到65.0 g/L,L-酪氨酸产量为56.2 g/L,糖酸转化率为23.1%,乙酸作为副产物积累量减少到1.0 g/L,验证了L-酪氨酸高密度流加发酵策略的可行性,为L-酪氨酸及其他芳香族氨基酸的低成本、高效率工业化生产提供了一定的依据。

稀土元素对L-酪氨酸发酵的影响研究

目前工业上主要采取微生物发酵法生产L-酪氨酸,此工艺存在生产周期长、糖酸转化率低等问题。因此,该研究以发酵过程中菌体量、L-酪氨酸产量、糖酸转换率以及耗糖速率为指标,通过单因素实验和正交实验探究La^(3+)、Ce^(3+)、Nd^(3+)对L-酪氨酸发酵的影响并最终确定了稀土元素的添加组合,提高了菌体的活力,缩短了延滞期,延长了产酸高峰期。实验结果表明,向L-酪氨酸发酵培养基中添加80 mg/L La^(3+)、2 mg/L Ce^(3+)、0.3 mg/L Nd^(3+)对发酵有利。发酵耗时35 h,缩短了2.2%;最高菌体量达到80.3,提升了10.8%;产酸量达到55.7 g/L,提升了9.7%;糖酸转化率为23.4%,提升了6.4%。验证了添加稀土元素的可行性,为L-酪氨酸大规模工业化生产提供了依据。

磷酸盐和pH值协同调控大肠杆菌发酵合成5-羟基色氨酸

为了提高大肠杆菌合成5-羟基色氨酸能力,该研究设计构建了pSTV28-TPH150过表达质粒,增强了羟化酶基因TPH150的表达,以HTP10为出发菌株(代谢工程实验室保藏,专利号:CN202110714155.1),电转化pSTV28-TPH150质粒得到菌株HTP10-1,发酵结果显示,存在副产物L-色氨酸积累过多,质粒不稳定等问题,因此在初始发酵工艺的基础上,通过设计4个pH梯度进行发酵对比试验和4种不同磷酸二氢钾流加策略来探究最适发酵工艺。实验结果表明,在菌株HTP10-1发酵pH值为6.7,并于发酵培养基中添加1 g/L磷酸二氢钾,葡萄糖补料瓶中添加3 g/L磷酸二氢钾时,菌体比生长速率达到最优,发酵结束后5-羟基色氨酸积累量最高达到5.46 g/L,副产物L-色氨酸积累量减少到1.37 g/L,质粒丢失率较对照组减少32%,极大地提高了菌株HTP10-1的质粒稳定性,验证了磷酸盐与发酵pH调控菌体生长的可行性,对质粒工程菌的发酵控制具有重要参考意义。

磷酸盐与生物素最适浓度配比对谷氨酸发酵影响的研究

在L-谷氨酸发酵中,磷酸盐和生物素的添加量直接影响着谷氨酸棒状杆菌的菌体生长和菌体转型,生物素和磷酸盐的含量过多或过少都会直接影响L-谷氨酸的产量,为缓解这一问题,提出了调配磷酸盐与生物素的最适浓度配比(PV H)的策略控制发酵。为了确定发酵过程中生物素和磷酸盐的准确含量,利用单因素实验对磷酸盐与生物素的浓度配比进行调整,以找出最有利于菌体快速生长和细胞迅速转型的实验组。该实验设计生物素浓度梯度为4,10,14μg/L,磷酸盐浓度梯度为3,5 g/L,通过实验发现,当磷酸盐与生物素浓度配比为5∶14时,菌体量大,细胞转型快,产酸多,糖酸转化率高,在此条件下,最大OD 600 nm达到82,较其他组分别提高了24%、47%、50%、65%,最终的菌体量为74,较其他组分别提高了29.7%、48.6%、54%、72%,L-谷氨酸的产量为86 g/L,相较于其他组分别提高了30%、45.3%、54.6%、80%。同时,在最适PV H条件下常规发酵L-谷氨酸的实验中可以看出,其整体发酵水平高于其他非最适PV H组,该常规发酵实验中,L-谷氨酸产量高达178 g/L,转化率达到77%,对于谷氨酸发酵具有借鉴意义。

双底物指数流加和双阶段溶氧控制对谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸的影响

为了实现L-异亮氨酸的高效生产,提高谷氨酸棒状杆菌YILW生产L-异亮氨酸的产量和生产强度,在详尽分析磷酸盐和玉米浆初始浓度对L-异亮氨酸发酵影响的基础上采用了双底物(玉米浆、磷酸盐)指数流加与双阶段溶氧相结合的控制策略进行L-异亮氨酸发酵。结果表明,最佳磷酸盐和玉米浆浓度分别为1.5 g/L和35 mL/L,此条件下分批补料发酵菌体生物量和L-异亮氨酸产量分别为27.66 g/L和25.89 g/L。在生长阶段进行双底物指数流加并结合双阶段溶氧控制,发酵60 h菌体生物量和L-异亮氨酸产量分别为32.29 g/L和31.32g/L,较优化前分别提高16.73%和20.97%。

生物素及膜偶联间歇透析发酵对黄色短杆菌生产L-亮氨酸的影响

生物素作为微生物的生长因子,对生长速率、细胞膜通透性、代谢产物的生成等方面具有重要作用。为提高黄色短杆菌产L-亮氨酸产量,降低副产物生成,在30 L发酵罐水平研究了在培养基中添加20、50、80、120μg/L四种不同质量浓度生物素,对黄色短杆菌产L-亮氨酸的影响。结果表明:培养基中添加50μg/L生物素,黄色短杆菌发酵44 h,L-亮氨酸的产量最高,达到60 g/L,糖酸转化率为22%,副产物L-丙氨酸的质量浓度为8 g/L。在最适生物素浓度下,发酵36 h后,采用膜偶联间歇透析发酵工艺,发酵周期延长至56 h,L-亮氨酸的糖酸转化率为25%,较普通发酵工艺约提高13. 6%,副产物L-丙氨酸的浓度降低约71. 3%,L-亮氨酸的总产量提高了16. 7%。研究结果对提高糖利用率、降低副产物、提高生产效率等方面具有重要意义。