犬急性心肌梗死晚期再灌注对心肌Fas/FasL系统的影响及其可能的氧化应激机制

目的:探讨急性心肌梗死晚期再灌注对心肌细胞凋亡基因Fas/FasL表达的影响及其可能的氧化应激机制。方法:18条健康成年杂种犬,按随机方法分为3组,每组6条。晚期再灌注组:结扎冠状动脉前降支6 h后再灌注6 h;持续缺血组:开胸后6 h,结扎冠状动脉前降支6 h,不行再灌注处理;对照组:冠状动脉前降支只穿线不结扎持续12 h。免疫组化法检测梗死边缘区心肌Fas和FasL蛋白表达,TUNEL法测心肌细胞凋亡指数(AI),比色法测定心肌超氧化物歧化酶(SOD)活性、还原性谷胱甘肽酶(GR)活性、丙二醛(MDA)含量等。结果:心肌Fas和FasL蛋白表达以及细胞凋亡指数在持续缺血组和晚期再灌注组明显高于对照组(分别为P<0.05,P<0.01),而且晚期再灌注组明显高于持续缺血组(P<0.05)。持续缺血组和晚期再灌注组的心肌细胞SOD活性和GR活性明显低于对照组(分别为P<0.05,P<0.01),而MDA含量均明显高于对照组(P<0.05),并且两组之间亦有显著差别(P<0.05)。结论:AM I晚期再灌注使梗死边缘区心肌细胞Fas/FasL蛋白表达以及细胞凋亡指数增加,提示晚期再灌注仍然存在再灌注损伤,其机制可能与氧化应激有关。

阿尔茨海默病的执行功能障碍与ApoE基因相关性研究

目的了解阿尔茨海默病(AD)的执行功能障碍的临床特征以及与ApoE基因多态性的相关性。方法采用简易痴呆筛选量表(MMSE)、汉密尔顿抑郁量表(HAMD)、Fuld物体记忆测验(FOM)、词语流畅性测验(RVR)、日常生活行为量表(ADL)、画钟测验(CDT)及Hachinski缺血积分量表等认知功能测评及ApoE基因检查。结果认知功能检查显示:AD患者的记忆、执行功能、计算力较健康对照组有显著性差异,结合ApoE基因检查显示带有e4者认知功能损害更明显。结论AD的认知功能较健康对照组明显减退,且带有ApoEε4者损害更严重。ε4是AD的风险基因。

迟发性阿尔茨海默病的肿瘤坏死因子-αG-308A基因多态性研究

目的 探讨迟发性阿尔茨海默病的肿瘤坏死因子-α G-308A基因多态性.方法 将57例迟发性阿尔茨海默病患者设为研究组,抽取52例健康志愿者设为对照组,采用聚合酶链反应、限制性片段长度多态性方法检测两组肿瘤坏死因子-α G-308A多态性. 结果 两组脂蛋白E-4等位基因分布显著不同（χ2=19.39,P〈0.01）,脂蛋白E-4等位基因携带者罹患迟发性阿尔茨海默病风险很高（OR=2.49,95%CI 1.53-4.07,P〈0.01）;肿瘤坏死因子-αAA基因与脂蛋白E-4等位基因的交互作用致迟发性阿尔茨海默病风险增高（χ2=6.34,P〈0.05）;研究组脂蛋白E-4等位基因非携带者中,AA、AG基因型频率,A-等位基因频率显著高于对照组（χ2=5.26、4.58,P〈0.05）. 结论 肿瘤坏死因子-α G-308A基因多态性可能增加迟发性阿尔茨海默病发病风险,同时这种多态性与脂蛋白E-4等位基因状态有关.

二重实时PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的建立二重实时聚合酶链反应(duplex real-time PCR)快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。方法采用二重SYBR Green实时PCR快速检测MRSA的决定基因mecA和金葡菌的种特异性基因nuc,经熔解曲线分析鉴定产物。结果所有MRSA菌株的熔解曲线均呈现mecA、nuc基因特异性的峰,甲氧西林敏感的金葡菌仅有nuc峰,耐甲氧西林的表葡菌仅有mecA峰,甲氧西林敏感的表葡菌与其他菌种的菌株无特异峰出现;当MRSA菌浓度达102cfu/ml时就可检出。在131株金葡菌中,30.53%(40/131)耐药;二重实时PCR扩增mecA基因29.01%(38/131)阳性,nuc基因100%阳性。单引物与二重实时PCR两者阳性扩增符合率为100%。结论对mecA、nuc基因进行二重实时PCR能准确、快速地鉴定耐甲氧西林的金葡菌和凝固酶阴性的葡萄球菌。

大鼠Neurogenesin-1基因真核表达载体的构建及在cos-7细胞中的表达

目的克隆大鼠海马中Neurogenesin-1(Ng1)基因片段,构建pSecTag2/HygroB-Ng1真核表达载体,并检测其在cos-7细胞中的表达,为进一步研究该基因对脊髓神经干细胞分化的影响提供实验依据。方法在无RNA酶污染的条件下提取出大鼠海马总RNA。利用逆转录聚合酶链反应扩增出Ng1基因片段。将该基因片段连接到真核表达载体pSecTag2/HygroB,聚合酶链反应初步筛选,双酶切鉴定后送测序。将构建成功的重组真核表达载体转染入cos-7细胞,Westernblot鉴定重组Ng1蛋白的表达。结果逆转录聚合酶链反应成功获得大鼠Ng1cDNA。随机挑选10个重组真核表达载体的克隆,聚合酶链反应筛选出阳性克隆2个,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功。脂质体介导转染cos-7细胞48h后,Westernblot鉴定重组Ng1蛋白在cos-7细胞中的表达,在46ku处出现阳性条带。结论大鼠海马Ng1基因的真核表达载体pSecTag2/HygroB-Ng1构建成功,转染cos-7细胞后能够表达重组Ng1蛋白。

内皮型一氧化氮合酶基因疗法防治小血管吻合口血栓形成的实验研究

目的探讨内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase,eNOS)基因局部转基因表达对小血管吻合口血栓形成的影响。方法大鼠30只,随机分为实验组和对照组,切断大鼠双侧股动脉,行原位端端吻合,并向吻合口血管腔内注入真核表达载体pcDNA3.0-eNOS质粒与脂质体Lipofectin 2000的混合溶液(实验组)或真核表达载体pcD-NA3.0质粒与脂质体Lipofectin 2000的混合溶液(对照组),使之在腔内滞留30min。术后d5在两组中随机各取5只大鼠,切取以吻合口为中心,长1.5cm股动脉,将其分成3等份,每份0.5cm,分别行RT-PCR、Western blotting和组织化学法检测以了解eNOS表达情况。其余大鼠于术后14d处死,切取以吻合口为中心0.5cm长血管段行病理形态学检测。结果试验组RT-PCR在591bp处出现明显条带;Western blotting检测试验组eNOS含量分别为0.517±0.140,明显高于对照组0.248±0.062.;组织化学法检测试验组一氧化氮(nitric oxide,NO)含量(7.6±0.3)μmol/L,明显高于对照组(2.4±0.2)μmol/L。实验组吻合口血栓出现率明显低于对照组(P<0.01)。结论脂质体介导的携带eNOS基因的真核表达载体可以在小血管吻合口中成功表达,并且能有效地防止小血管吻合口血栓的形成。

小鼠Wnt-3a基因在NIH3T3细胞中的表达及其活性的初步分析

目的:表达具备生物活性的重组小鼠Wnt-3a信号蛋白.方法:应用脂质体转染试剂将重组真核表达载体pSecTag2/HygroB-Wnt3a转染并筛选稳定表达的NIH3T3细胞,WesternBlot鉴定重组Wnt-3a蛋白的表达,并对Wnt3a/NIH3T3细胞的融合密度及抗凋亡能力给予检测.结果:Wnt-3a信号蛋白在Wnt3a/NIH3T3细胞中获得稳定表达,Wnt-3a信号蛋白能够明显提高NIH3T3细胞的融合密度及抗凋亡能力.结论:在NIH3T3细胞中表达的重组Wnt-3a信号蛋白具备生物活性.

小鼠Wnt-3a基因真核表达载体的构建及其在cos-7细胞中的表达

目的:克隆小鼠胚脑中Wnt-3a基因片段,构建pSecTag2／Hygro B-Wnt3a 真核表达载体,观察其在cos-7细胞中的表达,为基因治疗脊髓损伤提供实验依据。方法:实验于2004-09／2005-03在安徽医科大学分子生物学实验室完成。选取清洁级孕13．5 d的KM小鼠1只,脱颈处死,冰冷条件下迅速取出胚鼠,解剖显微镜下剥离胚脑,在无RNA酶污染的条件下迅速提取胚脑总RNA。利用反转录聚合酶链方法扩增小鼠胚脑Wnt-3a基因片段,将该基因片段克隆入T载体,聚合酶链反应法筛选并测序,双酶切后构建重组真核表达载体pSecTag2／Hygro B-Wnt3a。转染并筛选稳定表达的cos-7细胞,Western blot鉴定重组Wnt-3a蛋白的表达。结果:①反转录聚合酶链反应获得目的基因小鼠Wnt-3a cDNA:自胚鼠脑组织总RNA经反转录聚合酶链反应扩增后,凝胶电泳可见约1．1kb的特异性扩增片段,与预期获得产物大小相符。②pMD18-T/Wnt3a克隆质粒聚合酶链反应初步筛选与测序:测序报告所克隆的Wnt-3a为1 058 bp,通过Blast同源性分析,与GeneBank收录的序列一致,克隆小鼠Wnt-3a 基因获得成功。③真核表达载体pSecTag2／Hygro B-Wnt3a的双酶切及测序:随机挑选10个克隆,聚合酶链反应扩增筛选出阳性克隆5个,经 XhoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定、测序及。Blast分析鉴定重组质粒构建成功。④Western Blot鉴定重组小鼠Wnt-3a蛋白在cos-7细胞中的表达:脂质体转染cos-7后48 h,Western Blot鉴定出在细胞内存在Wnt-3a蛋白的表达,转染pSecTag2／Hygro B-Wnt3a的cos-7细胞裂解液在45KD处出现阳性条带,而培养上清中未能检测到蛋白的表达。结论:小鼠胚脑Wnt-3a基因的真核表达载体pSecTag2／Hygro B-Wnt3a 构建成功,转染cos-7细胞后能够表达重组Wnt-3a蛋白。

兔缺血预适应心肌中环氧化酶-2的表达及阿司匹林的影响作用

目的 观察兔晚期缺血预适应 (DPC)心肌中环氧化酶 2(COX 2)的表达量以及不同剂量阿司匹林对其影响。方法 新西兰兔 32只,随机分为 4组,DPC组(A组,n=8);正常对照组 (B组,n=8 );小剂量阿司匹林 ( 10mg/kg) +DPC组(C组,n=8);大剂量阿司匹林 (20mg/kg) +DPC组(D组,n=8)。结扎兔冠状动脉左前降支建立缺血预适应模型, 24h后取心肌组织,使用Western blotting及免疫组化方法分别测定兔DPC心肌中COX 2的表达。结果 兔DPC心肌COX 2表达量比对照组明显上升,差异有显著性 (P<0 01);实验前分别给予小、大剂量阿司匹林对COX 2表达量影响较小,差异无显著性(P>0 05)。结论 兔DPC心肌中COX 2明显表达,缺血预适应分别前予小、大剂量阿司匹林对COX 2表达量影响较小。

阿尔茨海默病精神行为障碍与载脂蛋白E基因研究

目的:了解阿尔茨海默病(AD)精神行为障碍的临床特征以及与载脂蛋白E(ApoE)基因多态性的相关性。方法:共收集AD患者48例,正常对照者50例,采用阿尔茨海默病行为病理评定量表(BEHAVE-AD)进行精神行为测评,用聚合酶链反应法(PCR)进行ApoE基因分型。结果:AD患者在偏执和妄想、幻觉、行为紊乱和攻击行为方面与正常对照组比较差异有显著性;而ApoE基因检查结果显示携带ApoE ε4基因的AD患者精神行为障碍更为明显。结论:ApoE ε4是AD的风险基因,对携带有ApoE ε4的AD患者应早期干预和治疗。

甲状腺激素受体相互作用因子4基因多态性与阿尔茨海默病的相关性研究

目的 探索甲状腺激素受体相互作用因子4 （TRIP4）基因rs4776494多态性与阿尔茨海默病的相关性.方法 运用病例对照研究设计,收集安徽及周边地区77例拟诊为阿尔茨海默病患者和80例正常健康对照.通过聚合酶链反应（PCR）及测序的方法,比较病例组和对照组TRIP4rs4776494的等位基因及基因型频率的差异.并对每例研究对象进行简易精神状态检查表（MMSE）、临床痴呆评定量表（CDR）、痴呆伴精神行为异常（BPSD）量表检测.结果 TRIP4基因rs4776494的TT、CT和CC基因型在病例组和对照组中的频率公布[TT、CT、CC基因频率分别是AD组：57/77（74.02％）、18/77 （23.38％）、2/77（2.6％）;正常组：38/80（47.5％）、39/80（48.75％）、3/80（3.75％）]均差异有统计学意义（P＜0.01）.病例组中TRIP4基因携带者BPSD出现率明显高于非携带者（P＜0.05）.结论 TRIP4（rs4776494）T型等位基因是AD的风险基因.TRIP4基因可能在一定程度上促进了患者精神症状的发生.

成体小鼠脊髓实质神经干细胞的分离培养及其多能性的鉴定

目的从成年小鼠脊髓实质中分离培养并鉴定成体神经干细胞。方法采用无血清培养基及单细胞克隆技术,从成年小鼠脊髓实质中分离培养获得大量具备单细胞克隆能力的细胞,经免疫荧光染色证实单克隆细胞表达Nestin抗原并在分化后表达各种特异性的神经细胞抗原。结果从成年小鼠脊髓实质中分离培养获得的具备连续克隆能力的细胞可表达神经干细胞的Nestin抗原,并且分化后表达神经元及胶质细胞的特异性抗原。结论成功地从成年小鼠的脊髓实质中分离出具备增殖分化能力的成体神经干细胞,为进一步利用其进行脊髓损伤治疗的研究提供了实验基础。

Neurogenesin-1基因促进脊髓损伤后功能修复的实验研究

目的探讨Neurogenesin-1（Ng1）基因对脊髓损伤后功能恢复的影响。方法将36只大鼠随机分为实验组和对照组，每组18只。采用改良Allen法制备大鼠胸10脊髓损伤模型后，通过Alzct微泵分别向实验组和对照组持续转染入Ng1重组质粒和空白质粒。术后各时间点BBB评分系统监测大鼠运动功能恢复情况，并于术后第2周和第4周时分别取材，应用神经细胞特异性免疫荧光双标染色和组织学观察Ng1基因对内源性神经干细胞分化的影响以及脊髓组织病理变化情况。结果自损伤后1周起实验组大鼠的BBB评分明显高于对照组。组织学观察实验组脊髓形态恢复较好逐渐趋于正常。实验组脊髓组织中新分化的神经元细胞数较对照组明显增多，同时新分化的星型胶质细胞数显著减少。结论Ng1基因能够诱导脊髓损伤后内源性神经干细胞分化为神经元，促进脊髓运动功能的修复。

Neurogenesin1基因对脊髓损伤大鼠运动功能的影响及机制探讨

目的观察Neurogenesin1(Ng1)基因对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响,并初步探讨其可能机制。方法4月龄SPF级SD大鼠36只,体重约230g,雌雄不限,随机分为实验组和对照组(n=18)。采用改良Allen法制备大鼠T10脊髓损伤模型,通过Alzet微渗透压泵分别向实验组和对照组持续转染重组Ng1质粒和空白质粒各5μg。术后1d及1、2、3、4周采用BBB运动功能评分系统检测大鼠运动功能恢复情况;术后1周分别采用RT-PCR和Western blot方法检测Ng1mRNA及蛋白的表达;并于术后2、4周采用免疫荧光双标染色和组织学观察Ng1基因对内源性神经干细胞增殖的影响以及脊髓组织病理变化情况。结果自术后1周起实验组BBB评分明显高于对照组(P<0.05);术后4周实验组运动功能评分为(16.80±1.79)分,对照组为(9.60±1.67)分,差异有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR和Western blot方法检测显示实验组大鼠脊髓组织均见Ng1mRNA与蛋白的表达,对照组无表达。组织学观察示实验组脊髓结构以及神经元形态恢复较好且逐渐趋于正常,且免疫荧光双标染色示实验组脊髓组织中新增殖的神经干细胞数较对照组明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Ng1基因能够诱导脊髓损伤后内源性神经干细胞大量增殖,保护受损伤神经元,促进脊髓运动功能修复。