基于模式生物斑马鱼模型的中药药效物质筛选技术及应用

目的作为一个复杂成分体系,中药药效物质的精准辨识和筛选是中药现代化研究的一个瓶颈问题,探索新的实验技术十分重要。方法斑马鱼是新兴的模式生物,具有体外受精、胚胎透明,不需要解剖可方便在显微镜下观察组织器官的发育等生物学优势,可在细胞板中完成实验,需要样品量少,已被欧洲替代法验证中心推荐为新的替代动物。斑马鱼全基因组测序结果显示斑马鱼与人的基因组相似性达87%,大量的研究表明斑马鱼对药物反应与临床反应也高度相似,为斑马鱼应用于研究人类疾病与药物筛选奠定了理论和实践基础。本实验室利用斑马鱼模型构建了较为齐全的中药药效物质筛选的技术体系,并对甘草、阿胶、栀子、乳香等传统中药进行药效或毒性成分的筛选辨识研究。结果本实验室利用斑马鱼模型建立了可涵盖肿瘤、心血管、神经系统、骨骼、皮肤、重要器官等的活性/毒性筛选技术平台。从前期大规模的筛选中,发现甘草具有一定的抗肿瘤作用,进一步利用斑马鱼活性跟踪技术和高速逆流色谱分离技术,发现了2个未报道的抑制血管生成的活性成分。新阿胶是山东福胶集团的独家品种,是以猪皮为来源,作为阿胶的替代品,但是现代药理学数据缺乏导致市场认可度低,因此我们利用斑马鱼模型系统开展了新阿胶的化疗损伤后的“扶正”与“生血”的作用机制。中药栀子临床发现具有防治血栓的功效,但是抗血栓的药效标志物并不清楚,作者采用斑马鱼模型整合代谢组学技术,发现3个代表性的抗血栓成分。乳香在历代典籍中具有“孕妇慎服”记载,但是原因不明,我们利用斑马鱼模型构建发育毒性模型,并结合灰色关联度分析法,证明乳香具有一定的发育毒性,并发现了潜在的毒性靶器官,并发现了主要的毒性效应成分。结论斑马鱼作为一种新型的模式生物,在中药药效物质筛选、活性评价、毒性预警方面都具有广阔的应用前景。

基于斑马鱼模型的纯绿青霉醇抗炎活性研究

目的利用斑马鱼急性炎症模型,对纯绿青霉醇(viridicatol)抗炎作用及其机制进行初步研究。方法采用硫酸铜(CuSO4)构建斑马鱼急性炎症模型,评价纯绿青霉醇的抗炎活性。将炎症状态下的斑马鱼(3 dpf)暴露在不同浓度的纯绿青霉醇(30、60和90μg/mL)中2 h,布洛芬(ibuprofen,IBF)作为阳性对照,观察斑马鱼神经侧线炎症细胞迁移和聚集的数量变化情况并计算荧光强度;利用RT-PCR技术测定各组斑马鱼炎症相关基因的转录水平。结果与炎症模型组相比,布洛芬组和纯绿青霉醇组斑马鱼炎症细胞迁移和聚集的数量以及荧光强度均显著降低,同时30、60、90μg/mL剂量下的纯绿青霉醇能显著提高pparγ的mRNA表达水平,抑制炎症相关因子iκbαa、ap-1、nf-κb、il-1b、il8、ptges和myd88的mRNA表达。结论本研究通过建立斑马鱼急性炎症模型探究了纯绿青霉醇的抗炎作用,首次发现其机制可能是纯绿青霉醇激活pparγ表达,抑制nf-κb和ap-1转录活性,降低炎症因子表达,从而缓解炎症,为纯绿青霉醇的应用开发提供了新思路。

一株海绵共附生青霉Penicillium sp.的次级代谢产物研究

目的研究海绵共附生青霉Penicillium sp.LHW5975的化学成分。方法采用减压硅胶柱色谱、十八烷基硅烷键合硅胶填料(ODS)中压柱色谱和半制备高效液相色谱等技术进行分离纯化,得到的单体化合物通过高分辨-电喷雾-质谱(HRESI-MS)、核磁共振波谱(NMR)以及与文献比对等方法进行鉴定。对分离得到的化合物进行斑马鱼促血管生成活性评价。结果从Penicillium sp.LHW5975中分离纯化出9个生物碱类化合物,包括1个新的化合物,命名为青霉吲哚碱甲(1);以及8个已知化合物,分别为17-羟基短密青霉酰胺N(2)、苯并玛尔维碱A(3)、苯并玛尔维碱B(4)、苯并玛尔维碱C(5)、苯并玛尔维碱D(6)、苯并玛尔维碱E(7)、(−)-苯并玛尔维碱E(8)和N-甲基诺喔苯并玛尔维碱A(9)。化合物2和7在50µg/mL质量浓度下对斑马鱼节间血管的生长有促进作用。结论化合物1为新化合物,化合物2和9为青霉属内首分化合物,化合物2和7具有一定的促血管生成活性。

三峡阳菊叶水提物的抗炎作用研究

目的利用斑马鱼炎症模型,评价三峡阳菊叶水提取物(WELTGY)的抗炎作用并对其机制进行初步研究。方法选取受精后3 d(3 dpf)的转基因斑马鱼移入6孔板中,设置对照组(胚胎培养用水)、模型组(胚胎培养用水)和WELTGY 0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL组,作用3 h后,向除对照组外的其他组中分别加入硫酸铜,终浓度为20μmol/L,作用1 h后在荧光显微镜下观察转基因品系Tg(zlyz:EGFP)斑马鱼体内炎症细胞迁移情况;应用DCFH-DA活性氧(ROS)探针对AB野生型斑马鱼染色,观察荧光强度;实时荧光定量PCR(q RT-PCR)测定野生型斑马鱼炎症相关基因的mRNA水平。结果与模型组比较,0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL WELTGY组斑马鱼中迁移至侧线部位的炎症细胞数量显著减少(P<0.01),斑马鱼荧光强度明显降低,ROS含量减少。与模型组比较,0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL WELTGY组过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的mRNA表达显著升高(P<0.05、0.01),核因子抑制蛋白A(IκBαA)、激活蛋白-1(AP-1)的mRNA表达显著降低(P<0.01),炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和前列腺素E2合成酶(PTGES)、髓样分化因子(MyD88)、环氧化酶(COX)-2的mRNA表达显著降低(P<0.01);1.6、3.2 mg/mL WELTGY组核转录因子(NF-κB)的mRNA表达显著下降(P<0.05、0.01);1.6 mg/mL WELTGY组IL-12α的mRNA表达显著下降(P<0.01)。结论通过构建斑马鱼急性炎症模型验证了WELTGY具有抗炎作用,其机制可能是WELTGY抑制ROS释放,激活PPARγ表达,抑制NF-κB和AP-1转录活性,降低炎症因子表达,从而缓解炎症,为三峡阳菊叶在饲料添加剂中的应用提供参考。