温度对豆瓣酱发酵过程理化指标、风味物质和微生物群落的影响

该文通过设置恒温豆瓣酱发酵实验,考察不同温度对豆瓣酱发酵过程中理化指标、风味物质、生物胺和微生物群落组成的影响,并与自然温度发酵豆瓣酱进行比较。结果发现,温度的提高有利于氨基酸态氮和还原糖的积累,同时促进了游离氨基酸和挥发性风味物质的形成,且能降低酱醅中食源性致病菌的丰度;然而,较高的温度同样会导致酱醅中总酸含量和生物胺含量偏高。发酵后,40℃发酵组中的氨基酸态氨、还原糖、挥发性风味物质和生物胺含量分别为1.02 g/100 g、12.07 g/100 g、25.65 mg/kg和54.10 mg/100 g,自然发酵组中的各物质含量分别为0.95 g/100 g、11.70 g/100 g、16.74 mg/kg和43.52 mg/100 g。因此,与自然发酵相比,提高发酵温度能够加速豆瓣酱发酵成熟,但是需要进一步的工艺优化消除总酸和生物胺偏高的风险。

豆瓣酱工业发酵过程中生物胺的生成规律

为了探究豆瓣酱工业发酵过程中生物胺的生成规律,对工业规模豆瓣酱发酵全过程中生物胺含量进行检测分析,并结合豆瓣酱发酵过程中的理化指标及氨基酸含量进行相关性分析。结果表明,豆瓣酱工业发酵过程中产生的主要生物胺为腐胺、亚精胺与精胺。腐胺在制曲结束后,达到峰值134.96 mg/kg,后逐渐下降;亚精胺与精胺制曲阶段下降,随着发酵时间的延长逐渐上升。Pearson相关性分析表明,在豆瓣酱工业发酵过程中,生物胺与理化指标间具有一定的相关性,除了精氨酸与腐胺和亚精胺之间有显著相关性之外,其余生物胺与其前体氨基酸之间的相关性并不高。

基于高通量扩增子测序技术解析中高温大曲微生物来源

基于高通量测序技术分析中高温大曲及其制作环境的微生物群落结构,利用微生物溯源追踪技术对发酵开始时大曲中的微生物来源进行分析。研究结果表明,从曲室外到曲室内环境样品中的微生物逐渐被选择、富集。从大曲发酵开始到结束,细菌群落的多样性增加,而真菌群落的多样性降低。发酵开始时大曲中细菌以魏斯氏菌属(Weissella)为主,发酵结束大曲中细菌以乳杆菌属(Lactobacillus)为主;在发酵开始和结束时大曲中的真菌以曲霉属(Aspergillus)和根霉属(Rhizopus)为主。发酵开始的大曲中细菌89.3%来自于原料,5.6%来自于室内草席;大曲中53.7%真菌来自于室外地面,23%真菌来自于室内屋顶。该研究解析了中高温大曲微生物的来源,为优化制曲工艺提供理论依据。

pH-DO组合调控策略提高小白链霉菌ε-聚赖氨酸的生物合成

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是一种主要由小白链霉菌生产的广谱性天然食品防腐剂,具有广泛的工业应用价值。该研究对ε-PL高产菌Streptomyces albulus WG-608在5 L罐发酵不同阶段的pH与溶解氧(dissolved oxygen, DO)进行了系统优化,并构建了一种新的pH-DO组合调控策略。该策略将发酵分为2个阶段:第一阶段DO被控制在40%,pH维持在4.0;第二阶段DO被控制在20%,pH维持在4.3。经240 h的补料-分批发酵,WG-608的ε-PL产量与平均比生产速率为(68.77±2.53) g/L和(2.33±0.08) d-1,比对照策略分别提高了28.23%和12.02%。为进一步探究该策略提高WG-608 ε-PL产量的细胞生理代谢差异的原因,对不同时期细胞的关键酶活力、呼吸链活力和辅因子水平等进行了分析。结果表明,葡萄糖消耗、中心碳代谢途径、L-赖氨酸生物合成途径、呼吸链活性和胞内辅因子的增强是pH-DO组合调控策略增强ε-PL产量的原因。总之,pH-DO组合调控策略是一种通过增强碳代谢和能量代谢提高ε-PL产量的有效方法。该方法的建立为其他链霉菌发酵生产ε-PL提供了新的思路。

淀粉液化芽孢杆菌BS5582产蛋白酶的发酵条件优化、酶学性质分析及其在牛皮脱毛中的应用

该研究旨在优化1株高产蛋白酶淀粉液化芽孢杆菌BS5582的产酶条件,分析其酶学性质,并考察其在牛皮脱毛工艺中的应用效果。结果表明,BS5582菌株的较优产酶培养基组成为(g/L):玉米粉50.0,豆饼粉40.0,Na_(2)HPO_(4)·12H_(2)O 6.0,KH_(2)PO_(4)3.0,MgSO_(4)1.8,CaCl_(2)0.75;培养基初始pH 6;较优发酵条件为:发酵温度35℃,接种量10%,装液量15 mL。在较优条件下,该菌株产蛋白酶活力达到(5270.59±19.61)U/mL,是优化前的21倍。BS5582菌株所产蛋白酶的最适温度和最适pH值分别为40℃和8.5,Mn^(2+)对酶有明显激活作用,而Fe^(2+)、Fe^(3+)和苯甲基磺酰氟对酶活力有显著抑制作用。将该酶应用于牛皮脱毛,发现其具有良好的牛皮脱毛能力且胶原损伤小。相比于传统灰碱法脱毛,该蛋白酶脱毛后牛皮毛孔中无发根残留,毛发完整脱落,脱毛废水的污染指标总固体悬浮物、化学需氧量和五日生化需氧量值分别比化学脱毛法降低约87%、39%和45%,这说明BS5582菌株产蛋白酶具有潜在的清洁脱毛应用价值。

非酿酒酵母与酿酒酵母在米酒混菌发酵中的相互作用机制分析

该研究以传统米酒酿造中常见的两种典型非酿酒酵母,假丝酵母(Candida glabrata,Ca)和扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera,Sf)为研究对象,利用同时接种和顺序接种两种发酵方式分别与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,Sc)进行米酒混菌发酵,探究非酿酒酵母和酿酒酵母间的相互影响及相关作用机制。研究结果表明,虽然2种混菌发酵方式表现出明显不同的发酵特性,但在混菌发酵过程中,当Sc生物量达到一定水平(约107 CFU/mL)后,2株非酿酒酵母的生长均受到显著的抑制,生物量快速下降,而Sc生物量基本未受非酿酒酵母的影响。细胞非接触发酵实验结果表明,一定浓度的Sc与非酿酒酵母的细胞-细胞接触是产生抑制的主要原因。Sc发酵代谢物以及酒精和营养物质含量对非酿酒酵母的生长影响不大。

基于低pH适应性进化策略提高小白链霉菌ε-聚赖氨酸合成能力

小白链霉菌(Streptomyces albulus)是ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)的工业生产菌,其在发酵生产过程中遭受低p H胁迫,易造成ε-PL合成能力下降。因此,该文采用一种逐级增加选择压力的低p H适应性进化策略,经过连续93 d的适应性进化,实现S.albulus GS114耐受p H值由4.0降低到3.6。经过大量筛选,获得了低p H适应性进化菌株S.albulus ALE4.0、S.albulus ALE3.8和S.albulus ALE3.6;结合低p H耐受性和摇瓶发酵实验,确定最优适应性进化菌株为S.albulus ALE3.6。进一步考察不同p H值对S.albulus ALE3.6合成ε-PL的影响发现,S.albulus ALE3.6在不同p H值条件下,较出发菌株S.albulus GS114均表现出发酵优势。最后,采用恒定p H 4.0补料分批发酵方式,在5 L发酵罐水平实现S.albulus ALE3.6的ε-PL产量达到43.7 g/L,较出发菌株提高了63%。研究结果一方面表明通过适应性进化方法可以显著提高S.albulus的低p H耐受能力,另一方面也说明通过增强S.albulus低p H耐受性是提高其合成ε-PL能力的有效途径。

小白链霉菌全细胞转化L-赖氨酸合成ε-聚赖氨酸的体系构建与优化

小白链霉菌(Streptomyces albulus)是天然抗菌肽ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)的主要生产菌株。为了提高小白链霉菌生产ε-PL效率,该文构建并优化了全细胞转化L-赖氨酸合成ε-PL体系:葡萄糖质量浓度80 g/L,菌龄12 h,反应温度30℃,L-赖氨酸质量浓度15 g/L,柠檬酸浓度15 g/L,初始反应p H 4.0,硫酸铵质量浓度6 g/L,湿菌体量为1900 g/L。基于该转化体系,实现小白链霉菌在96 h合成ε-PL产量和底物转化率达到13.80 g/L和38.9%,分别是常规摇瓶发酵的4.1、3.2倍。最后,在小白链霉菌中异源表达来自大肠杆菌的L-赖氨酸特异性通透蛋白基因lysp,获得的重组菌S.albulus OE-lysp实现L-赖氨酸利用能力和底物转化率较出发菌株分别提升26%和33%,ε-PL产量增加至17.21 g/L,约为常规摇瓶发酵ε-PL产量的6.4倍,这是文献报道的最高摇瓶规模ε-PL产量。该研究结果一方面说明了通过全细胞转化L-赖氨酸生产ε-PL的可行性,另一方面为S.albulus转化大宗氨基酸L-赖氨酸生产高值ε-PL奠定了坚实的技术基础,具有重要的理论意义和经济价值。

低温β-1,4-内切葡聚糖酶的基因挖掘、异源表达及其酶学性质表征

β-1,4-内切葡聚糖酶在洗涤行业有着广泛的应用价值,其中具有较好的低温和碱性耐受能力是其实现工业应用的重要前提。该论文通过基因挖掘获得一株具有低温耐受能力的Deinococcus cellulosilyticus来源新型β-1,4-内切葡聚糖酶基因EgDC,并将其在大肠杆菌中实现了可溶性表达,其中大部分存在于周质空间,少部分分泌至胞外。对EgDC酶的酶学性质进行了表征,发现该酶的最适温度和最适pH值分别为40℃和pH 6.5,其在20℃能保持70%以上活力,且在pH 8.0和pH 9.0的半衰期分别达到83.43 min和53.79 min。EgDC酶具有较好的催化性质,其比酶活力k_(cat)/K_(m)值分别为(26.38±1.43)U/mg和(520.03±17.07)s^(-1)/mg,且对于金属离子以及表面活性剂均具有较强耐受能力。由此可见,新型β-1,4-内切葡聚糖酶EgDC具有较好的催化能力,且在低温、碱性以及存在表面活性剂环境下较为稳定,因此具有潜在的工业应用价值。

不同来源胰蛋白酶的基因挖掘、在Komagataella phaffii GS115的异源表达及其酶学性质分析

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,广泛应用于皮革、食品加工、生化检测和制药行业。该文旨在挖掘不同来源的胰蛋白酶,并在Komagataella phaffii GS115进行异源表达,最终分析并比较其酶学性质。通过基因挖掘手段分别克隆了人源胰蛋白酶(homo spanies trypsin,HST)、牛源胰蛋白酶(bos taurus trypsin,BTT)、虾源胰蛋白酶(penaeus vannamei trypsin,PVT)和弗氏链霉菌源胰蛋白酶(Streptomyces fradiae trypsin,SFT),以pPIC9k为载体构建重组质粒,并在Komagataella phaffii GS115中成功实现异源表达。经纯化激活后,HST,BTT,PVT,SFT的酰胺酶活性分别为18.6、12.3、44.7、13.8 U/mL;4种来源胰蛋白酶的最适温度分别为20、35、40、45℃,而其最适pH值分别为9、8.5、8.5、9,其中SFT在pH 9~11的稳定性更优。

小白链霉菌中CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建与优化

小白链霉菌(Streptomyces albulus)是工业上生产ε-聚赖氨酸的主要菌株。为提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,基于诱变和抗性筛选的传统育种方法被普遍应用。然而,由于传统育种存在“疲劳效应”,当前S.albulus的育种陷入了瓶颈。为利用代谢工程方法进一步提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,亟需建立基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法。为此,该文以S.albulus GS114为研究对象,以ε-聚赖氨酸合成酶基因pls为靶基因,构建了CRISPR-Cas9基因敲除系统,成功敲除了pls,编辑效率为100%。为进一步提高获得的敲除株数量,对S.albulus GS114结合转移条件进行了系统优化,获得的最优结合转移条件为:供受体比例1∶1,镁离子浓度30 mmol/L,55℃热激孢子10 min,培养20 h后覆盖抗生素。在最优转移条件下,结合转移效率达到2.5×10^(-8),较优化前提高了78%。该研究结果一方面为后续S.albulus的代谢工程改造提供了重要工具,另一方面为其他工业链霉菌构建CRISPR-Cas系统提供了重要参考。

大肠杆菌L-丝氨酸脱水酶的表达改善甘氨酸营养缺陷型毕赤酵母L-丝氨酸的生长

氨基酸作为一种迟效碳源无法被微生物快速利用。L-丝氨酸脱水酶(L-serine dehydratase,L-SerDH)可以将L-丝氨酸一步催化为丙酮酸和氨进入中心碳代谢生成生物量,且此过程不需要消耗ATP和还原力。L-丝氨酸是甲酸利用途径(还原性甘氨酸途径)的关键中间体。因此,改善L-丝氨酸的利用可以为甲酸和丝氨酸作为碳源利用提供参考价值。该文对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)进行了丝氨酸耐受性实验,结果显示毕赤酵母可以耐受20 g/L丝氨酸。对内源L-丝氨酸脱水酶在毕赤酵母中的表达进行了优化。在甘氨酸营养型毕赤酵母内分别表达了8种异源L-丝氨酸脱水酶,结果表示大肠杆菌tdcG基因编码的L-SerDH对丝氨酸利用改善效果最好,终OD 600提高至出发菌株的1.6倍。该研究验证了巴斯德毕赤酵母对L-丝氨酸的耐受性,并筛选得到了较优的L-丝氨酸脱水酶来源,为毕赤酵母的丝氨酸利用提供了更优的酶来源。

豆瓣酱生物胺降解菌株的筛选、鉴定及其降解特性研究

为保障传统发酵食品的质量安全,从豆瓣酱样品中筛选生物胺降解菌株,并研究其在不同盐浓度、温度、pH下对组胺和酪胺(毒性最强的2种生物胺)的降解特性,以便于更好地应用于传统发酵食品。通过研究菌株在磷酸盐缓冲液和在发酵液中对生物胺的降解率以及在发酵液中产生生物胺的能力,最终筛选得到1株具有较强生物胺降解能力的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)M-28。对该菌株在不同条件下降解组胺和酪胺的能力进行分析,发现P.acidilactici M-28在盐质量浓度为0~90 g/L时对组胺和酪胺均具有较高的降解率,最高降解率分别达到89.02%和31.49%;该菌株降解生物胺的最适温度为30℃,在该条件下对组胺和酪胺降解率分别为65.51%和28.06%;最适pH值为6,在该条件下对组胺和酪胺的降解率分别为62.73%和23.78%。

白酒酿造窖泥未培养微生物菌群的可培养化策略

窖泥是厌氧微生物的重要栖息地,厌氧微生物菌群的代谢活动对浓香型白酒的香气和风味形成起着重要作用。但大多数窖泥厌氧微生物尚未能在人工实验室培养条件下培养,这严重阻碍了对窖泥厌氧菌群功能的解析。采用CGM、NBM和MCI三种营养成分丰富度不同的培养基,以典型窖泥作为菌群接种源,探索富集菌群的种类与动力学变化。扩增子测序分析表明,寡营养的MCI培养基对于富集窖泥主体菌群是较为有效的,可以同时富集得到产甲烷菌群和细菌菌群,主要包括古菌的广古菌门(Euyarchaeota)、细菌的拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。使用基于MCI培养基的寡营养技术能有效富集窖泥中高丰度和低丰度厌氧菌,如普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、Dysgonomonadaceae、太阳杆菌科(Heliobacteriaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和甲烷八叠球菌科(Methanosarcinaceae)等;同时对扩增子测序无法检测的稀有微生物,包括甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、Oligosphaeraceae、Cloacimonadaceae、纤维杆菌科(Fibrobacteraceae)和Pedosphaeraceae等也具有良好的富集作用。结合宏基因组学技术,寡培养技术展现出在解析窖泥微生物菌群的物种组成、菌群结构和代谢潜能等方面的重要价值,为深入剖析窖泥未培养厌氧菌对窖泥依赖型白酒风味物质合成贡献起到重要作用。

生态发酵技术原理与应用

传统发酵食品因其独特的风味和丰富的营养日益受到消费者的青睐。但由于传统发酵食品多通过自然接种的方式生产,导致产品存在批次稳定性差、生产效率低和食品安全不可控等问题。针对此类问题,提出生态发酵技术的概念。生态发酵技术基于微生物生态学原理、微生物学原理及微生物组学技术,由上游的发酵微生物菌群解构技术、中游的核心功能微生物菌群重组技术和下游的发酵过程控制技术三大部分组成。运用生态发酵技术有望实现传统发酵食品的稳定、效率和安全生产。文章主要阐述了建立生态发酵技术的必要性、内涵和未来发展方向。

采用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱技术解析不同陈酿时间古井贡酒挥发性组分特征

采用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱技术对不同陈酿时间古井贡酒挥发性组分差异特征进行了解析。通过多级鉴定策略在陈酿古井贡酒中准确鉴定出262种潜在的香气活性组分。陈酿古井贡酒中除醇、醛、酸、酯等骨架成分外,微量香气化合物的种类极丰富。对挥发性组分含量进行多元统计分析,共发现50种具有显著差异的挥发性物质,其中大部分呋喃类、萜烯类、芳香族以及酸类风味化合物含量随陈酿时间的增加而逐渐增加,对增添原酒香气具有重要贡献。运用化学计量学的手段分析不同等级不同陈酿时间酒样挥发性组分时,发现不同等级间酒样的差异大于不同年份的差异,说明基酒品质控制是调控白酒陈酿风味品质的重要方面。

全二维气相色谱飞行时间质谱技术解析明绿液白酒挥发性组分特征

采用顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)结合全二维气相色谱-飞行时间质谱(comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry,GC×GC-TOFMS)技术对安徽明绿液酒的挥发性组分特征进行了分析。通过与自建白酒挥发性风味数据库比对、商业化数据库比对等多策略联用鉴定分析策略,在明绿液酒中鉴定出810种挥发性组分,包括386种潜在香气活性组分。通过对明绿液酒挥发性组分的解析,为白酒挥发性风味数据库补充了21种新的挥发性组分,10种新的潜在香气活性组分,包括2-甲氧基-3-异丁基吡嗪和2-甲氧基-3-异丙基吡嗪等明绿液酒特有的挥发性香气物质。为进一步探究这些独特香气物质的来源,对明绿液酒独特酿造原料绿豆的挥发性组分进行了分析,通过HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析技术在蒸煮绿豆中鉴定出挥发性组分335种,其中潜在香气活性组分262种。发现甲氧基吡嗪、丁香酚等明绿液酒中的独特组分主要来源于绿豆原料,阐明绿液酒的独特风格与其独特原料的关联关系。该研究将有助于增进对酿造原料多样性之于白酒风格独特性的认识。

红景天有效成分微生物发酵高值化转化

通过分离筛选出能将L-酪氨酸转化成酪醇的菌株,并将其应用于中药红景天中,以提高其中酪醇(tyrosol,TYR)和红景天苷(salidroside,SAL)含量及其抗氧化活性。采用含有酪氨酸的平板通过pH变化筛选出产酪氨酸脱羧酶的菌株,并通过高效液相色谱(HPLC)和液质联用(liquid chromatograph-mass spectromete,LC-MS)确定了9株能够转化成酪醇的菌株。然后用这些菌株分别以红景天为底物进行发酵炮制,发酵后红景天中酪醇含量由原发酵前的0. 23 g/L增加为0. 78g/L,提高了235%,红景天苷含量由发酵前的0. 21 g/L增加到0. 43g/L,提高了109. 9%。发酵液的总还原力是提取液的1. 7倍,DPPH·清除能力由发酵前的35. 45%增加到61. 01%。

α-法尼烯在巴斯德毕赤酵母中的生物合成

由可再生原料微生物生产α-法尼烯是一种有前途的替代传统石油基工艺的方法。尽管已经报道α-法尼烯可以通过常规模型菌株如大肠杆菌和酿酒酵母异源产生,但是其发酵规模不易扩大。巴斯德毕赤酵母是生产类异戊二烯的良好平台且可高密度培养,具有大规模生产α-法尼烯的潜力。在该项研究中,首先确定tHmg1,IDI1,ERG19,AFSLERG20是甲羟戊酸途径和α-法尼烯合成途径的限速酶基因。然后对限速酶基因进行组合过表达并优化基因拷贝数以平衡代谢路径增大流向α-法尼烯合成的代谢通量,最终获得菌株F16,其α-法尼烯产量为(1.09±0.02)g/L。最后,通过外源添加不饱和脂肪酸促进α-法尼烯分泌到细胞外,当培养基添加20 mmol/L的油酸,在摇瓶中获得最高的α-法尼烯产量约1.40 g/L[0.32 g/g细胞干重(dry cell weight,DCW)]。这是出发菌株F1产量的3.1倍。该研究是首次以巴斯德毕赤酵母作为底盘微生物细胞来生产α-法尼烯,并为其他倍半萜的异源生物合成提供了新的思路。

转化姜黄素加氢衍生物菌株的筛选鉴定及培养基优化

以姜黄素(curcumin,CUR)为唯一碳源的培养基中初筛出83株菌种,再利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)复筛,得到5株可以以姜黄素为底物生产二氢姜黄素(dihydrocurcumin,DHC)与四氢姜黄素(tetrahydrocurcumin,THC)的菌株。以初始产率最高的菌种作为目的菌种,通过形态学特征与26S rDNA D1/D2区基因序列比对鉴定出该菌株为Cyberlindnera rhodanensis。对基础发酵培养基中碳源、氮源及无机盐进行单因素优化,得出结果为,产DHC的最佳碳源为40 g/L葡萄糖、氮源为30 g/L蛋白胨、无机盐为2 g/L K_2HPO_4,在此条件下产率由10.49%提高到20.20%;产THC的最优碳源、氮源和无机盐分别为20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨和3 g/L K_2HPO_4,优化后产率由13.67%提高到24.31%。首次筛选得到1株能以姜黄素为底物,通过微生物转化得到二氢姜黄素与四氢姜黄素的酵母菌,为姜黄素加氢衍生物的研究提供一定参考,并且提供新菌种资源。