新医科背景下虚拟仿真实验在胚胎学中的应用

胚胎学是研究从受精卵发育为新生个体的过程及其机制的科学,是组织学与胚胎学课程中重要部分。学生只有学好胚胎学,才能了解生命个体的发生和发育,理解组织学、病理学、解剖学等其他学科中的相关内容。传统教学模式主要以讲授文字和图片为主,缺乏了教与学的互动性、自主性以及临床结合性。在新医科背景下,基于胚胎学课程的特点,建设了早期胚胎发育与畸形筛查虚拟仿真实验教学项目。该项目的设计以不孕不育问题为导向,融合生殖医学、妇产科学等临床学科,将理论知识与专业技能相结合,不仅丰富了胚胎学实验内容,也为培养新时代新医科人才夯实基础。

雌激素受体α抑制剂MPP在小鼠囊胚形成和滋养层干细胞中影响YAP核定位

目的研究雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)抑制剂甲基-哌啶-吡唑(methyl-piperidino-pyrazole,MPP)在小鼠桑葚胚和滋养层干细胞(trophoblast stem cells,TSCs)中对YAP的影响。方法收集昆明(kunming,KM)小鼠8-细胞胚,置于0μmol/L(对照组)和5μmol/L(实验组)MPP中培养,分别于8h、12h和24h后收集各组桑葚胚,采用免疫荧光技术观察YAP表达,采用Real Time-PCR检测MPP处理24h后Yap mRNA表达变化;将小鼠TSCs置于0μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L MPP中培养,48h后观察细胞形态改变,分别检测Sox2、YAP、Cdx2 mRNA和蛋白表达水平。结果小鼠8-细胞胚经MPP处理24h后,桑葚胚YAP蛋白核定位水平降低,Yap mRNA水平无显著改变;经MPP处理48h后,5μmol/L组小鼠TSCs细胞出现细胞团块,10μmol/L组细胞增殖明显受抑制;与对照组相比,5μmol/L组细胞Sox2 mRNA表达水平升高,Yap和Cdx2 mRNA水平无显著改变,团块状细胞中的YAP蛋白失去明显的核内定位,SOX2和CDX2阳性细胞的表达更加密集。结论 ERα在小鼠桑葚胚和TSCs中调控YAP核定位,其在TSCs细胞中的作用与CDX2和SOX2的表达有关。

成年大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除小鼠模型的建立与鉴定

去整合素和金属蛋白酶10(ADAM10)是一种能够水解30余种跨膜蛋白质的"脱落酶"(sheddase),参与诸多生理过程和致病机制,如胚胎发育、细胞粘附、信号转导、免疫反应、癌症和阿尔茨海默病。迄今,已报道的ADAMIO完全基因敲除小鼠和大脑神经前体细胞特异性ADAM10基因敲除小鼠分别于胚胎期或围产期死亡,致使无法研究成年小鼠大脑神经细胞ADAM10基因的功能。文章利用本研究小组建立的CaMKlla-Cre转基因小鼠与ADAM10loxP/loxP转基因小鼠杂交,获得了CaMKIIα-Cre/ADAM10loxP/loxP小鼠,并对其进行鉴定。利用PCR方法检测成年ADAM10cKO小鼠大脑基因组DNA表明,ADAM10基因缺失主要发生在前脑皮层和海马中。荧光定量PCR检测结果显示,ADAM10 mRNA的表达水平在前脑皮层和海马中分别降低55.7%和60.8%;使用Western blotting方法研究发现,ADAM10成熟蛋白质的含量在前脑皮层和海马中分别减少63%和84.8%。采用免疫组织化学方法检测表明,成年ADAM10cKO小鼠与野生型小鼠相比,其大脑皮层和海马神经细胞的ADAM10免疫染色明显减弱,而其它细胞如胶质细胞的免疫染色基本一致。总之,文章成功制备了首个存活至成年的大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除(cKO)小鼠,克服了小鼠因ADAM10缺失在胚胎期或围产期死亡的弊端,为研究成年小鼠大脑神经细胞ADAMIO基因的功能奠定了坚实的基础。

YAP1、PD-L1及MMR蛋白在消化道神经内分泌癌中的表达及意义

目的探讨Yes相关蛋白1(YAP1)、程序性死亡-配体1(PD-L1)及错配修复(MMR)蛋白在消化道神经内分泌癌组织中的表达及临床意义。方法应用组织芯片及免疫组化法,检测122例消化道神经内分泌癌组织中YAP1、PD-L1及MMR蛋白的表达情况,并结合消化道神经内分泌癌不同临床病理参数和患者预后进行比较分析。结果YAP1核、YAP1质、PD-L1及MMR蛋白缺失的阳性率分别为27.1%、35.3%、22.1%、2.5%。YAP1在神经内分泌癌组织中的表达显著高于正常组织或神经内分泌瘤(均P<0.05),YAP1核表达与脉管浸润、淋巴结转移及TNM分期呈显著正相关(均P<0.05)。PD-L1表达与临床病理特征无明显相关性(均P>0.05)。相关性分析显示YAP1核表达与PD-L1表达呈负相关(P<0.05)。生存分析未发现YAP1及PD-L1的预后意义。结论YAP1核表达可能与消化道神经内分泌癌的发生发展有关;消化道神经内分泌癌表达PD-L1及错配修复缺陷(dMMR);针对YAP1的靶向治疗及抗PD-1/PD-L1治疗可能成为消化道神经内分泌癌的潜在新疗法。

EGCG促进合子基因组激活和多能性因子OCT4的表达

目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)对小鼠早胚体外发育、小鼠合子基因组激活(zygotic genome activation,ZGA)以及多能性因子OCT4和SOX2表达的影响。方法收集昆明(Kunming,KM)小鼠1-细胞胚,以M16培养液为对照组,以培养液中添加不同浓度的EGCG为实验组,观察各组1-细胞胚体外发育情况;采用Real-time PCR技术检测体外发育至2-细胞胚内ZGA标志基因eIF1A、Zscan4d、MuERV-L、Hsp70.1和多能性因子基因Oct4、Sox2的mRNA表达水平;运用免疫荧光染色法检测OCT4和SOX2表达情况。结果添加EGCG显著提高各发育阶段(4-细胞胚、桑葚胚、囊胚)过渡率,上调2-细胞胚内MuERV-L、Hsp70.1、Oct4的mRNA表达水平,对eIF1A、Zscan4d、Sox2的mRNA表达量无明显影响,增强OCT4免疫荧光强度,对SOX2免疫荧光强度无明显影响。结论EGCG可能通过调节合子基因组的激活以及多能性因子的表达水平,促进小鼠早胚体外发育。

RNA结合蛋白CELF4对小鼠早期胚胎发育的作用

目的观察RNA结合蛋白CELF4在小鼠早期胚胎中的分布与表达,初步探讨CELF4对小鼠早期胚胎发育的作用。方法利用免疫荧光和Real-Time PCR检测CELF4在小鼠早期胚胎中的定位和mRNA表达,利用显微注射技术在1-细胞胚中注入CELF4抗体,观察其对小鼠体外早期胚胎发育的影响,以及对2-细胞期ZGA标志基因eIF1A、MuERV-L、Zscan4d、Hsp70.1和桑椹胚期Cdx2、Oct4、Sox2 mRNA表达的影响。结果CELF4分布于各阶段早期胚胎的细胞质内,在8-细胞胚和桑椹胚中荧光变强,但在囊胚阶段则明显减弱;CELF4 mRNA在1-细胞胚、2-细胞胚和4-细胞胚表达较高,8-细胞胚至囊胚阶段显著下降;CELF4抗体封闭组囊胚发育率低于对照组,Cdx2 mRNA表达显著下降。结论CELF4在小鼠早胚胞质内的阶段特异性表达提示其可能对早期胚胎发育起一定的作用,其可能通过调控滋养层细胞Cdx2 RNA的翻译或者稳定性从而影响囊胚的形成。

蛋白激酶在小鼠囊胚形成中的作用机制

在小鼠8-细胞胚向囊胚发育的过程中发生第1次细胞系分化。蛋白激酶(Akt)是一种功能强大的激酶,其在囊胚形成期间的作用尚未明确。本研究中结果显示,Akt蛋白特异性定位于桑葚胚的外层细胞。Akt特异性抑制剂MK2206可显著抑制小鼠囊胚形成,并导致滋养外胚层标志基因Cdx2表达水平降低、核蛋白ERα出现胞质内粗颗粒状表达。采用siRNA显微注射的方式敲低ERα也可导致小鼠囊胚发育率降低,并伴有Yap蛋白表达水平降低。

转录因子TRPS1通过H3K27me3调控小鼠合子型基因激活

前期研究发现,转录因子TRPS1可参与调控小鼠植入前胚合子基因组激活,但具体调节机制尚未明确。本研究收集小鼠1-细胞胚,采用显微注射的方法,注射TRPS1的抗体、siRNA和反寡义核苷酸,分别沉默TRPS1的蛋白和mRNA,观察小鼠植入前胚各阶段发育率变化;利用免疫荧光染色法检测TRPS1-siRNA显微注射后H3K27me3表达情况,并利用染色质免疫共沉淀技术(ChIP)在细胞模型中探讨其作用机制。结果表明,沉默TRPS1的蛋白和mRNA能够使大部分小鼠植入前胚发育停滞在2-/4-细胞胚阶段;Trps1-siRNA显微注射处理导致H3K27me3表达水平降低。在细胞模型S-KO-V3卵巢癌细胞中转染TRPS1-siRNA,发现H3K27me3的甲基转移酶EZH2下调;采用ChIP-qPCR技术,发现TRPS1能够特异性的结合在EZH2的启动子上,在植入前胚中验证发现,TRPS1下调能够引起2-细胞胚EZH2蛋白表达水平下降。

褪黑素的抗胃癌效应及其对TNF-α、NO表达的调节作用

目的探讨褪黑素(melatonin,MLT)在体内外对胃癌细胞增殖活性的影响及其对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)表达的调节作用。方法构建不同浓度褪黑素干预皮下荷胃癌小鼠模型。测量各组小鼠肿瘤质量、体积;胸腺、脾脏指数;HE染色观察肿瘤组织形态;分离各组小鼠腹水巨噬细胞并计数分析。ELISA和比色法检测外周血清及腹水巨噬细胞培养液TNF-α、NO表达水平。不同浓度褪黑素干预小鼠胃癌细胞(MFC)。CCK-8检测各组MFC细胞的增殖活力;ELISA和比色法检测各组细胞培养上清TNF-α、NO表达水平。结果褪黑素干预后小鼠肿瘤质量、体积均显著下降,脾和胸腺指数无明显变化;相比对照组,褪黑素组外周血清和腹水巨噬细胞培养液TNF-α、NO表达水平均明显升高。褪黑素干预后MFC细胞增殖活力明显下降,呈剂量依赖性;同时,褪黑素组相比对照组MFC细胞上清NO表达降低,TNF-α表达升高。结论褪黑素体内外均能抑制胃癌细胞增殖活性,该作用与TNF-α表达上调、NO表达水平改变有关;也与体内巨噬细胞分泌TNF-α、NO水平增强有关。