基于pyrF的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建

基于pyrF筛选标记和来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)的基因组DNA为表达元件,构建L.lactis食品级表达载体,用于食品和药用多肽的表达和生产。首先,利用NZ3900 pyrF基因列构建同源重组突变盒,构建NZ3900 ΔpyrF突变株;然后,分别以来源于L.lactis的repA和repC基因为复制元件、pyrF基因为筛选标记、P_(32)和P_(8)为启动子、以及Tusp_(45)和TpepN为终止子,构建食品级表达质粒pLD;最后以绿色荧光蛋白ZsGreen为报告基因,验证ZsGreen在NZ3900 ΔpyrF突变株的表达及pLD-ZsG的遗传稳定性。实验结果表明,原养型ZsGreen阳性转化子可在普通Elliker培养基中正常生长,在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号;此外,PCR和Western blotting也证实ZsGreen能在NZ3900中表达且能稳定传代至30代,说明pLD食品级表达载体构建成功且使得外源蛋白在L.lactis中稳定表达。综上所述,基于pyrF营养缺陷型标记构建的L.lactis食品级表达载体的方法切实可行,可为推动L.lactis在食品和药用多肽生产中的应用提供研究基础。

使用TALENs技术构建丁酰胆碱酯酶敲除小鼠模型研究

为了使用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术构建丁酰胆碱酯酶(BChE)敲除小鼠模型,试验设计多对TALENs组合,合成相应的载体,并通过3T3细胞系对这些载体的活性进行检测,选择出活性最高的组合进行体外转录获得TALENs mRNA,并注射入小鼠受精卵中,对子代小鼠进行基因测序并筛选,最终获得BChE基因敲除小鼠。结果表明:针对4个基因位点设计并构建了30对TALENs组合,选择最优3L3-3R1组合进行体外转录并注射入小鼠受精卵,获得4只携带突变的F0代嵌合体小鼠;通过杂交及筛选,最终获得4只携带移码突变的F1代小鼠,可用于交配繁殖。说明通过TALENs技术可以稳定可靠地制备BChE基因敲除小鼠,并用于后续BChE功能的研究。

呼吸模式对雾化吸入剂粒径分布影响的体外研究

目的探究呼吸模式对水雾剂粒径及分布的影响,建立适用于气道阻塞疾病的雾化吸入剂的体外粒径评价方法。方法将呼吸模拟器与激光粒度仪串联,在不同的呼吸模式下,检测4种雾化器产生的药物气溶胶的粒径及分布。结果当设置不同的吸气时间时,在使用空气压缩雾化器时,随着吸气时间的缩短,粒径值逐渐变大,与《中国药典》推荐的呼吸模式得到的粒径结果相比差异具有统计学意义(P<0.05)。对于筛网振动雾化器,随着吸气时间的缩短,粒径值有变小的趋势,在吸气时间/呼吸总时间(T i/T total)=0.3的吸气段内,与《中国药典》推荐的呼吸模式得到的粒径结果相比差异具有统计学意义(P<0.05)。在不同的潮气量下,粒径分布的结果也存在差异,这种差异与吸气时间和雾化装置的类型有关。结论在开发雾化吸入剂的过程中需要建立与临床使用相关联的评价方法,从而让体外评价的结果更好地指导临床应用。

氯化钴诱导的N2a细胞缺氧损伤模型的机制研究

目的研究氯化钴(CoCl 2)诱导的N2a细胞缺氧损伤模型的作用机理,为永久性缺血性脑卒中提供治疗思路。方法用0~1200μmol/L的CoCl 2处理24 h建立N2a细胞缺氧损伤模型。根据细胞活力与细胞凋亡率确定缺氧模型的最适宜浓度,免疫荧光法测定细胞线粒体膜电位及胞内活性氧(ROS)的表达,蛋白印迹法测相关蛋白含量。结果300μmol/L的CoCl 2是建立缺氧损伤的最适宜浓度。细胞经过处理后,线粒体膜电位降低,ROS含量明显升高,IKK蛋白被激活,磷酸化水平增加,促进了NF-κB的入核,同时Bcl-2蛋白含量降低、Bax、C-Caspase-3含量上升(P<0.05)。结论CoCl 2对N2a细胞的缺氧损伤主要通过其促凋亡作用产生,胞内线粒体膜电位的下调,ROS含量的增加以及NF-κB的入核和促凋亡蛋白含量的增加共同作用诱导CoCl 2对N2a细胞的损伤。

基于基质辅助激光解吸电离质谱成像技术对高血脂模型大鼠脑部脂质变化的研究

目的基于基质辅助激光解吸电离质谱(MADLI-MSI)成像技术分析高血脂模型大鼠脑部脂质变化。方法高脂高胆固醇饲料喂养大鼠10周建立高血脂模型,实验分为正常组和模型组。运用生物化学方法检测血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)的含量;利用MADLI-MSI质谱成像技术对高血脂模型大鼠脑片扫描;采用主成分分析及工作测试曲线分析,寻找可能潜在的生物标记物。结果模型组与正常组相比,脑片脂质分布没有变化,脑切片主成份分析(PCA)分析也没有差异。结论高脂高胆固醇诱导10周大鼠与正常大鼠脑组织没有差别。

野百合碱诱导肺动脉高压大鼠右心室脂肪酸代谢紊乱的机制

目的观察野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠右心室CD36、过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPARα)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)的表达情况,探讨肺动脉高压大鼠右心室脂肪酸代谢紊乱的机制。方法24只大鼠随机分成对照组10只和观察组14只。观察组通过一次性腹腔注射60 mg/kg野百合碱来建立肺动脉高压模型,对照组腹腔注射相同剂量的生理盐水。4周时通过右心导管法测定大鼠的平均右心室压(mRVP)以及右心室收缩压(RVSP);称量右心室(RV)、左心室+室间隔(LV+S)的质量,计算右心肥厚指数[RV/(LV+S)];采用实时荧光定量PCR方法检测右心室CD36、PPARα、PPARγ的mRNA表达的变化。结果 4周时,观察组mRVP和RVSP高于对照组(P均<0.05),肺动脉高压模型建立成功。对照组右心室心肌肥厚指数、心肌细胞横截面积分别为0.20±0.02、(290.32±28.16)μm2,观察组分别为0.40±0.07、(187.92±21.15)μm2,两组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。对照组右心室CD36、PPARα、PPARγmRNA相对表达量分别为1.00±0.00、1.00±0.00、1.00±0.00,观察组分别为1.26±0.08、0.71±0.06、0.48±0.09,观察组右心室CD36表达量高于对照组,PPARα、PPARγ的表达量低于对照组(P均<0.05)。结论野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠右心室CD36的表达增加和PPARα、PPARγ表达减少,导致右心室脂肪酸利用水平降低,形成脂毒性,引起右心室功能紊乱。

缺血再灌注对大鼠心肌H9c2细胞活性、凋亡的影响及其机制

目的观察缺血再灌注对大鼠H9c2心肌细胞活性、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法 H9c2细胞分为A、B组,1×10~4/孔接种于96孔板,每组6个复孔。细胞贴壁生长24 h时B组吸弃原培养基,加入人工缺氧液100μL,置于含94%N_2、1%O_2、5%CO_2的三气培养箱中培养90 min;吸弃缺氧液,加入DMEM高糖培养基,置于正常培养箱中培养90 min备用。A组仅加入DMEM高糖培养基,置于正常培养箱中培养90 min备用。采用MTT法检测细胞活性,TUNEL法检测凋亡细胞,采用激光共聚焦显微镜观察并计算两组细胞活性氧簇（ROS）含量及线粒体膜电位（MMP）,采用Western blotting法检测心肌细胞热休克蛋白60（HSP60）、过氧化物氧化还原酶（Prx）、硫氧还原蛋白（Trx）、线粒体分裂蛋白（Fis1）。结果 A、B组心肌细胞活性分别为0.77±0.01、0.40±0.02,二者比较,P〈0.05。A、B组心肌细胞凋亡率分别为2.24%±0.12%、41.78%±1.43%,二者比较,P〈0.05。A组细胞ROS含量及MMP分别为0.58%±0.02%、1.12%±0.05%,B组分别为1.13%±0.05%、0.76%±0.01%,组间比较,P均〈0.05。与B组相比,A组心肌细胞HSP60、Fis1蛋白表达升高,Prx2、Trx1蛋白表达降低,P均〈0.05。结论缺血再灌注后H9c2细胞出现细胞活性下降、细胞凋亡,其机制可能与缺血再灌注促进细胞HSP60、Fis1蛋白表达,抑制Prx2、Trx1蛋白表达有关。

流速对激光衍射法测试2种市售雾化吸入剂粒径大小及分布结果的影响

目的探究流速对激光衍射法测试经3种喷雾器雾化的吸入溶液的气溶胶粒径分布的影响。方法分别在6 L/min和15 L/min的测量流速条件下,用Spraytec STP2000激光粒度仪测试硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液(溶液型)和吸入用布地奈德混悬液(混悬型)2种吸入溶液经LC sprint 1、LC sprint 2、LC Family3种喷雾器雾化的气溶胶的粒径分布情况。结果吸入用布地奈德混悬液经LC sprint 1雾化的气溶胶,在6 L/min和15 L/min条件下测试的DV(50)(累积分布为50%时对应的粒径)分别为(2.963±0.067)μm和(3.068±0.255)μm,差异无统计学意义;经LC sprint 2雾化的气溶胶,6 L/min和15 L/min测试的DV(50)分别为(3.247±0.146)μm和(3.693±0.116)μm,差异具有统计学意义(P<0.05);经LC Family雾化的气溶胶,6 L/min和15 L/min测试的DV(50)分别为(3.532±0.131)μm和(3.701±0.122)μm,差异具有统计学意义(P<0.01)。在体积累积分布图和体积频数分布图中,LC sprint 1(2.2μm)雾化的气溶胶在15 L/min和6 L/min的条件下的结果无明显的差异,而LC sprint 2(2.9μm)、LC Family(3.5μm)雾化的气溶胶在这两个流速条件下的分布图均有差别。硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液的测试结果与吸入用布地奈德混悬液结果相似。结论测量流速对激光衍射法测试吸入溶液的气溶胶粒径分布存在影响,影响的程度与所选用的喷雾器有关。

CRP基因沉默后心肌细胞系H9c2的miR-21及其靶基因表达、细胞活力观察

目的观察沉默炎症因子CRP基因对H9c2心肌细胞活力的影响,并探讨其机制。方法 (1)取H9c2心肌细胞,随机分为CRP沉默组和对照组。CRP沉默组转染对CRP特异性沉默的p LV-shRNA-CRP慢病毒,对照组转染无敲减作用的p LV-shRNA-Scramble慢病毒。筛选与鉴定慢病毒载体成功转染H9c2心肌细胞。转染48 h后,采用实时定量PCR法观察两组H9c2心肌细胞CRP基因的沉默效率、miR-21及PDCD4、PTEN、Spry1 mRNA。(2)取H9c2心肌细胞,随机分为空白组、对照组和CRP沉默组,空白组不转染病毒加入等量的DMEM培养基,对照组转染p LV-shRNA-Scramble慢病毒颗粒,CRP沉默组转染p LV-shRNA-CRP慢病毒颗粒。转染24 h后,采用MTT法检测三组H9c2心肌细胞活力。结果 (1)CRP沉默组和对照组H9c2心肌细胞中CRP mRNA相对表达量分别为0. 320±0. 069、1±0. 090,miR-21相对表达量分别为0. 740±0. 099、0. 280±0. 010,两组相比P均<0. 01。CRP沉默组PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表达均低于对照组(P均<0. 01)。(2)CRP沉默组、对照组和空白组细胞活力分别为0. 78±0. 030、0. 66±0. 010、1. 00±0. 013;与空白组相比,CRP沉默组和对照组细胞活力均下降(P均<0. 01);与对照组相比,CRP沉默组细胞活力上升(P <0. 05)。结论沉默CRP基因可促进H9c2心肌细胞存活,这可能与其可增加H9c2心肌细胞中miR-21表达,抑制PDCD4、PTEN和Spry1的基因表达有关。

糖皮质激素及其受体在恐惧记忆形成中的作用机制

糖皮质激素通过影响杏仁核中神经元结构改变、脑源性神经营养因子(BDNF)的表达进而参与到恐惧记忆形成和续新过程。它对记忆巩固的影响与药物剂量、任务性质和刺激程度有关。本文对糖皮质激素及其受体在恐惧记忆形成中的作用机制进行总结,为今后对恐惧记忆的形成机制研究、对相关药物研发和创伤后应激障碍患者的治疗提供启示。

左旋班布特罗吸入水雾剂的制备及处方优化

目的制备左旋班布特罗(R-Bambuterol,R-BMB)吸入水雾剂,并对处方进行优化。方法以甘油和丙二醇为辅料,配比得到9个处方。测定9个处方的理化性质,包括pH值、渗透压、表面张力,并通过碰撞器法和激光衍射法测试其粒径、空气动力学中值粒径(mass median aerodynamic diameter,MMAD)、d0.5、细微粒子百分数及跨度参数。运用正交实验方差分析法探索甘油和丙二醇对左旋班布特罗吸入水雾剂粒径大小及分布的影响。结果随着甘油和丙二醇增加,左旋班布特罗吸入水雾剂的d0.5与MMAD均出现下降趋势。粒径测试及方差分析结果表明,含有1%甘油和15%丙二醇的处方具有最低的粒径(2.510μm)、较小的MMAD(4.577μm)及较高的肺部药物递送效率(54.314%)。结论由1%甘油和15%丙二醇及0.25%R-BMB构成的R-BMB吸入水雾剂具有较好的雾化粒径大小及肺部药物递送效率,有望用于支气管哮喘的治疗。

短期高脂饮食对不同性别小鼠肠道微生物的影响

目的探讨短期高脂饮食对不同性别小鼠肠道微生物的影响。方法将16只C57BL/6J小鼠(雌雄各半)按雌雄各随机分为2组,分别喂食基础饲料(对照组)和45%高脂饲料(高脂组),饮食干预2周后,收集小鼠的新鲜粪便样本,提取粪便细菌总基因组DNA,对其16S rDNA的V3+V4区域进行扩增及测序,分析菌群的组成及丰富度变化。结果高脂饮食改变了雌性和雄性小鼠肠道微生物组成及物种多样性。与相应对照组比较,雌性高脂组小鼠厚壁菌门及该菌门中Leptum菌种的相对丰富度均显著下降(P﹤0. 05),雄性高脂组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论短期高脂饮食对雌性和雄性小鼠肠道微生物组成及结构有不同的影响,可能与不同性激素与肠道菌群的相互作用有关。

利培酮PLGA长效注射微球的稳定性考察

本课题组前期研究中利用自主研发的超细微粒制备系统构建了利培酮聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)长效注射微球,本课题进一步探究其稳定性,为工业化生产、包装、贮存及运输条件提供理论依据。通过影响因素、加速及长期稳定性试验,考察利培酮PLGA长效注射微球的外观性状、分散性、主药含量、有关物质及释放行为。温度、湿度和光照对注射微球的稳定性均有影响,导致其释药速率显著加快,建议密封于棕色西林瓶中低温贮存,在此包装条件下,注射微球的加速和长期稳定性在3个月内均合格。本研究结果提示,利培酮PLGA长效注射微球应置于棕色西林瓶中封装,并在低温、干燥的环境中贮存。

二氮嗪再灌注处理通过抑制细胞内ROS信号保护心肌细胞

恢复心肌血流量是目前针对急性心肌梗塞的有效治疗方式,但是在心肌再灌注过程中会进一步引起心肌细胞的坏死和调亡。二氮嗪是一种线粒体ATP敏感型钾离子通道开放剂,研究证明二氮嗪预处理具有心肌保护功能。本研究主要探讨二氮嗪再灌注处理是否具有心肌细胞保护作用并探讨其分子机制。以体外培养的H9c2心肌细胞为研究对象,通过联合缺氧模拟在体心肌缺血复灌损伤,检测细胞凋亡、线粒体膜电位、细胞内活性氧及钙离子各项指标的变化。结果发现,与正常组（control）相比,缺血再灌损伤组（ischemia-reperfusion injury,IRI）细胞活性显著下降,细胞凋亡率显著升高,线粒体跨膜电位（MMP）下降,同时细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）和钙离子大量爆发,二氮嗪在这一过程中通过抑制细胞内ROS的增加、保护线粒体膜电位起到心肌细胞保护作用,并且其保护作用与细胞内另一种重要的第二信使钙离子没有直接关系。

再生丝素蛋白及其纳米粒的性质考察

天然丝素蛋白不溶于水,需要通过水盐溶剂系统提取得到再生丝素蛋白,再作为聚合物材料用作给药系统的载体,这一溶解过程会影响再生丝素蛋白作为药物载体的性质。为了研究溶解时间对再生丝素蛋白性质的影响,将天然丝素蛋白分别在Ajisawa's溶剂体系中溶解4、8和12 h,得到不同溶解时间的再生丝素蛋白,对它们的相对分子质量、自组装行为、表面形态特征、游离氨基等性质进行表征,并将不同溶解时间的再生丝素蛋白制备成纳米粒,以异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)为模型药物,研究溶解时间对再生丝素蛋白纳米粒的可修饰性(即表面游离氨基数目)、载药性能、体外释药行为等性质的影响。结果显示,再生丝素蛋白是一种多肽混合物,其相对分子质量(分布范围)随着溶解时间的延长而减小。再生丝素蛋白溶于水后能自组装形成胶束,胶束可进一步聚集成纳米级粒子。再生丝素蛋白表面分布着颗粒,颗粒的大小和数量随着溶解时间的增加而降低。再生丝素蛋白及其纳米粒的游离氨基数目随着溶解时间的延长而增大,但再生丝素蛋白纳米粒中β-折叠构象比例随溶解时间的增加而降低,纳米粒的粒径大小、粒度分布、载药量和包封率等无显著差异。再生丝素蛋白溶液浓度和制备温度对纳米粒粒径大小及分布影响明显。随着再生丝素蛋白溶解时间的延长,载FITC-BSA纳米粒的释药速率加快。溶解时间影响再生丝素蛋白及其相应的纳米粒的性质,实际应用中可根据需求选择和优化溶解时间。

基于URA3基因快速构建表达载体及其在里氏木霉的应用

【背景】表达载体是基因工程必不可少的工具,对于真菌如里氏木霉(Trichoderma reesei)等,由于缺乏商品化的表达载体,使其基因工程蛋白表达既复杂又费时而难以开展。【目的】建立一种利用URA3序列快速构建表达载体的方法,解决真菌研究中难以简单、高效和快速构建表达载体的难题。【方法】基于URA3基因的序列,利用其启动子上游5′端序列和终止子下游3′端序列构建同源重组臂,通过同源重组臂定向同源重组到宿主基因组上,利用强启动子和终止子替换URA3基因,从而实现外源基因的表达。根据此方法构建pTRUC表达载体,将红色荧光蛋白基因mCherry克隆到该表达载体上,转化里氏木霉中并验证m Cherry的表达。【结果】阳性转化子在荧光显微镜下观察到强的红色荧光信号,在基因组PCR中检测到mCherry,Westernblotting结果表明红色荧光蛋白m Cherry能在里氏木霉中表达,以上结果说明该载体构建成功,使外源基因mCherry在里氏木霉中正确表达。【结论】基于URA3基因的快速构建表达载体及其构建方法切实可行,将成为推动真核表达系统表达异源蛋白的有力工具。