提高哺乳动物克隆效率的研究进展

体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)又称为体细胞克隆技术,在生物医学、遗传修饰动物研究及大家畜的育种和良种扩繁等领域具有重要的理论意义和现实价值,但目前该项技术依然存在如克隆效率低下、克隆动物表型异常等问题。近年来,研究人员通过在培养基中添加小分子药物、选择优势供体细胞系(包括iPS细胞)、优化传统核移植参数、对发育关键基因(如XIST及H3K9me3去甲基化酶等)的靶向遗传调控等途径,探索提高克隆效率的新思路、新工艺和新方法,作者着重对上述研究进展进行简要综述。

中国畜禽粪污资源化利用PEST分析

通过对中国畜禽粪污资源化利用外部宏观环境分析,以期为保障中国畜牧业可持续发展提供依据。使用PEST分析模型,从政治、经济、社会和技术4方面因素对畜禽粪污资源化利用进行了研究。结果表明:政治环境方面,相关政策和标准得到进一步完善;经济环境方面,畜禽粪污作为生物质经济潜力巨大,市场化运营机制得到发掘;社会环境方面,畜禽粪污资源化利用是养殖业绿色可持续发展的必然选择;技术环境方面,资源化技术模式和技术体系得到不断发展。当前中国畜禽粪污资源化利用具有良好的行动基础,但也存在较多问题与挑战。为进一步促进中国畜禽粪污资源化利用的可持续发展,提出了相应的发展对策及建议。

供体细胞系基因座位特异DNA甲基化多态性及其与猪克隆效率的关联分析

利用甲基化限制性酶切试验(Combined bisulfite restriction analysis,COBRA)和亚硫酸盐转换PCR(Bisulfite sequencing PCR,BSP)后测序的方法,筛选猪体细胞克隆优势供体细胞提供基因座位特异的DNA甲基化遗传标记。比较8个发育重要基因的差异甲基化区域(Differentially methylated regions,DMRs)在不同克隆供体细胞系中的DNA甲基化多态性,并与猪克隆成绩进行关联分析。结果表明:除了XIST-DMR2和H19-DMR3 DNA甲基化变异幅度较小(低于10%)外,其他基因的相关座位均存在一定的COBRA多态性,其中,LINE1-DMR1、POU5F1-DMR1和NANOG-DMR1等3个差异甲基化化区域在克隆效率最高细胞系中处均处于最低程度的DNA甲基化状态,因此,可作为筛选猪体细胞克隆优势供体细胞系的潜在的DNA甲基化遗传标记。

鸡传染性贫血病毒VP1和VP2基因共表达载体的构建

根据GenBank中收录的鸡传染性贫血病毒(CIAV)基因组序列,设计了扩增CIAV VP1和VP2基因的特异性引物,运用PCR技术从发病鸡肝组织DNA中扩增得到VP1、VP2基因,并将其克隆至pMD18-T载体。核苷酸测序结果显示,其序列与发表的序列同源性达到99.8%。将VP2基因克隆到pMD18-T载体,并对Vp3基因起始密码子进行定点突变,得到突变基因mVP2。将mVP2、VP1先后克隆至pIRES载体,并转化大肠埃希菌JM109,提取质粒通过酶切鉴定显示,成功获得了共表达质粒pIRES-VP1/mVP2。

稳定转染纤维素酶相关基因的猪胎儿成纤维细胞系的建立

旨在构建带有双筛选标记的纤维素酶基因的腮腺特异性表达载体,筛选稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系,为制备转纤维素酶基因的转基因克隆猪提供核供体细胞。采用SOE-PCR和PCR方法,分别扩增获得筛选标记基因NEO-T2A-EGFP序列和纤维素酶相关基因的融合序列SP-EGX-F2A-BGL1,构建腮腺特异性表达载体pPSP-SP-EGX-F2A-BGL1-CMV-NEO-T2A-EGFP,经PCR、酶切、测序鉴定正确后,通过脂质体转染猪胎儿成纤维细胞,利用G418抗性和绿色荧光蛋白进行稳定筛选,并利用PCR和Western blot进行检测。结果表明,成功构建了带双筛选标记的腮腺特异表达纤维素酶基因的表达载体,并获得稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系。该结果为生产腮腺特异表达纤维素酶的转基因克隆猪研究奠定基础。

油葵对沼液灌溉引起的盐碱胁迫响应

为解决养殖业废弃物沼液长期灌溉引起农田盐渍化风险问题,本研究选择油葵作为沼液消纳作物研究其耐盐碱性并进行大田验证。通过室内模拟沼液中盐分主要的胁迫类型,配制不同浓度盐、碱离子进行油葵种子发芽胁迫实验,明确油葵发芽期对沼液中盐、碱胁迫的耐受阈值,同时大田实验设置不同沼液灌溉量灌溉油葵,观测生长状况和农艺性状,综合分析油葵对盐、碱胁迫的响应机制。结果表明,油葵发芽对中性盐耐受阈值在180~240 mmol∙L^(-1)之间,对碱性盐离子耐受阈值在60~120 mmol∙L^(-1)之间。发芽过程中,碱性盐离子浓度为60 mmol∙L^(-1)时,细胞膜相对透性为24%,与中性盐(22%)相近,但相对盐害率为32.36%,显著高于中性盐处理(1.45%),K^(+)/Na^(+)下降91.11%~92.81%,中性盐处理下K^(+)/Na^(+)下降79.90%~87.33%。大田试验利用Na^(+)浓度约为35 mmol∙L^(-1)沼液长期灌溉油葵,在低灌溉量(150 m^(3)∙hm^(-2))下,油葵各农艺性状变化不大,且K^(+)/Na^(+)差异不显著,但在高灌溉量(600 m^(3)∙hm^(-2))下,油葵生长各农艺指标受到抑制,各组织K^(+)/Na^(+)下降57%~88%。研究表明,碱性盐产生的高pH危害高于盐离子渗透胁迫,且碱性盐会更大程度破坏油葵离子稳态,影响油葵发芽与生长。利用养殖业废弃物中沼液作为再生水资源灌溉农田,应控制其HCO_(3)^(-)、CO_(3)^(2-)的含量,调控废水pH,以降低对农作物的伤害。

中国畜禽粪污资源化种养循环现状与效益分析

畜禽粪污已成为农业面源污染的主要来源,合理进行畜禽粪污资源化利用,构建种养循环农业体系是解决畜禽粪污污染问题的有效途径。通过对中国大部分地区进行实地调研,发现当前各地均具有发展种养循环农业的良好条件,但仍存在原位安全消纳标准体系缺乏和周边消纳农田面积不足等问题。当前沼气工程和好氧发酵是实现畜禽粪污资源化和促进种养循环的重要纽带,结合个案分析表明种养循环模式较于达标排放减少企业环保投资72.4%。最后建议要因地制宜地实现畜禽粪污还田无害化处理及资源化利用,同时建立种养结合数据库及运行长效机制。

猪白细胞介素2基因的克隆及腺病毒表达载体的构建

根据GenBank中收录的猪白细胞介素2(pIL-2)基因序列,设计1对特异性引物。运用RT-PCR技术从刀豆素(Con A)诱导的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到pIL-2基因,并将其克隆至pGEM-T Easy载体上。核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长493 bp,含465 bp的开放阅读框,编码154个氨基酸,与已知pIL-2核苷酸序列和氨基酸序列的同源性都高达100%。将克隆的pIL-2基因编码阅读框亚克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,电转化含腺病毒基因组(pAdEasy-1)的大肠埃希菌细胞BJ5183-AD-1,成功获得了重组腺病毒DNA,将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD-293细胞,经过病毒基因组的PCR鉴定和转录水平的RT-PCR鉴定,初步表明,获得了表达pIL-2的重组腺病毒。

3种致猪腹泻病毒的多重RT-PCR检测

试验建立了用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与猪轮状病毒(PRV)的三重RT-PCR方法,以调查猪群中腹泻病毒感染情况。通过该方法对采自广东省规模化猪场的95份临床疑似病毒性腹泻病料进行了检测,结果表明,猪流行性性腹泻病毒阳性率为33.7%,猪传染性胃肠炎病毒阳性率为4.2%,猪轮状病毒阳性率为20%;猪流行性性腹泻病毒和猪轮状病毒混合感染率为8.4%,猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒混合感染率为2.1%。

三种猪Ⅰ型干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的三种猪I型干扰素(porcine interferon,pIFN)基因序列,设计了3对特异性引物。运用RT-PCR技术从长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到了三种猪干扰素基因,并将其克隆至pGEM-TEasy载体上。序列测定结果显示,获得的猪干扰素α1基因序列全长570bp,编码189个氨基酸,获得的猪干扰素α2基因序列全长540bp,编码179个氨基酸,获得的猪干扰素β基因序列全长563bp,编码186个氨基酸。三种猪I型干扰素基因与已知猪I型干扰素核苷酸序列和氨基酸序列的相似性最高可达99%～100%。

两株死胎源猪圆环病毒Ⅱ型的分离与序列分析

将两猪场Ⅱ型猪圆环病毒(PCV2)核酸阳性的流产死胎病料,接种猪肾传代细胞PK15,成功分离到2株PCV2。利用1对PCV2特异性引物,成功扩增出这2株PCV2长约1700bp的全基因组序列,并与其他PCV2毒株序列进行相似性比较。结果表明:2个分离株全基因组长度均为1767bp,核苷酸序列相似性为99.9%;ORF2基因核苷酸相似性为99.85%,所编码的衣壳蛋白氨基酸序列相似性为100%;2个分离株与SD-3等国内分离株核苷酸序列的相似性较高,最高可达99.9%。

猪轮状病毒分离与鉴定

采用MA104细胞从广东省某猪场患有明显腹泻症状的仔猪粪便中分离了1株产生明显细胞病变(CPE)的病毒。电镜观察显示,病毒粒子呈现较为典型的轮状病毒的形态特征;对其VP6基因进行序列分析,结果表明该分离株与A群猪轮状病毒代表株OSU和Gottfried的核苷酸同源分别为86.3%和80.8%,氨基酸序列同源性分别为97.7%和93.2%。综合所见,所分离的毒株为A群猪轮状病毒。

猪轮状病毒GD株VP6基因的克隆及序列分析

参考GenBank中发表的PRV OSU毒株VP6基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计1对特异引物,以PRV GD株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1.4 kb的基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明:VP6基因全长1320 bp,含有一个1194bp的开放阅读框,编码397个氨基酸。与国内外已知的11个毒株VP6基因的核苷酸及其推导的氨基酸序列比较,同源性分别为76.5%-95.6%和88.7%-99.2%;核苷酸系统发育进化树结果表明,GD毒株与轮状病毒JL94,CN86,OSU毒株亲缘关系较近,为一个进化群。

冻存时间及冻融次数对PRRSV毒价的影响试验

本试验对PRRSV-ShB6(P60)株进行了不同冻存时间和冻融次数对其毒价影响的评估。将病毒在-20℃冻存时间为90天,每隔15天进行毒价测定,结果发现其毒价下降趋势不明显,但病毒连续反复冻融12次,每次取样进行了病毒含量分析,结果发现其毒价整体呈波动性下降,前后变化较明显。结果表明,该毒株在科学合理的条件下保存,避免反复冻融,病毒活力相对稳定。

猪轮状病毒GD1株VP7基因的克隆及序列分析

参考GenBank中发表的PRV OSU毒株VP7基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计1对特异引物,以PRV GD1株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1 kb的基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明:VP7基因全长1 062 bp,含有一个981 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸。与国内外已知的13个毒株VP7全长基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较,相似性分别为77.4%～100%和78.6%～99.7%;核苷酸系统发育进化树结果表明,GD1毒株与轮状病毒A2,JP3-6毒株亲缘关系较近,为一个进化群。

核酸扩增技术及其在动物检疫中的应用、挑战与对策

核酸扩增技术是一种在生物技术领域广泛使用的技术,可通过特定的方法将DNA或RNA片段扩增至百万倍甚至更高倍数,从而检测和识别这些片段。核酸扩增技术包括多种方法,如实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)、数字PCR技术(digital PCR,dPCR)、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)等。在动物检疫方面,通过对动物体内特定病原体的核酸进行扩增,可以快速、准确地检测出该病原体,并采取相应的防控措施;通过对动物源性食品中的病原微生物进行核酸扩增,可以检测出食品中的细菌、病毒等有害物质,保证食品的安全性。随着技术的发展,核酸扩增技术将更加自动化、高通量和快速,灵敏度和特异性将进一步提高。随着微流控技术和纳米技术的发展,核酸扩增技术将变得更加便携,与人工智能、大数据等技术结合,实现智能化和信息化检测,多学科交叉将成为核酸扩增技术发展的重要趋势,有助于推动该技术的创新和应用。