中山大学附属第五医院生物样本库的建立与完善

生物样本库即标准化收集、处理、保存和使用各种离体生物样本和表型信息,为生物医学研究提供科研材料的资源库[1]。生物样本库涵盖了丰富的疾病临床信息与样本生物学信息,为疾病的研究、遗传和健康事业发展提供了战略性资源,是支撑转化医学和精准医疗实施的前提,更是研究型医院与学科建设的基石。欧美国家非常重视生物样本库的建设,1999年英国建立的生物信息库(UK Biobank)是目前世界上最大的医疗资料数据库。

H7N9禽流感病毒跨种间传播及其感染人气道黏膜的分子机制研究进展

H7N9型禽流感是一种新型的禽流感,2013年2月底在我国长三角地区率先暴发感染人的疫情。人感染的H7N9禽流感是由H7N9亚型禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病,经呼吸道传播。由于种属屏障,禽流感病毒只在偶然的情况下可以感染人,且目前尚未发现H7N9禽流感病毒在人与人之间传播的确切证据。然而,H7N9禽流感已成为一种持续的公共卫生威胁,截至目前,中国已暴发了6次H7N9禽流感疫情,向WHO报告的H7N9禽流感病毒感染病例已有1567例,其中615例死亡。在H7N9禽流感病毒感染人体的过程中,呼吸道黏膜上皮细胞首当其冲,在病毒传播和感染过程中起关键作用。H7N9禽流感病毒如何跨越种属屏障造成人的感染,以及禽流感病毒感染宿主而导致的黏膜损伤诱发的免疫应答的分子机制,是该综述探讨的主要方向。

多靶点抑制剂西奥罗尼增强人胶质瘤细胞放射敏感性的机制

目的:探索多靶点抑制剂西奥罗尼对人胶质瘤细胞放射敏感性的影响及其机制。方法:利用CCK-8实验和集落形成实验测定西奥罗尼对人胶质瘤U251细胞和T98G细胞增殖能力的影响。进一步,对U251细胞和T98G细胞进行药物和(或)X射线处理,设对照组、西奥罗尼(2.5μmol/L)组、4 Gy辐照组和西奥罗尼(2.5μmol/L)联合4 Gy辐照组,流式细胞术检测4组细胞的细胞周期和凋亡变化;通过Westernblot检测4组细胞周期和凋亡关键蛋白的表达量;通过免疫荧光实验,探索西奥罗尼联合辐照对DNA损伤和修复的影响;最后通过Western blot检测DNA损伤修复关键蛋白的表达量。结果:与对照组相比,西奥罗尼显著抑制U251细胞和T98G细胞的增殖,半数抑制浓度(IC_(50))分别为7.773μmol/L和24.68μmol/L;随着X射线剂量的增加,细胞存活率在X射线辐照组和联合组中均显著降低,并且联合组在不同射线剂量的细胞存活率均低于单独辐照组,西奥罗尼的辐射增敏比(SER)分别为1.387和1.384。U251细胞对照组、西奥罗尼(2.5μmol/L)组、4 Gy辐照组和西奥罗尼(2.5μmol/L)联合4 Gy辐照组中处于G_(2)/M期的细胞比例分别为(17.68±0.98)%、(18.93±0.03)%、(16.31±0.58)%和(23.96±1.18)%;4组细胞的总凋亡率分别为(8.04±0.24)%、(17.04±0.75)%、(9.34±0.50)%和(21.22±0.38)%。T98G细胞对照组、西奥罗尼(2.5μmol/L)组、4 Gy辐照组和西奥罗尼(2.5μmol/L)联合4 Gy辐照组中处于G_(2)/M期的细胞比例分别为(2.05±0.71)%、(5.70±0.34)%、(5.14±0.33)%和(6.54±0.13)%;4组细胞的总凋亡率分别为(11.35±0.39)%、(13.23±0.18)%、(17.43±0.30)%和(21.32±0.64)%。免疫荧光实验发现,在30 min,γH2AX荧光灶点在单纯辐照组和联合组中均十分明显,并且联合组的荧光强度更强;在6 h和24 h,γH2AX荧光灶点在X射线辐照组中逐渐减少,而在联合组中可以观察到γH2AX的荧光强度依然较强。结论:西奥罗尼通过诱导G_(2)/M期阻滞、促进凋亡、诱导DNA损伤及延迟DNA修复来增强人胶质瘤细胞的放射敏感性。

二甲双胍和孟鲁司特在急性和慢性过敏性哮喘小鼠模型中的作用

【目的】对比分析屋尘螨(HDM)诱导的过敏性哮喘小鼠模型26 d的急性模型和59 d的慢性模型,评价二甲双胍和孟鲁司特对气道炎症和气道重塑病理效应的改善作用。【方法】HDM致敏和激发构建急性和慢性过敏性哮喘小鼠模型,设置药物干预组包括阳性药物对照组(HDM+布地奈德)、二甲双胍组(HDM+二甲双胍)和孟鲁司特钠组(HDM+孟鲁司特钠),干预药物于每次HDM激发前1 h或30 min,经滴鼻(布地奈德1mg/kg)或腹腔注射(二甲双胍200 mg/kg、孟鲁司特钠10 mg/kg)给药。各实验组小鼠处死后苏木素-伊红染色和马松染色分析小鼠的肺部病理特征;采用Image J软件进行气道炎症细胞浸润评分和胶原沉积评分,以及分析支气管形态参数,包括支气管壁厚度和支气管平滑肌厚度;采用ELISA方法检测小鼠血清总IgE水平,qRT-PCR检测炎症因子IL-4、IL-5、IL-13 mRNA转录水平。【结果】慢性模型小鼠的血清总IgE水平、气道周围胶原沉积程度、气道平滑肌厚度显著高于急性模型小鼠(P<0.05)。布地奈德干预可以显著改善急性组小鼠的气道炎症(P<0.05);和HDM造模组相比,二甲双胍干预对HDM诱导急性哮喘小鼠有明显的气道炎症改善(P<0.05)作用,对气道重塑无显著作用(P>0.05),对慢性模型小鼠的气道炎症和气道重塑均无显著作用(P>0.05);在慢性组的孟鲁司特钠干预组中,小鼠的气道炎症和气道重塑均无明显的改善(P>0.05)。【结论】相比26 d的急性模型,59 d的慢性哮喘模型有更高水平的炎症反应和气道重塑效应,二甲双胍能有效改善HDM诱导急性哮喘小鼠中的气道炎症,孟鲁司特钠对慢性哮喘小鼠气道炎症和气道重塑均无显著作用。

整合素β4调控脑血管发育

【目的】探讨整合素β4(ITGB 4)对脑血管生长发育的调控作用。【方法】通过逆转录PCR(RT-PCR)检测靶向itgb 4 mRNA序列的吗啉环(MO)在斑马鱼胚胎中的敲低效果。利用体视显微镜和激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)观察抑制itgb 4表达后,斑马鱼胚胎脑部血管的发育变化。通过在斑马鱼胚胎中注射4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)染料检测血脑屏障(BBB)发育的完整性。使用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在永生化人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D 3)中敲低ITGB 4,用蛋白免疫印迹(WB)检测其敲低效果。通过活细胞成像分析仪(IncuCyte®)、基质胶(Matrigel®matrix)成管实验和transwell迁移实验分别检测ITGB 4在hCMEC/D 3中调控细胞增殖、成管和迁移的作用。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测敲低itgb 4后Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因表达变化。【结果】在斑马鱼胚胎中敲降itgb 4引起脑水肿、脑部出血、血脑屏障形成障碍以及后脑血管数量减少等相关表型。细胞实验结果显示,在hCMEC/D 3细胞中抑制ITGB 4的表达导致细胞增殖减缓,管腔形成减少及迁移能力减弱。此外,qRT-PCR结果表明,在斑马鱼胚胎中敲低itgb 4抑制Wnt/β-catenin通路下游靶基因的表达。最后,在hCMEC/D 3细胞中敲低ITGB 4后,通过添加Wnt/β-catenin通路激活剂(BML-284)能明显挽回迁移减少的表型。【结论】ITGB 4通过调节脑血管内皮细胞的增殖、迁移和成管等功能促进脑血管发育并参与调控血脑屏障的形成。

基于网络药理学和分子对接法研究六堡茶干预COVID-19的活性成分

采用网络药理学和分子对接法探究六堡茶干预COVID-19的物质基础和作用机制。通过文献与中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)等数据库,检索得到六堡茶的化学成分并对其进行筛选得到六堡茶活性成分及对应靶标,并将对应靶标导入Uniprot数据库中进行基因名的校正,运用Cytoscape 3.7.1软件构建"六堡茶-成分-靶标"网络。通过GeneCards数据库对COVID-19疾病靶点进行预测。将六堡茶与疾病的靶标进行映射,采用STRING数据库分析靶标蛋白的互作关系,从中筛选出核心靶标并运用DAVID等数据库对核心靶标进行GO(gene ontology)富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析。最后将筛选出来的活性成分与受体蛋白SARS-CoV-2 3CL水解酶(Mpro)进行分子对接。筛选得到6种六堡茶活性成分,分别是(+)-儿茶素、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、α-菠甾醇、(-)-儿茶素没食子酸酯、角鲨烯和氯化天竺葵素,对应作用靶标156个。其中与COVID-19的共同靶标112个,核心靶标38个。GO富集分析(P <0.01)主要涉及脂多糖、细胞对缺氧的反应等。KEGG通路富集分析得到六堡茶干预COVID-19相关的HIF-1、IL-17、T细胞受体等信号通路。分子对接结果显示六堡茶中的6种主要化学成分可分别与受体蛋白Mpro结合较好,且结合能与现有报道推荐的临床使用化学药相近。六堡茶中的核心化学成分(+)-儿茶素、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、α-菠甾醇、(-)-儿茶素没食子酸酯、角鲨烯、氯化天竺葵素与Mpro结合并通过MAPK1、TNF等炎症和免疫相关的靶标介导HIF-1、IL-17、T细胞受体等信号通路发挥干预COVID-19的功效。实验进一步对结合能较低的EGCG进行了Mpro的活力测定,发现IC50为3.4μmol/L,证实EGCG对Mpro有一定的抑制效果。

PGE2通过促进EP4受体表达调控脂多糖诱导的膀胱上皮细胞炎症反应

目的:探讨PGE2对脂多糖诱导的膀胱上皮细胞炎症反应的影响及相关机制。方法:利用脂多糖诱导人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)建立膀胱炎细胞模型,采用实时荧光定量PCR检测PGE2作用后膀胱上皮细胞中EP4受体的表达水平变化。利用EP4受体激动剂和拮抗剂作用于膀胱上皮细胞,MTT方法检测其对细胞增殖的影响。最后分别利用PGE2及EP4受体激动剂、拮抗剂作用于膀胱上皮细胞,ELISA方法检测细胞培养液中IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α的变化。结果:PGE2促进膀胱上皮细胞中EP4受体的表达,并呈时间依赖。EP4受体激动剂(CAY10598)促进膀胱上皮细胞的细胞增殖,而EP4受体拮抗剂(AH23848)抑制细胞增殖(P<0.05)。ELISA法检测发现,PGE2和CAY10598能促进膀胱上皮细胞培养液中IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子的表达,而AH23848则起到抑制作用(P<0.05)。结论:PGE2通过上调EP4受体表达促进脂多糖诱导的膀胱上皮细胞炎症反应,PGE2/EP4受体有望是膀胱炎治疗的潜在靶点。

肝癌免疫治疗联合放射治疗进展

免疫检查点抑制剂(ICI)的应用给肝细胞癌(HCC)的全身性治疗带来了新的选择。肿瘤的治疗经历了从传统治疗模式向靶向肿瘤微环境(TME)模式的巨大转变。然而,单独使用免疫检查点阻断(ICB)药物治疗的疗效有限,而将免疫疗法与当前的治疗策略相结合可能产生更好的效果。放射治疗(RT)是包括HCC在内的实体癌症治疗中不可或缺的组成部分。体部立体定向放射治疗(SBRT)在过去的10年中已被用于治疗原发性HCC并且取得了不错的成绩。大剂量的放疗更容易产生远位效应,提示其潜在的免疫激活作用。免疫治疗与放射治疗相结合可能是一种有希望协同增强疗效的策略。其机制可能是射线照射到肿瘤部位会同时影响肿瘤细胞和周围的基质细胞。辐射诱导的癌细胞损伤暴露了肿瘤特异性抗原,使其在免疫监视中可见,并促进细胞毒性T细胞的启动和激活。RT和ICB联合治疗疗效在一些临床研究中也得到了证实。但是要最大程度地发挥两者联用的疗效是有待解决的挑战。文章总结了HCC中RT和ICB联合治疗的进展,以及放疗和免疫系统协同作用的机制,并讨论了目前放疗和免疫检查点阻断疗法中的挑战以及未来增强这种组合可能的方法。

TLR4信号通路介导病毒性急性肺损伤与ARDS的研究进展

Toll样受体(Toll⁃like receptors,TLR)是参与非特异性免疫的Ⅰ型跨膜蛋白分子,可识别病原相关分子模式(Pathogen⁃associated molecular patterns,PAMP)并在病原体侵入体内的早期阶段激活机体的免疫应答,在响应宿主细胞对微生物病原体的识别中起重要作用,是机体抵抗感染疾病的重要屏障。以流感病毒和冠状病毒为代表的呼吸道病毒感染在临床具有极高的发病率和死亡率。此类病毒感染细胞后可通过模式识别受体和病原体相关分子模式相互作用激活宿主的先天免疫系统,诱发宿主产生过激的炎症反应从而引发“细胞因子风暴”,最终导致急性肺损伤与急性呼吸窘迫综合症而致人死亡。因此,本文就Toll样受体家族中的Toll样受体4介导的信号通路为对象,就其介导的信号通路在流感病毒与冠状病毒复制及其在导致病毒性急性肺损伤与ARDS形成中的作用及靶向抑制该通路治疗病毒性肺炎的研究进展作一综述,以供同行参考。

基于c-Met抗体的近红外荧光探针用于肝癌的活体成像研究

目的探靶向近红外荧光成像为肝癌的精准诊疗带来了重要的契机,而且细胞间质表皮转化因子(c-Met)在肝癌中的表达显著高于正常肝组织。因此,本研究拟采用靶向c-Met的近红外荧光探针SHRmAb-IR800进行肝癌的活体成像研究。方法从TCGA和HPA数据库中获取并分析c-Met mRNA和蛋白的表达信息。通过Western Blot分析人肝癌细胞系中c-Met蛋白的表达情况。采用流式细胞技术和共聚焦成像实验评估SHRmAb-IR800与肝癌细胞的体外特异结合能力。构建肝癌皮下瘤模型,进行活体成像分析,并量化SHRmAb-IR800的成像肿瘤背景比。结果通过数据库分析发现肝癌中的c-Met mRNA和蛋白表达增加。Western Blot分析也显示人肝癌细胞系表达c-Met蛋白。流式细胞术和共聚焦成像实验均显示探针能特异性靶向c-Met阳性的人源肝癌细胞株;肝癌皮下瘤模型的近红外荧光成像显示靶向探针在皮下瘤的聚集显著高于对照探针(P<0.05),并且探针在96 h的成像肿瘤背景比达到(2.01±0.18)。结论本研究发现靶向c-Met近红外探针能够特异识别c-Met阳性的肝癌细胞和组织,有助于肝癌的诊断,在肝癌的手术导航方面具有潜在应用价值。

经聚乙烯亚胺钝化的荧光碳点负载阿霉素抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移侵袭的治疗研究

目的研究利用经聚乙烯亚胺(PEI)钝化的荧光碳点(CD)装载阿霉素(DOX)进行药物递送,旨在增加DOX对非小细胞肺癌的治疗作用,减少DOX的心肌毒性。方法通过一步微波加热法将甘油和PEI的混合物制备成CD-PEI,并通过静电效应将DOX装载至CD-PEI。采用CCK8实验检测CD-PEI-DOX对非小细胞肺癌细胞A549的增殖能力的影响;Transwell实验评估CD-PEI-DOX对A549细胞迁移侵袭能力的影响;最后通过体内动物实验评估CD-PEI-DOX的心肌毒性以及对非小细胞肺癌皮下肿瘤生长的抑制效果。结果体外细胞实验证实,对比单纯的DOX处理组,CD-PEI-DOX对非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭能力的抑制作用更为显著。体内实验证实,CD-PEI-DOX纳米复合物治疗组小鼠心肌细胞结构完整,并且能有效抑制小鼠皮下肺癌肿瘤的生长。结论经PEI钝化的荧光碳点负载阿霉素能显著提高DOX对非小细胞肺癌的治疗效果,并减少DOX对心脏的毒性作用。运用CD-PEI纳米颗粒改善化疗药物递送的治疗方案取得了初步证实,这可为肺癌化学治疗提供新思路,具有广大的临床应用前景。

糖皮质激素下调JAK/STAT抑制嗜酸粒细胞哮喘

目的:探究糖皮质激素对嗜酸粒细胞哮喘(Eosinophilic asthma, EA) 2型固有免疫细胞(Type 2 innate lymphoid cells, ILC2s)的影响及相关机制。方法:研究对象来自我院2021年6月至2022年6月的EA患者和健康对照(Healthy control, HC),收集相应临床基线资料并评估病情、进行血常规、肺功能等检查;应用流式细胞术检测外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)ILC2s(CD45+Lin-CD127+CD294+);ELISA检测外周血IL-5、IL-13浓度。糖皮质激素治疗EA患者3月后,观察PBMC中ILC2s及IL-5、IL-13浓度。C57BL/6J小鼠给予鸡卵清蛋白(Ovalbumin,OVA) 20μg腹腔注射致敏后用1%OVA雾化吸入激发哮喘EA模型,阴性对照(Negative control, NC)组小鼠用同等体积PBS作为对照。EA造模成功的小鼠通过流式细胞术检测血液及肺泡灌洗液中ILC2s,HE染色检测小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞(Eosinophil, EOS)及肺部炎症。EA小鼠经糖皮质激素处理后,检测肺部炎症情况;流式细胞术检测PBMC、肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中ILC2s;分离肺组织ILC2s,western blot检测相关蛋白表达情况。结果:EA组的ILC2s比例升高,EOS升高,2型细胞因子IL-5、IL-13增加,糖皮质激素治疗1月及3月后ILC2s比例下降,2型细胞因子IL-5、IL-13下降。与NC组小鼠比较,EA组小鼠PBMC及BALF中ILC2s升高,BALF中EOS升高,血清中2型细胞因子IL-5、IL-13升高,肺部炎症加重。糖皮质激素治疗后,肺部炎症减轻,EOS下降,ILC2s减少,2型细胞因子IL-5、IL-13下降,下调JAK/STAT蛋白。结论:在EA中,糖皮质激素通过下调JAK/STAT蛋白抑制ILC2s的功能减轻肺部炎症,为激素治疗嗜酸性粒细胞哮喘的机制提供了新方向。

搭载达沙替尼的巨噬细胞膜囊泡用于缺血性脑卒中的治疗研究

目的研究开发靶向缺血性大脑和跨血脑屏障的纳米载体,帮助达沙替尼(DAS)有效地输送到大脑,以减轻缺血性脑卒中(IS)后局部炎症反应和神经损伤。方法提取巨噬细胞膜构建搭载DAS的纳米囊泡。经尾静脉给药IS小鼠后,通过各器官组织切片HE染色分析载药囊泡的生物安全性。采用荧光标记载药囊泡,利用活体成像和免疫荧光分析载药囊泡的大脑靶向性和生物分布。对不同治疗处理组做神经功能评分、死亡率统计和神经细胞计数,评估载药囊泡的神经保护作用。结果载药囊泡在活体内具有良好的生物安全性,可快速高效靶向缺血侧脑组织内并被神经细胞摄取。对比单纯的DAS治疗,载药囊泡治疗可明显改善IS小鼠的神经功能,降低死亡率,减少神经细胞的凋亡。结论研究证实搭载DAS的巨噬细胞膜纳米囊泡可安全高效靶向缺血侧大脑递药,有效发挥抗炎和神经保护作用,可为改善IS后药物治疗提供新思路。

血管内皮细胞Ddx24基因条件性敲除鼠构建以及对视网膜血管新生的影响

目的构建血管内皮细胞Ddx24基因条件性敲除小鼠(Cdh5-Cre×Ddx24^(flox/flox)),并利用该模型探索Ddx24基因对小鼠胚胎发育和视网膜血管新生的影响,为进一步探讨DDX24基因在内脏血管畸形中发挥的功能作用和具体分子机制提供动物模型。方法运用Cre-LoxP系统构建Ddx24基因的Flox修饰小鼠,并与血管内皮细胞特异性表达Cre酶的Cdh5-Cre小鼠进行繁育,以建立Cdh5-Cre×Ddx24^(flox/flox)小鼠模型。利用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行基因鉴定,然后利用Western blot或qPCR实验验证Cdh5-Cre×Ddx24^(flox/flox)小鼠血管组织中DDX24蛋白和mRNA的表达改变,最后通过H&E染色和免疫荧光实验观察Cdh5-Cre×Ddx24^(flox/flox)小鼠胚胎和视网膜血管发育的变化。结果成功构建Cdh5-Cre×Ddx24^(flox/flox)小鼠,并通过Western Blot和qPCR检测发现Cdh5-Cre×Ddx24^(flox/flox)小鼠血管组织中DDX24表达显著下降;在血管内皮细胞中敲除Ddx24基因后无胚胎致死性,可导致幼鼠视网膜血管新生异常增多。结论利用Cre-LoxP系统获得Cdh5-Cre×Ddx24^(flox/flox)小鼠,发现血管内皮细胞条件性敲除Ddx24基因可使幼鼠视网膜血管新生异常增多,为研究DDX24在内脏血管畸形中的作用提供了有效动物模型。