中药种质资源生物化学的学科探讨

中药种质资源生物化学是现代科学技术迅速发展并不断向中药资源学渗透而产生的一门二级交叉学科,指利用生物化学及分子生物学、化学等技术手段,系统研究中药基原物种种质(简称:中药种质)的遗传变异、基因转录、蛋白表达与物质代谢,阐明中药种质特征及其形成的分子调控机制,旨在为中药种质鉴别、优化,中药及药效活性成分的生产提供生物化学理论知识基础。本文就中药种质资源生物化学学科产生的时代背景、概念、意义、定位、研究内容等进行了论述,冀求广大同仁的共鸣与探讨。

化州柚花挥发油的GC-MS分析及其对肺癌细胞A549增殖、迁移的影响研究

目的:提取化州柚花挥发油,鉴定其成分,并评价其对肺癌细胞A549增殖、迁移的体外抑制作用。方法:采用水蒸气蒸馏法提取化州柚花挥发油;采用气质联用法(GC-MS)分析其化学组成,以峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量;采用MTT法检测其对肺癌细胞A549增殖的抑制作用,计算细胞相对活力和增殖抑制率;采用细胞划痕实验评价其对肺癌细胞A549迁移能力的影响,计算相对迁移面积和迁移抑制率。结果:从100 g化州柚花中提取得到挥发油0.7 g,得率为0.7%。共从中分离得到了46个组分,鉴定了其中35个组分,占总峰面积的96.95%;相对百分含量较高的化合物包括D-柠檬烯(28.43%)、γ-萜品烯(20.74%)、β-月桂烯(11.97%)、芳樟醇(7.41%)等。与空白对照组比较,120 mg/L化州柚花挥发油可显著降低肺癌细胞A549的相对活力(P<0.05),增殖抑制率上升至21.72%;而1、5、10、20、40、60、80、100 mg/L化州柚花挥发油对肺癌细胞A549的相对活力均无显著影响(P>0.05)。作用24、48 h时,60、120 mg/L化州柚花挥发油可显著缩小肺癌细胞A549的相对迁移面积(P<0.05),迁移抑制率分别为132.46%、125.08%(24 h)和124.54%、124.66%(48 h);而30 mg/L化州柚花挥发油对肺癌细胞A549的相对迁移面积均无显著影响(P>0.05)。结论:GC-MS法可用于鉴定化州柚花挥发油的化学组成。化州柚花挥发油以D-柠檬烯、γ-萜品烯、β-月桂烯等成分为主,对肺癌细胞A549的增殖、迁移能力具有一定的体外抑制作用。

溪黄草DNA条形码鉴定研究

目的:研究DNA条形码技术在溪黄草药材品种鉴定中的适用性。方法:选取rbcL、psbA-trnH、matK和ITS2等4个条形码标记,对41份溪黄草药材样品(含溪黄草Rabdosia serra、线纹香茶菜R.lophanthoides和纤花香茶菜R.lophanthoides var.graciliflora)进行DNA提取、PCR扩增及双向测序,对测序结果进行质量检查、人工校对和序列拼接获取标准碱基序列信息,通过比较序列获得成功率以及物种鉴定力(TaxonGap法),筛选适合溪黄草基原鉴定的DNA条形码序列。结果:条形码序列获得成功率依次为rbcL(100%)、psbA-trnH(90.2%)、ITS2(87.8%)和matK(70.7%);物种鉴定力方面,rbcL、psbA-trnH和ITS2等3条序列均可有效鉴定不同物种,但不适于分辨种下单位。结论:综合考察序列易得性和物种鉴定力,rbcL可作为溪黄草品种鉴定的首选条形码。

丁公藤扦插繁殖与组织培养研究

为了建立丁公藤扦插繁殖和组织培养方法,设计正交实验,考察插枝长度、插枝浸润和浇灌的生根液浓度对丁公藤扦插存活及出芽的影响,考察不同种类和浓度的植物激素以及来源于不同叶位的外植体对丁公藤愈伤组织诱导的影响。根据正交试验结果,丁公藤扦插繁殖的最优条件组合为:扦插前浸润生根液浓度为15%、插枝长度为10～12 cm、扦插后浇灌生根液浓度为0.1%,扦插后第43 d的最高存活率和出芽率分别达到87.5%和50%;诱导愈伤组织的最优培养基为MS+0.25 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA+2 g/L Na2S2O3,室内培养的扦插苗第2位叶为诱导愈伤组织的最适外植体,诱导率最高达94.44%。建立了丁公藤扦插繁殖和愈伤组织诱导方法,为通过人工快繁缓解丁公藤资源紧缺提供了基础。

无患子皂苷诱导人肺癌A549细胞凋亡的作用及其机制研究

目的:探讨无患子皂苷对人肺癌A549细胞的影响及其可能的分子机制。方法:采用MTT法检测无患子皂苷溶液对A549细胞增殖抑制作用;Hoechst 33258荧光染色和流式细胞术观察和检测细胞凋亡情况;实时荧光定量PCR法检测凋亡基因bcl-2 m RNA的表达。结果:无患子皂苷能显著抑制A549细胞的增殖,且呈浓度依赖性;Hoechst 33258荧光染色和流式细胞术结果显示无患子皂苷可以诱导A549细胞凋亡,实时荧光定量PCR法表明不同浓度的无患子皂苷均能明显降低bcl-2的表达。结论:无患子皂苷可通过诱导细胞凋亡而抑制A549细胞增殖,其作用可能与下调细胞凋亡相关基因bcl-2的表达有关。

基于psbA-trnH序列的鳞毛蕨属贯众药材基原植物的鉴定研究

目的:研究psbA-trnH序列在近缘贯众基原物种鉴定中的有效性。方法:对常见鳞毛蕨属贯众基原物种psbA-trnH序列进行PCR扩增及测序,原始峰图通过CodonCode Aligner软件查看、拼接和校对,并根据GenBank注释截取标准条形码数据。利用TaxonGap方法在实验物种范围(9物种19样品)和扩大范围(17物种44样品)内评估该序列的鉴定效率。结果:物种鉴定范围扩大后psbA-trnH序列鉴定成功率由100%(9/9)降至82.4%(14/17),种内异质性数值高于种间可分离性的比例,由11.1%(1/9)上升为52.9%(9/17)。结论:psbA-trnH序列可作为整体贯众同名异物品种鉴定的推荐条形码,实际应用中需注意种内采样代表性的问题。

三叉苦茎HPLC指纹图谱研究

目的:建立三叉苦茎的HPLC指纹图谱,为三叉苦药材质量控制提供参考。方法:采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),以甲醇-0.2%磷酸溶液为流动相,梯度洗脱;柱温为30℃;检测波长为240 nm;进样量为20μL;采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)"计算相似度,SPSS 22.0统计软件进行聚类分析和主成分分析,比较三叉苦不同部位(根、茎、带叶嫩枝)的HPLC色谱图。结果:建立了三叉苦茎的HPLC指纹图谱,确定了13个共有峰。28批三叉苦茎指纹图谱与对照图谱的相似度为0.225~0.990,其中22批样品的相似度在0.900以上,28批样品聚为3类。三叉苦茎HPLC色谱图与根相似,与带叶嫩枝差别较大。结论:三叉苦茎HPLC指纹图谱的建立和不同部位色谱图的比较可为三叉苦药材质量评价提供依据。

广东不同地区三叉苦营养袋种苗的生长评价和分级标准研究

目的:为三叉苦营养袋种苗质量评价标准的制定提供参考依据。方法:收集广东不同地区三叉苦营养袋种苗,通过测定种苗的地径(D)和株高(H)等形态指标,采用数理统计方法,确定主要分级指标,从而制定种苗分级标准。结果:三叉苦营养袋种苗的分级标准为:Ⅰ级种苗,D≥0.55 cm、H≥40 cm;Ⅱ级种苗,0.55 cm>D≥0.45 cm、40 cm>H≥30 cm;Ⅲ级种苗,D<0.45 cm、H<30 cm;平远和五华Ⅱ级以上的种苗占比分别为93.5%和93%,其生长最好,而高州种苗几乎均为Ⅲ级,占比高达92.5%,其素质最差。结论:建立了简单、方便、可行的三叉苦营养袋种苗分级标准,可为三叉苦药材的规范化生产提供一定的参考依据。

两面针根与茎的UPLC特征图谱研究及药效成分分析

目的:综合分析两面针根和茎的特征图谱及化学成分。方法:采用UPLC法建立两面针根和茎的特征图谱,并对其整体成分进行综合分析,从中筛选出差异标记物;采用分子对接和试验验证法对差异标记物进行研究。结果:两面针根和茎均含有18个共有峰,指认了9个成分;二者特征图谱的相似度为0.385~0.960;聚类分析显示两面针根和茎样品被聚为3类,其中部分根样品与全部茎样品聚为一类;主成分分析和正交偏最小二乘判别分析结果显示两面针根样品比较离散,茎样品较为集中,通过筛选获得6个差异标记物;分子对接和验证试验结果均显示L⁃芝麻脂素>白屈菜红碱>木兰花碱>氯化两面针碱。结论:建立的两面针根与茎UPLC特征图谱方法简便易行,筛选获得的差异标记成分可为完善两面针质量评价体系提供参考。

HS-GC-MS结合ROAV分析不同品种橘红花挥发性成分

目的:系统研究不同品种橘红花挥发性成分差异和香气特征。方法:利用顶空-气相色谱-质谱法(HSGC-MS)对4个品种(“光青”“假西洋”“密叶正毛”和“黄龙正毛”)共40批橘红花的挥发性成分进行检测,结合相对气味活度值(ROAV)分析其中的关键香气成分。采用多元统计分析筛选不同品种橘红花显著性差异成分和特征香气成分。结果:HS-GC-MS检测结果显示,从4个品种橘红花中共鉴定出40个挥发性成分,主要包括烯烃类、醇类、酯类、酮类和醛类,其中以柠檬烯、β-月桂烯、芳樟醇、反式-橙花叔醇等为共有且含量较高的成分。通过ROAV确定了4个品种橘红花共有关键香气成分8个。挥发性成分差异分析结果显示,21个差异标志物可用于品种判别,其中β-蒎烯是“假西洋”的特征香气成分,芳樟醇是“密叶正毛”的特征香气成分,苯乙醛、反式-橙花叔醇和邻氨基苯甲酸甲酯是“黄龙正毛”的特征香气成分。结论:HS-GC-MS结合ROAV系统分析可区分不同品种橘红花并鉴定差异性的特征香气成分,该方法可为橘红花的品种判别和资源综合开发利用提供参考。

岗梅转录组及其乌索烷型三萜皂苷生物合成相关酶基因的发掘

目的:发掘与岗梅乌索烷型三萜皂苷生物合成相关的酶基因。方法:利用Illumina测序平台对岗梅根进行转录组测序,通过基因注释、同源分析、系统发生分析等生物信息学手段,发掘可能参与合成的单基因簇(Unigenes)。结果:在岗梅根转录组中发现了272条与萜类生物合成相关的Unigenes。这其中包括72条可能参与萜类生物合成上游途径的Unigenes,以及26条可能与三萜合成途径下游母核合成、氧化和糖基化相关的Unigenes。对其中部分Unigenes进行系统发生分析,进一步揭示了这些Unigenes与同源基因间的进化关系。利用酵母表达系统,鉴定了两个香树酯醇合酶IaAS1和IaAS2,其中IaAS1为少数以α-香树脂醇为主要产物的香树酯醇合酶之一。结论:本文从岗梅根转录组数据库中发掘到一系列可能与岗梅乌索烷型三萜皂苷生物合成相关的酶基因。对这些基因的进一步研究,有助于从分子水平揭示岗梅中乌索烷型三萜皂苷的生物合成途径。

黄芪破壁饮片煎煮、冲泡与传统饮片煎煮后5种有效成分溶出含量比较

目的:比较黄芪破壁饮片煎煮、冲泡与传统饮片煎煮后有效成分溶出含量的差异,为黄芪破壁饮片临床应用提供参考。方法:通过正交试验确定黄芪破壁饮片和传统饮片最优的煎煮工艺[液料比(m L/g)、煎煮次数、煎煮前浸泡时间(min)]以及破壁饮片最优冲泡工艺[水温(℃)、液料比、冲泡次数],在各自的最优工艺下比较5种成分(黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素)在不同煎煮/冲泡时间点的溶出含量差异。结果:黄芪破壁饮片按最优煎煮工艺(液料比50∶1,煎煮前不浸泡,煎煮2次)煎煮5~10 min时其有效成分溶出含量已达到传统饮片煎煮(煎煮前浸泡30 min,液料比50∶1,煎煮3次)30 min的溶出含量;其在最优冲泡工艺(液料比75∶1,水温100℃,冲泡3次)下有效成分可以达到传统饮片煎煮时溶出含量的80%~90%。结论:黄芪饮片经过破壁后有效成分溶出速率更快,可以免去煎煮前浸泡时间,并减少煎煮时间、次数,煎煮效率显著提高;临床使用时可采用冲泡方式。

药用植物青天葵的悬浮培养条件优化

以悬浮细胞干重增加率、酶活力为考察指标,研究不同培养基、光照条件、蔗糖浓度、培养基pH值对药用植物青天葵细胞生长的影响,对青天葵悬浮细胞培养方法进行条件优化。结果表明,1/4MS和1/2MS培养物外观形态最佳,1/2MS组培养物干重增加率最大,MDA含量最低,POD含量最高;暗培养条件有利于愈伤组织干重的增加;蔗糖浓度为1%时愈伤组织干重增加率显著高于其他处理组,pH6.0为青天葵悬浮培养的合适pH值,培养基中添加MES可明显提高干重增加率。

胃乃安新制剂对水浸束缚应激性胃溃疡的药效作用

目的:观察胃乃安新制剂对水浸束缚应激性胃溃疡的作用及其作用机制。方法:在应激性胃溃疡模型下,从肉眼观察、病理切片、透射电镜三个层面评价胃乃安新制剂对水浸束缚应激性胃溃疡的药效,并检测胃组织的丙二醛、超氧化物歧化酶水平以探讨胃乃安可能的作用机制。结果:与模型组比较,肉眼观察及病理切片评分结果表明,高剂量组、雷尼替丁组均有抗应激性胃溃疡效果(P<0.01),且新制剂抗溃疡效果呈剂量依赖性关系;透射电镜观察结果表明新制剂可明显逆转主细胞、壁细胞的超微结构损伤性改变;新制剂可降低胃组织MDA含量,升高SOD活性。结论:胃乃安新制剂对水浸束缚应激性胃溃疡有显著抗损伤作用,其机理可能与抗氧化,清除自由基有关。

加速老化对穿心莲种子萌发活力的影响

考察了室温和低温贮藏2年的穿心莲种子经41℃、100%R.H.条件下加速老化1~7 d后的萌发活力和萌发过程中幼苗生长量的变化,结果表明：室温贮藏种子的发芽率为0;低温贮藏种子发芽率为93.5%,且老化1~2 d后萌发活力未见显著变化,老化3~4 d后则加速了萌发,老化5~7 d萌发活力和幼苗株高显著下降。因此,低温贮藏是实际可行的方法,对穿心莲种子批进行活力检测时需要老化5 d以上。

新胃乃安片中4种异黄酮成分的含量测定及一测多评法的建立

目的:建立同时测定新胃乃安片中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素等4种异黄酮成分的含量测定方法。方法:采用HPLC外标法测定上述4种异黄酮成分的含量,以毛蕊异黄酮苷为内参物,建立毛蕊异黄酮苷与芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的相对校正因子,通过相对校正因子计算出芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的量,计算结果与外标法实测值进行比较。结果:建立了一测多评同时测定新胃乃安片中4种异黄酮成分的含量测定方法,该方法与外标法测定结果没有明显差异。结论:该研究建立的一测多评法简单方便,可同时测定新胃乃安片中4种异黄酮类成分含量,为建立完善的新胃乃安片质量标准提供参考依据。

两种桃金娘科不同属植物叶挥发油成分GC-MS分析及其抗肺癌A549、H460细胞增殖活性

为了比较分析莲雾叶、白千层叶挥发油成分的异同,并研究其对人肺癌A549、H460细胞增殖活性的影响,本研究利用水蒸气蒸馏法提取莲雾叶、白千层叶挥发油成分,以气相色谱-质谱联用(GC-MS)法比较分析其化学成分,采用MTT法评价其对人肺癌A549、H460细胞增殖活性的影响。GC-MS分析结果显示,从莲雾叶挥发油中分离鉴定了38种化合物,主要成分为石竹烯、à-芹子烯、β-桉叶烯、(+)-δ-杜松烯和蓝桉醇等;从白千层叶挥发油中分离鉴定了28种化合物,主要成分为桉树脑、(1)-2,6,6-三甲基双环[3.1.1]庚-2-烯、α-松油醇、D-柠檬烯和表蓝桉醇等;两种挥发油含有13种共有化合物,其保留时间基本一致,相对含量相差0.3~27倍;两种挥发油中含量较高的五种化合物的结构、相对含量均不相同。MTT法测试结果表明,作用24 h后,莲雾叶挥发油在浓度为40 mg/L时,对人肺癌细胞A549的细胞增殖能力产生显著的抑制作用(p<0.05),在浓度为60 mg/L时,对人肺癌细胞H460的细胞增殖能力产生极显著的抑制作用(p<0.001),并呈剂量依赖性,抑制作用随着浓度的增大而增强,其IC50值分别为49.99、65.70 mg/L;白千层叶挥发油对人肺癌A549、H460细胞均无明显生长抑制作用(p>0.05)。综上所述,莲雾、白千层同属于桃金娘科,但其干燥叶挥发油所含化合物种类及相对含量以及对人肺癌细胞A549、H460的细胞增殖能力所产生的影响均不相同。

紫檀芪对白色念珠菌生物膜的体外抑制作用

目的研究紫檀芪对白色念珠菌Candida albicans生物膜的体外抑制作用。方法采用XTT还原比色法考察紫檀芪对C.albicans成膜的影响,评估不同生长阶段C.albicans生物膜对紫檀芪的药敏性,倒置显微镜观察药物作用后C.albicans生物膜的形态学变化。结果紫檀芪对C.albicans生物膜形成以及菌丝态细胞的生长具有明显抑制作用(P<0.05),其作用与药物浓度呈正相关,其中0.211 mmol·L^(-1)和0.422 mmol·L^(-1)紫檀芪对C.albicans生物膜形成的抑制率超过90%。不同生长阶段C.albicans生物膜对紫檀芪的药物敏感性不完全一致,高浓度(0.211 mmol·L^(-1)和0.422 mmol·L^(-1))紫檀芪对各生长阶段C.albicans生物膜的抑制率大于90%,低浓度紫檀芪(0.026、0.053、0.106 mmol·L^(-1))对成熟期C.albicans生物膜的抑制作用较黏附阶段生物膜强。结论紫檀芪对C.albicans生物膜具有显著抑制作用。

基于rbcL条形码的鸡血藤真伪鉴别

为了建立鸡血藤基于rbcL基因的DNA条形码鉴别体系,为其资源保护和用药安全提供分子依据,采用商业试剂盒提取鸡血藤样品的基因组DNA,以及rbcL通用引物进行PCR扩增和测序;并从GenBank数据库获取鸡血藤混伪品的rbcL基因序列。采用DNAMAN、Clustal X软件进行序列比对分析,MEGA 5.1软件构建系统发生树。结果表明:获取的鸡血藤及其混伪品rbcL序列均为498 bp,GC含量分布在40.0%~44.4%间,存在64处变异,种间遗传距离远远大于种内遗传距离。基于rbcL基因的系统发生树能很好地区分鸡血藤及其混伪品。因此,rbcL基因可用作鸡血藤及其混伪品鉴别的DNA序列。

岗梅根和茎超临界CO_2萃取物中低极性挥发性成分比较及其对IEC-6细胞增殖活性的影响

目的:比较岗梅根和茎的超临界CO_2萃取物中的低极性挥发性化学成分及其体外对大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6增殖活性的影响,为充分利用岗梅野生资源和扩大其药用部位提供参考。方法:采用超临界CO_2萃取法提取岗梅根和茎中的低极性挥发性化学成分,通过气质联用法(GC-MS)分析其化学成分组成。以IEC-6细胞为对象,采用不同质量浓度的岗梅根或茎超临界CO_2萃取物(0、1、5、10、20、40、60、80、100μg/mL)处理细胞,以MTT法检测细胞相对活力,绘制细胞增殖曲线图并计算各萃取物的半数有效浓度(EC_(50))。结果:通过GC-MS分析技术从岗梅根和茎超临界CO2萃取物中分别鉴定出62、46个低极性挥发性化学成分,其中共有成分24个,主要为壬酸(根、茎中分别含14.18%、6.14%)、辛酸(根、茎中分别含10.59%、4.35%)、己酸(根、茎中分别含8.63%、10.86%)、丹皮酚(根、茎中分别含7.79%、6.00%)、2-甲基-3-苯基-丙醇(根、茎中分别含6.30%、0.58%)、乙酸(根、茎中分别含1.72%、33.77%)等。细胞体外试验结果显示,岗梅根和茎超临界CO_2萃取物质量浓度较低(≤60μg/mL)时,能显著促进IEC-6细胞增殖,EC_(50)分别为16.35、20.20μg/mL;而当质量浓度较高(≥80μg/mL)时,则表现出细胞毒活性,对IEC-6细胞增殖呈抑制作用。结论:岗梅根和茎中的低极性挥发性化学成分种类相似,其萃取物对IEC-6细胞的体外生物活性也相似;短链脂肪酸很可能是其促进细胞增殖的活性成分,而丹皮酚则可能是其细胞毒活性成分。