免疫磁珠体外提纯胚胎大鼠神经干细胞的实验研究

为建立免疫磁珠体外提纯胚胎神经干细胞 (NSC)的方法 ,制备胚胎SD大鼠的大脑皮质组织悬液 ,采用磁珠分选法选择Nestin阳性细胞群 ,台盼蓝染色观察活力 ,扫描电镜下行形态学观察 ,流式细胞仪检测荧光标记细胞的Nestin表达阳性率。结果发现 ,分选后所得细胞纯度达 (87 8± 2 4 ) % ,细胞活力 (94 8± 2 3) % ,流式细胞仪检测细胞Nestin阳性表达率为 (88 3± 1 0 4 ) % ,符合NSC的特点 ,扫描电镜观察可见细胞表面有数目不等的磁珠紧密结合。研究表明 ,磁性分选系统是一种有效的神经干细胞分离提纯方法 。

PI3k/Akt抑制剂对鼻咽癌细胞CNE-1放射敏感性影响的实验研究

目的体外实验研究PI3K/Akt抑制剂(LY294002)对鼻咽癌细胞CNE-1放射敏感性的影响。方法体外培养人鼻咽癌细胞CNE-1,本实验分为四组:对照组(A)、单纯放射组(B)、单纯药物组(C)、加药联合放射组(D),按细胞逐步稀释,采用的逐渐增加的放射剂量,分别为0、2、4、6、8、10Gy,PI3K/Akt抑制剂(LY294002)的试验浓度为20mol/L,利用细胞克隆形成实验观察各组CNE-1细胞存活情况,单击多靶数学模型以及L-Q模型拟合剂量存活曲线。结果①LY294002联合照射组Do、Dq、SF2明显比单纯放射组低。CNE-1细胞集落形成实验结果显示:鼻咽癌细胞受不同剂量照射后,B组和D与A组相比,细胞集落形成能力受抑制,放射剂量的增加,集落形成能力受抑制更明显;在相同的放射剂量时,D组细胞集落形成率明显低于B组;根据数据结果在电脑拟合的细胞存活曲线,其结果显示:D组Do值为0.522Gy,Dq值为2.54Gy;B组Do值为0.783Gy,Dq值为2.16Gy,SER为1.36;a/β值B组(1.78Gy)小于D组(9.65Gy)。结论 PI3k/Akt抑制剂(LY294002)联合照射可以提高鼻咽癌细胞CNE-1放射敏感性。

hBcl-2和hVEGF_(165)双基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的将hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测目的基因的表达及表达产物的生物学效应。方法贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞;重组腺病毒转染BMSCs,用PCR法验证目的基因mRNA在间充质干细胞中的表达;用ELISA及Western Blot检测双基因在转染后细胞的蛋白表达量;用MTT法及Annexin V-PE/7-AAD法分别观察对转染后BMSCs增殖及凋亡的影响。结果大鼠BMSCs分离纯化成功。在mRNA水平,转染后的BMSCs可表达这两个外源基因;转染后细胞培养上清液hVEGF165峰浓度达到(924.3±56.5)pg/mL,多个时间点与对照组相比,浓度差异有统计学意义(P<0.05);Western Blot也检测到转染后细胞Bcl-2蛋白表达量明显比对照组增加(P<0.05)。MTT比色法观察到,转染细胞分泌的hVEGF165上清液可促进BMSCs的增殖(P<0.05);用Annexin V-PE/7-AAD检测转染后间充质干细胞的凋亡率下降,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论转染重组腺病毒载体的BMSCs能够表达hBcl-2及hVEGF165,并且表达产物具有生物学效应。

液氮冷冻“祛障穴”治疗白内障的超微结构的实验研究

目的 电镜研究用液氮冷冻眼球穴位治疗白内障的超微结构 .方法 先用亚硒酸钠注射于SD大白鼠皮下深层内形成晶状体混浊的动物模型 ;再用液氮冷冻眼球“祛障穴”治疗 1疗程 ;分别观察正常组、治疗组和对照组晶状体中的超微结构 .结果 用液氮冷冻眼球的“祛障穴”治疗后的晶状体超微结构 ,与正常对照的透明晶状体基本相同 ,除残留少许混浊时的结构变化 ;部分皮质结构紊乱或模糊 ,无混浊晶状体的紊乱的颗粒结构 .结论 用液氮冷冻眼球“祛障穴”治疗白内障后 。

妊娠小鼠子宫对2,3,7,8-四氯苯二噁英毒性的敏感性研究

对妊娠早期小鼠用不同剂量的TCDD进行处理 ,妊娠第 9天采集血清、肝、肾、脑、脂肪、子宫和胎儿等样品 ,利用酵母报道基因系统进行组织中TCDD含量检测 ,结果发现脂肪中TCDD含量最高 ,其次是肝脏、子宫和胎儿 .由于TCDD的毒性需通过体内包括细胞色素P45 0 1A2在内的代谢酶的活化 ,采用免疫组化的方法对TCDD诱导的该酶的表达水平进行了检测 ,发现肝脏和子宫的阳性反应最强 ,并且所需剂量很低 ,肾脏和脂肪组织在较高剂量出现阳性反应 ,而脑组织则仅在更大剂量时出现微弱的阳性信号 .此现象说明子宫和肝脏一样 ,可以通过芳香烃类受体诱导细胞色素P45 0 1A2酶的产生 ,活化TCDD ,引起对细胞的毒性并产生对胚胎的毒性 .在低剂量时观察到的强烈的生殖毒性应该和TCDD在子宫的蓄积和子宫内敏感的细胞色素P45 0

广州地区临床分离非结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药结果分析

目的分析广州地区临床分离的非结核分枝杆菌(NTM)的菌种鉴定结果及耐药情况。方法用改良罗氏培养基培养法分离680例疑似结核病患者痰液,对确诊为NTM的38例,用传统生化反应进行菌种鉴定,采用以罗氏培养基为基础的绝对浓度法做NTM药物敏感试验。结果 38株NTM按Runyon分类法,检出感染菌种分布为Ⅰ群1株(2.6%),Ⅱ群7株(18.4%),Ⅲ群18株(47.4%),Ⅳ群12株(31.6%);单一耐药有13株(34.2%),且只耐异烟肼;同时耐2种药的比例为10.5%(4/38);同时耐3种药的比例为10.5%(4/38);同时耐4种药耐药率为44.7%(17/38)。大多数NTM对常用的抗结核药物呈高度耐药。结论广州地区NTM感染菌种以鸟-胞内分枝杆菌复合群分离率比例最高,为44.7%(17/38);耐药方式以单一耐异烟肼和同时耐4种药物为主;NTM对常用的抗结核药物呈高度耐药现象。

广州市秋季室内外空气细菌谱及其气溶胶分布特征

目的研究广州市普通住宅小区室内外微生物气溶胶细菌谱与粒径分布的特征。方法选择灰霾天气期间，采用分粒径采样对广州市普通住宅小区室内外细菌气溶胶进行连续的种类、粒径、数量检测。结果室内空气中共出现8属18种空气细菌，其中革兰阳性菌4属11种，革兰阴性菌4属7种，革兰阳性菌占79．5％，室外空气中共出现8属15种空气细菌，其中革兰阳性菌4属9种，革兰阴性菌4属6种，革兰阳性菌占82．4％。室内外优势细菌依次为藤黄微球菌（M．luteus）、表皮葡萄球菌（S．epidermidis）、芳香产碱杆菌（A．Odoratum）。室内外空气细菌气溶胶粒径分布基本一致，呈偏态分布，其中69．8％-72．9％的细菌气溶胶颗粒沉降在3—6级。室内外气溶胶中同种细菌粒径分布并非一致，说明细菌形成气．溶胶后粒径发生变化，可能与形成气溶胶的成分有关。结论室内空气细菌总数虽然低于国家标准，但其中约70％的细菌沉降于人体下呼吸道，空气质量不容乐观。

2,3,7,8-四氯苯二噁对小鼠胚胎毒作用的研究

目的 探讨动物妊娠早期接触2 ,3 ,7,8 四氯苯二(TCDD)后造成胚胎丢失的原因以及对小鼠成活率的影响。方法 90只妊娠NHI小鼠分9组,在妊娠的第1天,第2天和第3天分别观察胚胎转移率、检测血清雌二醇和孕酮含量;2 40只妊娠NIH小鼠分2 4组,于妊娠第9天和第18天测定子宫重量,观察胚胎成活情况。结果 与正常对照组胚胎数比较,TCDD未影响胚胎转移率,但造成着床前胚胎丢失(14±4 2 0 ,4 63±6 0 9,P <0 0 1) ;不同时期染毒均可降低胚胎和胎儿成活率(P <0 0 0 1) ;血清雌二醇含量升高(P <0 0 0 1)、孕酮水平下降(P <0 0 1)。结论 TCDD对胚胎和母体均具有毒性,血清类固醇激素的改变可影响子宫功能,造成第9天胚胎成活率下降;同时TCDD具有持续毒性的特点,使出生前第18天胚胎成活数低于第9天胚胎成活数。

广州市秋季室内外大气中细菌气溶胶粒径分布特征

目的探索广州市细菌气溶胶的分布情况。方法选择灰霾天气期间,采用分粒径采样对广州市普通住宅小区室内外细菌气溶胶进行连续检测,时间为2005年10月19～28日。结果不同楼层、一天中不同时间段,室内细菌气溶胶总数介于204～2530cfu.m-3(几何平均2.72±0.32cfu.m-3),室外细菌气溶胶总数介于95～1717cfu.m-3(几何平均2.53±0.31cfu.m-3)。室内外空气细菌气溶胶粒径分布基本一致,呈偏态分布,其中69.8%～72.9%的细菌气溶胶颗粒沉降在3～6级。结论室内空气细菌总数虽然低于国家标准,但其中约70%的细菌可沉降于人体下呼吸道,空气质量不容乐观。

香烟烟雾对人支气管上皮细胞氧化应激作用研究

目的观察香烟形成的可吸入并沉积在呼吸道的香烟烟雾是否对人支气管上皮细胞造成的氧化应激。方法用FA-1型多级撞击式空气采样器对形成的烟雾进行采样,收集到6种大小不同的香烟烟雾颗粒,将采得的不同大小的香烟烟雾颗粒分别对人支气管上皮细胞(16HBE)进行刺激。6h后用荧光探针检测16HBE细胞中的活性氧。结果与未加香烟烟雾颗粒刺激对照组比较,香烟烟雾颗粒明显造成人支气管上皮细胞中活性氧增加。不同大小香烟烟雾颗粒中,第四级(2.1～3.3μm)的香烟烟雾颗粒造成的氧化应激最明显。第六级(0.65～1.1μm)大小的颗粒能直接对人支气管上皮细胞造成损伤。结论可吸入并沉积在呼吸道中的香烟烟雾能造成呼吸道上皮细胞的氧化损伤。也能对呼吸道上皮细胞造成直接损伤。

腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位表达的机制研究

目的:研究腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)表达的机制。方法:构建稳定表达腺病毒E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞,将GCLC基因5’-上游调控序列不同长度的缺失体-萤火虫荧光素酶报道系统转染后分析转录活性的变化;检测AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因调控序列的结合活性。结果:GCLC基因5’-上游调控序列报道系统检测结果显示大部分(9/11)缺失体的转录活性抑制,AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因的结合活性增强,而对应的功能元件的转录活性降低。结论:腺病毒E1A蛋白通过抑制GCLC基因5’-上游调控序列的转录活性,扩大大鼠肺泡上皮细胞氧化应激时的氧化/抗氧化失衡,其机制可能涉及E1A对辅助转录因子的抑制。

热休克蛋白(HSP70-2)基因与氯氮平所致粒细胞减少症关联研究

目的:探讨中国人群中氯氮平所致粒细胞减少症与HSP70-2 mRNA表达及HSP70-2基因多态的关系。方法:将符合精神分裂症诊断标准的广州医学院附属精神病医院住院或门诊患者,根据单一使用氯氮平后外周血白细胞及中性粒细胞绝对计数分为氯氮平所致粒细胞减少症组(简称减少组)、服用氯氮平粒细胞正常组(简称正常组)及氯氮平所致粒细胞增多组(简称增多组)。三组精神分裂症研究组均于抽血做检测时同时抽血做氯氮平血药浓度检查,采用自行设计的调查表收集临床病史及人口学资料。采用聚合酶链反应-限制性长度片段多态性(PCR-RFLP)分析HSP70-2 G1267A多态,采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测三组患者的HSP70-2 mRNA表达。结果:减少组、正常组与增多组间氯氮平使用剂量、血药浓度无显著性差异(P>0.05);三组中性粒细胞的HSP70-2 mRNA表达水平有统计学显著性差异(P<0.01),粒细胞增多组患者中性粒细胞的HSP70-2 mRNA表达增强;HSP70-2基因1267位点各基因型及等位基因频率在三组人群的分布无显著性差异(P>0.05);HSP70-2 G1267A三种基因型的HSP70-2 mRNA表达水平无显著性差异(P>0.05)。结论:氯氮平所致的粒细胞减少症与氯氮平使用剂量及血药浓度关无;氯氮平所致的粒细胞增多患者中性粒细胞的HSP70-2 mRNA表达增强,可能由于HSP70蛋白独特的抗凋亡保护作用及其使用氯氮平后表达的增强,造成了使用氯氮平后出现的粒细胞增多现象;氯氮平所致的粒细胞减少症与HSP70-2mRNA表达无关;中国人群中的氯氮平所致的粒细胞减少症可能与HSP70-2 G1267A多态无关;HSP70-2 G1267A突变对中性粒细胞中HSP70-2 mRNA表达影响不大。

氧化应激对腺病毒E1A蛋白活化NF-κB转录活性的影响及其机制研究

目的:探讨腺病毒E1A蛋白对细胞内抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)水平的影响及氧化应激对腺病毒E1A蛋白介导的核因子-κB(NF-κB)转录活化的影响。方法:构建稳定表达E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞(E1A组)及对照质粒转染细胞(对照组),每组5×105个细胞,试验重复3次。采用H2O2刺激细胞,检测细胞内GSH水平。脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行刺激,丁胱亚磺酰亚胺(BSO)进行干预,Western blot法检测NF-κB和AP-1蛋白的表达。结果:E1A+细胞内GSH基础水平与E1A-比较无显著差异,但在H2O2作用后没有诱导出GSH含量的上升,表现为下降而低平的趋势,去除氧化剂后,仍低于正常水平。E1A-细胞在氧化剂的作用后呈明显的上升趋势,去除氧化剂后仍高于基础水平。细胞内NF-κB蛋白表达(积分吸光度值):刺激前E1A+细胞分别为79.3±4.6和80.3±3.8,在LPS和TNF-α刺激后分别为81.8±3.9～89.9±1.6和94.1±1.9～99.8±1.6,均明显高于对照组(刺激前分别为68.3±3.8和69.4±4.3,刺激后分别为70.1±2.8～80.8±3.6和73.4±4.9～83.2±6.7)。给予BSO预处理后再用LPS和TNF-α刺激,E1A-细胞NF-κB蛋白表达的积分吸光度值(1.22±0.16和1.75±0.13)与LPS或TNF-α单独作用组(1.25±0.18和1.69±0.19)无明显差别;E1A+细胞NF-κB蛋白表达的积分吸光度值(1.75±0.10和2.26±0.21)明显高于LPS或TNF-α单独作用组(1.35±0.12和1.80±0.14)。结论:腺病毒潜伏感染持续表达E1A蛋白可以影响细胞GSH,降低细胞对氧化应激的耐受性,并可能通过此机制造成NF-κB异常转录活化,而GSH的降低又进一步放大了E1A介导的NF-κB转录活化作用。

E-box元件对大鼠γ-GCS催化亚单位基因调控作用的组织特异性研究

目的:探讨大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位(GCLC)基因启动子(-745～-705)区段E-box元件对其转录调控是否存在组织细胞差异性。方法:分别将GCLC5’端上游序列驱动的荧光素酶报道基因载体GCLC-Luc、E-box缺失的delE-box-GCLC-Luc及pGL3-enhancer空载体瞬时转染大鼠不同组织来源的细胞,测得荧光素酶活性;并经蛋白定量及pSV-β-半乳糖苷酶的活性测定,获得校正荧光素酶活性值,通过比较校正荧光素酶活性值差异间接判断E-box元件对GCLC转录活性的影响。结果:在大鼠心肌细胞H9C2(2-1),转染delE-box-GCLC-Luc组荧光素酶活性值较转染GCLC-Luc组明显升高(P<0.001),说明E-box能使其GCLC转录活性下调;在大鼠肾小球细胞HBZY-1,转染delE-box-GCLC-Luc组荧光素酶活性值较GCLC-Luc组明显降低(P<0.02),提示E-box具有上调该细胞GCLC转录活性的作用;而在大鼠神经胶质瘤细胞C6和小肠隐窝上皮细胞IEC-6,组间差异无统计学意义(P>0.05),提示E-box对其GCLC转录活性无影响。结论:E-box元件能组织特异性的调控大鼠GCLC基因的转录,该元件可能是决定GCLC基因存在组织差异性表达的重要顺式作用元件。

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因调控的初步研究

目的研究抗氧化基因———大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的功能区及其调控表达。方法克隆1.76 kb大鼠γ-GCS基因的重链亚单位———GCLC基因的上游调控序列,并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc(GCLC/pGL-3)。利用嵌顿缺失方法构建GCLC基因的缺失体,并将其表达载体转染大鼠肺泡上皮细胞,在细胞中分析该基因的调控区域。通过该方法初步发现GCLC基因的上游调控序列的-745^-705 bp属负性调控区域。利用EMSA和supersh ift证实大鼠肺泡上皮细胞GCLC基因负调控区域的E-box元件能与转录因子USF1/USF2特异性的结合。将USF的真核表达载体和逆转录病毒表达载体分别导入肺泡上皮细胞,观察GCLC基因的转录活性和GCLC蛋白的表达情况。结果GCLC基因的-403^-111 bp和-705^-613 bp区段属正调控区域;-745^-705 bp属负调控区域。EMS和supersh ift证实上游刺激因子(USF)能与该负调控区域的E-box元件结合抑制GCLC基因的转录和表达。结论发现GCLC基因其中2个正调控区域(-403^-111 bp与-705^-613 bp)和1个负调控区域(-745^-705 bp),其中负调控区域-745^-705 bp上的E-box元件通过与USF结合介导GCLC基因的负性表达调控。

mtHSP70/HSV-tk重组沙门菌抗小鼠黑色素瘤的作用

目的研究携带结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)、人单纯疱疹病毒一胸苷激酶(HSV-TK)双基因的重组沙门菌瘤内注射抗小鼠黑色素瘤的抑瘤效应。方法构建重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK,建立小鼠黑色素瘤动物模型,瘤内注射重组沙门菌观察其抑瘤效应、荷瘤鼠的生存期并进行安全性评估。结果瘤内注射重组沙门菌,实验组抑瘤率显著高于对照组,延长荷瘤鼠生存期,重组菌治疗后荷瘤小鼠的生存状态良好,无腹泻,治疗期间体质量无明显改变。结论减毒沙门菌携带的mtHSP70/HSV-TK双基因真核共表达质粒瘤内注射对B16肿瘤细胞具有显著抑制作用。

腺病毒气溶胶的实时荧光定量PCR检测和绿色荧光蛋白活细胞检测

将带有绿色荧光蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,作为模拟病毒建立一种检测病毒侵袭力的方法.在钢化玻璃箱中通过TK-3型微生物气溶胶发生器将腺病毒形成气溶胶,用FA-1型多级撞击式空气微生物采样器进行气溶胶采样,对采样样品分别进行实时荧光定量PCR检测和表达了绿色荧光蛋白的PK15活细胞定时检测.实时荧光定量PCR检测可测定病毒在大气中存在的相对基因拷贝数,通过在荧光显微镜下计数带绿色荧光的PK15细胞数可直观检测病毒的感染力及活力.结果表明,重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器第五级,腺病毒气溶胶与病毒粒子相比较大.

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:表达F10蛋白,并制备兔抗F10多克隆抗体。方法:利用PCR方法扩增F10基因片段,经BamH I和EcoR I酶切后连接入pET-GST原核表达载体,构建的pET-GST/F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS-PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗F10的多克隆抗体,并以ELISA法检测抗体效价。结果:经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS-PAGE电泳分析显示pET-GST/F10诱导后表达一相对分子质量(Mr)约为61 000的融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90%以上,Western blot证实该蛋白是GST/F10的融合蛋白。将纯化的GST/F10融合蛋白免疫家兔,得到的兔抗F10抗体效价达1∶20 000。结论:成功构建了人F10基因原核表达载体,并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体,为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。

2,3,7,8,-四氯苯噁英对NIH小鼠早期妊娠和生殖激素的影响

用不同剂量的2,3,7,8 四氯苯二英(2,3,7,8 tetrachlorodibenzopdioxin,TCDD)对小鼠胚胎附植数量和生长发育情况进行剂量反应评估,分析TCDD对假孕小鼠子宫蜕膜生长状况的影响以及比较胚胎种植前后染毒效果.所有样本采集血液,测定母体血清雌二醇和孕酮的浓度变化.结果表明,50和100ng·(kg·d)-1TCDD处理的孕鼠,胚胎附植数量明显减少(P<0 05),着床后胚胎出现发育迟缓,质量减轻(P<0 05);同等剂量TCDD处理的假孕小鼠,子宫蜕膜生长受到了极显著的抑制(P<0 01);种植前后染毒效果比较发现种植前期染毒的小鼠胚胎对TCDD更为敏感.母体血清雌二醇浓度随剂量和染毒时段有不同程度的升高,而孕酮浓度则极显著下降(P<0 01).由此表明低剂量TCDD可能通过对生殖激素的干扰,强烈影响NIH小鼠妊娠早期生殖生理状态和着床后胚胎的发育.实验同时证明小鼠也可作为早期妊娠毒物研究的供试动物,用以筛选动物和人类早期妊娠的有害化合物.