广州地区输血传播登革病毒风险研究

目的评估登革热疫情爆发期间登革病毒(DENV)在广州地区输血传播的风险以及对血液安全的影响。方法采用随机抽样的方法抽取在广州地区参加献血的无偿献血者4 000名,检测其血清中DENV IgM抗体以及IgM结果阳性者进一步检测DENV RNA,并对他们的性别和年龄特征进行分析。结果检出DENV IgM抗体阳性标本131份,阳性率为3.28%。其中男82例,女49例,阳性率分别为3.11%、3.58%,不同性别间阳性率差异无统计学意义(2=0.63,P=0.43);18~20岁、21~30岁、31~40岁、41~50岁以及51~60岁年龄组抗DENV IgM抗体阳性率分别为2.68%、3.85%、3.27%、2.79%和3.38%,年龄组间差异无统计学意义(2=3.07,P=0.55)。131例DENV IgM阳性献血者中检出DENV RNA阳性2例,阳性率为0.05%,DENV-1型和DENV-2型各1例。结论在DENV流行期间,广州地区献血人群中通过输血传播DENV存在一定的风险,通过输血传播病原体的风险应当引起重视。

广州地区输血传播人类嗜T淋巴细胞病毒的风险研究

目的了解广州市无偿献血人群中人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)的血清学流行情况。方法采用双抗原酶免吸附法(ELISA)对献血员样本进行HTLV-Ⅰ/Ⅱ抗体初筛,ELISA呈反应性的样本再采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)及核酸检测对献血者样本进行确证实验。结果检测20 056份样本中ELISA初筛反应性样本21份,经Western Blot和RNA实验确证后发现3例阳性,确证阳性率约为0.02%(3/20 056),均为HTLV-Ⅰ型病毒感染。结论广州属于HTLV低流行地区,为保血液质量安全,可考虑在广州开展HTLV-Ⅰ/Ⅱ抗体筛查的同时采取血液滤白处理。

广州地区无偿献血者人群中Jk(a-b-)表型筛选及分子遗传学研究

目的了解广州地区无偿献血者人群中,Kidd血型系统中Jk(a-b-)稀有血型个体的分布频率及分子遗传背景。方法用2 mol/L尿素溶解法,对50 000名广州血液中心无偿献血者中的Jk(a-b-)血型个体进行筛选。用传统的血型血清学方法对筛选到的Jk(a-b-)表型进行确证。随后从静脉血中提取DNA,PCR方法扩增Kidd血型系统编码基因Jk的所有编码外显子,并直接进行测序分析。结果在50 000名无偿献血者中共筛选到10名Jk(a-b-)血型个体,在广州地区无偿献血者人群中其分布频率约为0.02%。在对其中8名先证者基因分型中,共发现了2种基因型,纯合IVS5-1G>A(n=6),杂合IVS5-1G>A/杂合896G>A(299Gly>Glu)(n=2)。结论广州地区无偿献血者人群中,Jk(a-b-)的分布频率高于已报道的北方人群。高频率分布于太平洋波利尼西亚群岛的变异IVS5-1G>A,也是本人群中最常见的基因变异。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型。方法采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析。结果在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型。其中,127名为RHD基因缺失(占63.5%);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4)-D)及弱D15型(RHD845A)等位基因。在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G>T,385Gly>Val)。结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测。也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源。

广州献血人群HLA多态性与慢性HCV感染的关联研究

目的了解广州人群的HLA基因多态性与慢性HCV感染的相关性,获得中国南方人群遗传背景下HCV感染相关的宿主免疫因素。方法本研究从广州无偿献血人群中随机抽取426例慢性HCV感染者和709名健康对照献血者为研究对象,采用PCR-SBT高分辨分型技术对HLA-Ⅰ类(A和B)和Ⅱ类(DRB1)基因进行分型,分析比较2组研究对象间的HLA等位基因频率分布差异,获得HLA等位基因多态性与慢性HCV感染的关联性。结果 HLA高分辨水平分析和FDR(False Discovery Rate)多重检验校正的结果显示,4条HLA-B等位基因的分布差异具有统计学意义:B*13∶02(P=0.009,OR=1.515)和B*15∶01(P=0.010,OR=1.561)在慢性HCV感染组的频率高于健康对照组,可能与慢性HCV感染相关;而B*07∶05(P=0.001,OR=0.299)和B*15∶02(P=0.016,OR=0.778)则在健康对照组中频率更高,提示对HCV感染具有保护性。结论 4条HLA-B等位基因均是首次发现与HCV慢性感染相关,反映出以中国南方人群为遗传背景的宿主HLA基因在HCV感染中的独特作用。本研究的结果为HCV的防治以及疫苗的研发提供了科学依据。

广州地区无偿献血者的CD36缺失频率及其分子基础研究

目的了解正常无偿献血人群中CD36缺失频率及其分子基础。方法选取2015年5月—2016年12月选取广州地区1000名18—55周岁,符合国家献血者健康标准的无偿捐献血小板的健康献血者,采集其外周血3—5mL/人(份),从中分离出血小板和单核细胞,用以做CD36表达水平的流式检测,筛选出CD36缺失者并计算缺失率。提取单核细胞基因组DNA,应用聚合酶链反应-测序分型方法(PCR-SBT)扩增CD36基因的12个编码区序列片段并测序,所得序列与GenBank数据库获取的CD36核酸序列(ACCESSION:NG_008192)做比对分析,确认有无新的基因突变。结果本组广州地区无偿献血者的CD36缺失率为2.1%(21/1000),其中CD缺失Ⅰ型占23.81%(5/21)、Ⅱ型占76.19%(16/21)。将全部缺失型做测序分析后发现1个新的基因变异型:194-201delTTTGGATC;克隆测序确认该个体(标本)CD36cDNA从第194位发生TTTGGATC碱基串的缺失;生物信息学分析:该突变型可能导致CD36阅读框发生框移,产生终止密码子,导致编码蛋白提前结束。结论广州无偿献血人群中存在一定的CD36缺失频率。发现的1例CD36新突变(GenBank:KY972554),其可以促使成熟蛋白氨基酸序列提前结束,可能是引起血小板CD36缺失的原因。

广州地区人类白细胞抗原-Ⅰ类与丙型肝炎病毒-6a型感染相关性的研究

目的：广州地区HLA-Ⅰ类抗原和HCV-6a感染相关性的研究。方法：选取20022008年HCV抗体检测双试剂阳性无偿献血者250名,随机抽取621名广州地区无血缘关系的健康无偿献血者作为对照,用逆转录-套式聚合酶链反应扩增HCVE1和NS5B基因,对E1和NS5B区扩增阳性的PCR产物核苷酸序列测定,将所测定的HCVE1、NS5B进行基因分型。LU-MINEX-SSO方法检测HLA-A,B检测样本HLA-A,B位点。根据公式对HLA型别相关性的相对危险性进行评估。结果：250名无偿献血者中有69个样本的HCVE1和NS5B区分型结果为HCV-6a,占到分析总数的27.6%。A＊33、A＊30与HCV-6a感染相关评估的RR值均大于4,B＊56、B＊54、B＊55、B＊58、B＊76与HCV-6a感染相关评估的RR值均大于4,与HCV-6a感染具有强关联性。结论：广州地区HCV-6a的感染与A＊19和B＊22存在强关联性,对HCV-6a的地域性流行、治疗和预后评价有一定预见作用。

1例B_X血型个体的家族遗传分析及临床输血探讨

目的对1例BX血型个体及其家系成员血型进行分析,以阐明其血型遗传特征、保证临床输血安全。方法采用微柱凝胶法和试管法检测先证者及其家系成员的ABO血型、吸收放散试验确认亚型抗原物质、中和抑制实验检测唾液血型物质;扩增ABO基因6、7外显子并对扩增产物进行直接测序,并对测序结果进行比对。结果先证者及其儿子为BX型;先证者父亲和弟弟为B型;先证者母亲及其配偶为O型;测序结果显示先证者及儿子、父亲的ABO等位基因第7外显子在B101基础上发生695T>C突变,比对人类血型抗原基因突变数据库,该等位基因为Bw11。结论鉴定了1例BX型患者及其家系成员的血型和等位基因型,血清学方法结合分子生物学方法对于准确鉴定ABO血型和降低亚型患者输血风险有重要意义。

自制Coombs微柱凝胶卡的临床应用研究

目的探讨自制Sephadex-G50Coombs微柱凝胶卡应用于稀有血型抗体筛选和新生儿溶血病检测的可行性。方法以Sephadex-G50凝胶为载体,制备Sephadex-G50Coombs微柱凝胶卡。取无偿献血者血清与稀有血型(Mur)抗原阳性红细胞加入凝胶卡反应腔,37℃孵育后15min离心,观察结果。再取阳性反应者血清,用2-Me灭活IgM型抗体后,重复前述步骤,以确定是否含IgG型抗-Mur。取新生儿血液标本,进行直抗实验、游离抗体实验和放散液抗体检测实验。结果 2 600名无偿献血者中,检出1例IgM型抗-Mur。246例新生儿溶血病标本中,检出ABO溶血病210例,RhD溶血病5例,RhE溶血病2例,抗-M和抗-Jka引发的溶血病各1例。自制凝胶卡与进口凝胶卡检测结果一致。结论自制Sephadex-G50Coombs微柱凝胶卡与进口凝胶卡检测结果差异无统计学意义,且具有成本低、工艺简单的特点,可用于血型血清学临床实验。

广州地区HLA-DR基因多态性与汉族HCV-6a感染相关性的研究

目的探讨广州地区HLA-DR抗原和HCV-6a感染相关性。方法选取2002～2008年抗-HCV检测双试剂阳性无偿献血者250名,随机抽取135名广州地区无血缘关系的健康无偿献血者作为对照,用逆转录-套式聚合酶链反应扩增HCV E1和NS 5B基因,并进行测序。根据所测定的序列,与GENE BANK标准序列进行比对,作病毒基因的分型。利用LUMINEX-SSO方法检测HLA-DR位点。根据公式对HLA型别相关性的相对危险性进行评估。结果 250名无偿献血者中有69个样本的HCV E1和NS 5B区分型结果为HCV-6a,占到分析总数的27.6%。DR*14与HCV-6a感染相关评估的RR值均>4,与HCV-6a感染具有强关联性;DR*13,DR*12,DR*07和DR*16与HCV-6a感染相关评估的RR值均<1,表示此HLA-DR抗原位点对HCV-6a感染有抵抗性。结论广州地区HCV-6a的感染与DR*14存在强关联性,对HCV-6a的治疗、预后评价以及免疫逃逸有一定预见作用。

受血者红细胞血型不规则抗体筛选在临床输血中的价值评价

目的探讨受血者红细胞血型不规则抗体筛选在临床输血中的实用价值。方法随机选取2014年1月至2015年12月期间进行手术备血或治疗性输血的1 200例患者,采用微柱凝胶法筛查其不规则抗体,并对阳性标本进行特异性鉴定,以确保临床中输血安全。结果在所有不规则抗体中,男性患者的阳性率为5.20%(37例),女性患者的阳性率为8.20%(40例),差异有统计学意义(P<0.05);怀孕患者的阳性率为19.72%(85例),非怀孕患者的阳性率为8.77%(5例),差异有统计学意义(P<0.05)。结论术前受血者红细胞血型不规则抗体筛选对临床输血安全具有重要的意义,能够有效减少输血不良反应。

广州地区无偿献血者稀有血型Lu(a-b-)表型筛查及分子遗传背景研究

目的了解广州地区无偿献血者中Lu(a-b-)表型的频率;通过检测Lutheran血型系统编码LU基因和In(Lu)表型相关红细胞转录因子编码KLF1基因,了解Lu(a-b-)表型的分子遗传背景。方法运用血型血清学方法对5 000名广州地区无偿献血者的Lub抗原进行筛查,对筛选到的Lub阴性个体,用抗球微柱凝胶卡进行Lu(ab-)表型确认,扩增Lu(a-b-)表型先证者LU基因15个外显子和KLF1基因3个外显子并进行测序,通过基因序列比对分析测序结果。结果在广州地区5 000名无偿献血者中筛选到2名Lu(a-b-)表型先证者。测序结果显示,2名先证者LU编码基因编码区及邻近内含子区域未发现任何杂合或纯合突变,进一步分析KLF1基因,发现先证者1携带KLF1基因外显子2的c.895C>G(p.His299Asp)杂合突变,先证者2携带KLF1基因外显子2的c.519_526dup CGGCGCC(p.Gly176Argfs*179)杂合突变。结论 Lu(a-b-)表型在广州地区献血者中的频率约为0.04%(2/5 000)。2例均为In(Lu)表型,其表型形成机制与KLF1基因突变相关。

罕见抗-Di^(b)致严重胎儿新生儿溶血病的实验室检测与相关研究

目的对1例高频抗体导致的胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN)进行检测、鉴定及配血。方法对患儿进行新生儿溶血试验,对母亲进行血清学意外抗体鉴定,并对母亲红细胞进行常见高频抗原鉴定;对检出抗体进行IgG分型检测,并用流式细胞术进行单核细胞体外吞噬致敏红细胞试验,以检测抗体相关的吞噬率;对患儿母亲、父亲及舅舅进行相关红细胞血型基因测序;利用稀释的母亲血浆和抗人球卡法,在献血者中进行大规模相合血液的筛选。结果产妇鉴定为Di(b-)稀有血型,产生了抗-Di b(效价512)并导致了严重的HDFN;抗-Di b亚型分型为IgG1和IgG2型,单核细胞体外吞噬效率为88.83%(74.7/84.09);产妇亲属中没有相合献血者,后续从5520名献血者中筛选到2例Di(b-)相合血液,患儿接收输血治疗后康复出院。后续在51334名献血者中筛查到17名Di(b-)献血者,该数据表明Di(b-)在广州地区献血者中的分布频率约为三千分之一(0.033%,17/51334)。结论综合利用血型血清学及分子生物学方法诊断了抗-Di b所致的严重HDFN,建立了1种有效大规模筛查Di(b-)稀有血型的方法并找到相合血液,为建立Di(b-)稀有血型库奠定了基础。

广州地区无偿献血者抗-Mur筛查及Mur抗原基因型检测

目的了解广州地区无偿献血者中抗-Mur及Mur抗原基因型的频率,为指导临床输血及产前抗体监测提供依据。方法用微柱凝胶卡方法筛查2725名献血者血清中37℃有活性的抗-Mur;采用多重连接依赖的探针扩增技术(MLPA)对91名献血者的Mur抗原基因型进行检测,然后用人源抗-Mur血清检测Mur抗原基因型阳性样本的红细胞表型。结果无偿献血者血清中抗-Mur频率为0.04%(1/2725),Mur抗原基因型阳性频率为6.59%(6/91),经血型血清学方法验证基因型与表型符合率为100%(6/6)。结论广州地区无偿献血者中抗-Mur频率较低,而Mur抗原阳性则相对较常见;通过MLPA方法检测Mur抗原基因型可以准确推断其表型,解决了因缺乏商品化抗-Mur试剂导致Mur抗原鉴定难以开展的难题。

广州地区无偿献血者HPA-1—6,15基因分型及频率调查

目的研究人类血小板基因多态性,为人类群体遗传学研究及临床输血实践提供重要数据和依据。方法通过PCR-SSP方法对广州地区706名无偿献血者的HPA1—6,15系统进行基因分型,并统计其频率。结果706份样本中HPA-3和-15基因型的杂合程度最高,其a/a、a/b、b/b的频率分别为HPA-3:0.2918、0.4830、0.2252;HPA-15:0.2691、0.5170、0.2139,不配合率较高,均达到35%以上。HPA-1、-2、-4、-5系统均以a/a纯合子为主,a基因的频率范围为0.9583—0.9993,且均未发现b/b纯合子。1b、4b的基因频率很低,分别为0.0028和0.0007。本地区的HPA-1a与中国北方、英国白人、美国黑人有统计学差异(P<0.05)。HPA-2与中国南方、北方、美国黑人和日本人有统计学差异(P<0.05);HPA-5与英国白人和美国黑人存在统计学差异(P<0.05)。HPA-6频率分别为0.9575,0.0397,0.0028。结论本研究对广州地区HPA献血员的筛查可为建立HPA供者库和对探讨由HPA引起的免疫性疾病的预防和治疗提供相关数据和研究手段。

RhD变异型个体的表型类型和基因突变机制研究

目的:探讨RhD变异型个体的表型类型和基因突变机制。方法:收集2013年1月至2015年10月间经我中心用血清学方法确证的48例RhD变异型孕妇和献血者的血液标本,应用常规血清学方法进行Rh抗原分型后,提取血样DNA,用多重连接依赖探针扩增(multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)对入选的48例受检者的RHD进行检测,分析RHD的杂合性和外显子突变情况,并将MLPA检测结果与常规血清学结果进行对比。对比结果不一致的标本进行RHD外显子全长测序,并对其中新发现的等位基因进行克隆测序。结果:48例标本中,CcDee 20例(41.7%)、ccDEe 12例(25%)、CCDee 11例(22.9%)、CcDEe 5例(10.4%)。MLPA检出RHD单条等位基因突变(即杂合性为Dvd型)的38例,其中包含点突变18例、RHD/CE杂交替换20例;涉及两条等位基因突变(即杂合性为DvDv型)的10例,其中包含点突变合并RHD/CE杂交替换9例、碱基缺失合并RHD/CE杂交替换1例。MLPA能够明确其RhD变异型别的有41例(85.4%,41/48),包括弱D15型(845A)等位基因14例、RhDⅥtype 3等位基因22例;7例通过测序分析得以明确。发现2例新的等位基因,分别为79-81del CTC、689G>A。结论:CcDee是RhD变异型人群的主要表型,弱D15和RhDⅥtype 3是受检人群的主要RhD变异型,点突变和RHD/CE的杂交替换是主要的分子机制,79-81del CTC和689G>A为本研究发现的2个新等位基因。

广州地区汉族人群Diego血型系统多态性调查

目的了解广州地区汉族人群中Diego血型系统DI1(Dia)和DI2(Dib)、DI3(Wra)和DI4(Wrb)两对抗原的基因频率分布,为指导临床输血提供依据。方法随机收集广州地区献血者200名,从静脉血提取基因组DNA。采用红细胞血型系统多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术对DI1和DI2、DI3和DI4两对抗原进行基因分型。采用测序法对MLPA基因分型结果做进一步确认。结果广州地区汉族人群中DI1、DI2、DI3和DI4抗原的基因频率分别为0.040 0、0.960 0、0.000 0和1.000 0。MLPA基因分型结果与测序法分型结果完全一致。DI1和DI2、DI3和DI4抗原在广州地区汉族人群随机输血中抗原不配合率分别为3.84%和0.00%。结论 DI1和DI2抗原在广州地区汉族人群随机输血中不配合率较高,具有一定临床意义。通过MLPA方法可以对DI1和DI2抗原进行基因分型从而推测其表型,解决了因抗体来源困难导致抗原鉴定难以开展的难题。

血小板特异性糖蛋白抗体在血小板输注无效患者中分布的研究

目的探讨血小板输注无效(PTR)患者的血小板特异性糖蛋白抗体的表达及PTR与血小板特异性抗原的相关性。方法采用ELISA方法检测27名临床上确诊为PTR患者的血小板特异性糖蛋白抗体,应用PCR-SSP的方法检测其HPA-1～17基因分型。结果 27名PTR患者的HPA基因频率为HPA-1a(0.900),1b(0.100);HPA-2a(0.926),2b(0.074);HPA-3a(0.648),3b(0.352);HPA-4a(0.981),4b(0.019);HPA-5a(0.940),5b(0.060);HPA-6a(0.815),6b(0.185);HPA-7a～14a、16a、17a(1.000),7～14、16、17b(0.000);HPA-15a(0.463),15b(0.537);PTR患者的HPA抗原分布与健康献血者的基因频率无统计学差异(P>0.05)。血小板抗体阳性的27名PTR患者中,血小板特异性糖蛋白GPⅡb/Ⅲa抗体阳性表达者占78%(21/27)、GPⅠa/Ⅱa抗体阳性占70%(19/27)。对3名PTR患者作血小板特异性抗原分析发现:患者产生的血小板特异性糖蛋白抗体与HPA基因型密切相关,以抗-HPA-3b、-5b为常见。结论多次输注血小板无效的患者,应选择与其HPA基因型一致的血小板供者,以提高血小板输注疗效,避免血液资源的浪费。

32名RhD变异型献血者分子遗传背景研究

目的对广州地区收集的32例RhD变异型献血者进行基因分型,以了解RhD变异型在广州献血者中的分布情况。方法采用传统血清学方法,对2016年6月—2017年1月的RhD变异型献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的32例RhD变异型标本进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,使用Sanger测序法对RHD基因进行测序分析。使用D-Screen试剂盒对RhD变异型标本的RhD抗原表位行进一步检测。结果在32例RhD变异型标本中:检出RHD~*DVI.3/01N.01 8例、RHD~*DVI.3/DVI.3 1例、RHD~*weak partial 15/01N.01 7例、RHD~*960A/01N.01 3例、RHD~*weak D type 25/01N.01 3例、RHD~*weak D type 72/01N.01 2例、RHD~*D-CE(4)-D-CE(10)/01N.01 1例、RHD~*95A/01N.01 1例、RHD~*710T/01N.01 1例、RHD~*DVI.3/01EL.01 1例、RHD~*weak partial 15/01EL.01 1例、RHD~*weak D type 25/01EL.01 1例、RHD~*DVI.3/D-CE(3-9)-D 1例和RHD~*538A/D-CE(2-9)-D 1例。结论弱部分D15和部分DVI.3是广州地区献血者人群中最常见的RhD变异型。MLPA基因分型方法是1种有助于检出这2种不同RHD突变型等位基因的方法。