药用植物分子生物学研究中的分子标记

目的了解分子标记在药用植物研究中的应用及进展。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果分子标记在药用植物的鉴定、亲缘关系、起源进化、遗传多样性、基因定位及克隆、代谢途径的基因工程研究等方面有广泛的应用空间。结论合理运用分子标记技术将加快药用植物研究的步伐。

人肝癌BEL7404/ADM耐药株的建立及生物学特性的评价

建立人肝癌BEL7404/ADM耐药株,并检测该耐药株的生物学特性。通过盐酸阿霉素(adria-mycin,ADM)长期筛选人肝癌细胞株BEL7404,建立阿霉素耐药株BEL7404/ADM。应用MTT法对该细胞株药物敏感性和倍增时间进行检测,用流式细胞仪对其细胞周期和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)功能进行研究。用浓度梯度递增法对BEL7404细胞连续作用10个月,得到人肝癌BEL7404/ADM耐药株。经检测该耐药株IC50是BEL7404细胞株的68.7倍,倍增时间延长了6.49 h,两者细胞周期无明显差异性,P-gp活性高于BEL7404细胞株。成功建立了人肝癌BEL7404/ADM耐药株,该耐药株的生物学特性明显不同于BEL7404细胞株;耐药性与P-gp的高表达有关。

8份广西产绞股蓝种质的RAPD引物筛选及其遗传多样性分析

本研究的目的在于筛选合适的RAPD随机引物,应用RAPD技术对药用植物绞股蓝进行遗传多样性分析,并构建DNA指纹图谱。研究结果表明,我们利用生物信息学方法挑选出的20条引物中有19条引物的扩增条带清晰且多态性好;在清晰稳定出现的354条带中,294条具有多态性;其中有3条引物的扩增条带可清楚区分绞股蓝与混淆品种乌蔹莓,可建立其DNA指纹图谱。按UPGMA法进行聚类分析,计算其遗传相似系数,结果显示,8份绞股蓝供试材料聚为两类,聚类结果与其地理区域远近和生长环境一致。本研究中筛选出的19条引物适用于绞股蓝遗传多样性分析,且获得的DNA指纹图谱可用于鉴别绞股蓝。

广西扶绥县壮族人群ESR1基因SNP与肝癌家系遗传易感性的关系

目的：探讨广西壮族自治区扶绥县肝癌高发地区壮族人群雌激素受体1基因（estrogen receptor1 gene,ESR1）单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）与肝癌遗传易感性的关系。方法：采用病例-对照研究和限制性片段长度聚合酶链反应（PCR-RFLP）方法,对扶绥县21个肝癌高发家系组共85例及同居住地10个正常对照家系组共39例进行ESR1基因型分布频率的检测;运用非条件Logistic回归分析基因多态性与肝癌发生危险性的关系,并将实验结果结合临床资料进行统计学分析。结果：（1）经ESR1基因型检测分型,正常对照家系组人群携带AA、AG、GG基因型频率分别为74.36%、17.95%和7.69%;肝癌高发家系组人群携带AA、AG、GG基因型频率分别为83.53%、11.76%和4.71%;（2）基因型在两组人群中的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律;（3）正常对照家系组人群中AG、GG基因型个体罹患肝癌的风险率分别是AA基因型个体的0.218（95%CI=0.025～1.917,P=0.170）和0.509（95%CI=0.049～5.260,P=0.571）,肝癌高发家系组人群中非肝癌者AG、GG基因型的个体罹患肝癌的风险率分别是AA基因型个体的0.298（95%CI=0.035～2.515,P=0.233）和0.671（95%CI=0.070～6.391,P=0.729）,差异均无统计学意义。结论：广西扶绥县壮族人群中,ESR1基因rs3798757位点SNP多态性与罹患肝癌无关。

广西不同地域五、七叶绞股蓝中三萜皂苷含量差异研究

目的:探讨影响绞股蓝药用有效成分三萜皂苷含量的因素,为绞股蓝种植、制药提供科学建议。方法:采用超声波提取和分光光度法,分析比较不同品种、不同组织、不同产地绞股蓝间总三萜皂苷含量的差异。结果:七叶绞股蓝叶片三萜皂苷含量(6.78%)显著高于五叶绞股蓝(3.69%),绞股蓝叶片中三萜皂苷的平均含量(4.72%)显著高于茎的平均含量(1.85%),广西南部产五叶绞股蓝叶片三萜皂苷含量(4.1%)高于广西北部产五叶绞股蓝(3.6%)。结论:为获得含量更高的三萜皂苷,实现最大经济效益,建议药农种植七叶绞股蓝,药材收购时宜叶茎分开。

肝癌相关抗原SMP30重组基因的构建、表达及分子伴侣共表达系统的探索

旨在通过应用基因工程的方法构建、表达和纯化肝癌相关抗原SMP30,研究共表达分子伴侣提高基因工程蛋白表达的可溶性及效率。PCR扩增SMP30 cDNA序列,用基因工程技术构建重组表达质粒,转化E.coliBL21(DE3)pLysS宿主菌。表达蛋白经Ni-NTA亲和柱纯化获得HIS-SMP30融合蛋白;分别将4种表达不同分子伴侣的质粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pTf16)转入E.coliBL21(DE3)中;然后再将重组质粒转入含有分子伴侣质粒的细胞中,进行分子伴侣与重组质粒的共表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量与可溶性分析。经优化表达条件后,目的蛋白以包涵体形式表达,目的蛋白占总蛋白的60%以上;纯化后纯度高达95%以上;诱导共表达后,目的蛋白在上清含量极少,不到总表达目的蛋白的10%。成功构建出高效表达的SMP30重组质粒;加入到诱导表达体系中的4种分子伴侣质粒不能有效的促进可溶性蛋白的表达,pTf16共表达系统能增加目的蛋白表达量。

甜瓜鲨烯合酶基因克隆及酶分子结构分析

葫芦素类是主要分布于葫芦科植物中具有多种医药活性的四环三萜类化合物,目前药用葫芦素原料主要从甜瓜蒂中提取。该研究从甜瓜中克隆葫芦素类合成关键酶——鲨烯合酶(SQS)的基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明:DNA测序和BLASTRefSeqGene分析表明,克隆的甜瓜SQS基因片段具有完整的该酶基因开放阅读框架(ORF)序列。ORF分析显示,甜瓜SQS由417氨基酸残基构成,等电点为7.56。对推衍的甜瓜SQS氨基酸序列分析结果提示,该酶二级结构以α螺旋为主。结构域预测结果表明,SQS属于异戊二烯合酶家族,具有法呢酰基二磷酸及镁离子的结合位点。三级结构预测提示,甜瓜SQS为单体酶,其活性中心主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构。磷酸化位点分析显示,S^(48)处于酶活性中心相关^(47)VSRSF^(52)的模体中,而S^(196)是正选择位点,提示这两处磷酸化位点可能是甜瓜SQS酶活性调节的关键部位。以甜瓜SQS基因ORF序列构建系统发生树的系统发生分类结果与形态学分类结果一致。该研究结果为葫芦素类的生物合成调控研究提供了新的线索和实验依据。

广西壮族人群载脂蛋白B基因限制性片段长度多态性分析

目的 :探索广西地区壮、汉两族人群ApoB基因多态性的分布特点及其与冠心病、脑梗塞发病之间的关系。方法 :应用聚合酶链反应 (PCR)对广西壮族 17名冠心病患者 (CHD)、14名动脉粥样硬化性脑梗塞患者 (ACI)和 62名健康人的ApoB基因的XbaI、EcoRI位点的限制性片段长度多态性 (RFLP)进行了研究。结果 :无论是广西壮族人群冠心病组、脑梗塞组与正常对照组在XbaI位点以X- X- 为主要基因型 ,少见X+ X+ 、X+ X- 基因型 ;在EcoRI位点以E+ E+ 为主要基因型 ,少见E+ E- 、E- E- 基因型。X+ 等位基因在壮族三组人群中的频率分别为 :0 117、0 0 714、0 0 4 92 ,两两之间没有显著性差异 (P >0 0 5 ) ;E-在广西壮族三组人群中的频率为 :0 0 3 85、0 10 7、0 0 4 84 ,两两之间的差异未达统计学意义 (P >0 0 5 )。结论 :广西壮族人群冠心病、脑梗塞的发病与XbaI。

广西地区壮、汉族人群载脂蛋白B基因多态性及其与冠心病的关系

目的 :探讨载脂蛋白 B(Apo B)基因的多态性在广西地区壮、汉两族人群中的分布特点及其与冠心病发生的关系。方法 :应用聚合酶链反应 (PCR)对 1 1 1例健康人 (正常组、对照组 ,壮族 6 2例、汉族 4 9例 )和 5 9例冠心病 (CHD)患者 (冠心病组 ,壮族 1 7例 ,汉族 4 2例 )的 apo B基因的 Xba I、Eco RI位点限制性片段长度多态性 (RFL P)以及 3′端可变数串联重复序列 (3′VNTR)多态性进行研究。结果 :1两族正常组与对照组在 Xba I的等位基因分布没有区别 ;2 3′ VNTR等位基因的分布各有特点。广西壮族人群以 HVE30、HVE32为主 ,广西汉族人群以 HVE34、HVE36和 HVE38为主 ,而 CHD组两个民族均以HVE32、HVE34为主 ;3Eco RI位点等位基因和 3′ VNTR大于或等于 38的大等位基因的分布频率在广西汉族两组人群之间的差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。结论 :广西汉族人群冠心病的发病与 Apo B基因的 3′ VNTR及 Eco

佛手瓜鲨烯合酶基因克隆及酶分子结构分析

[目的]克隆佛手瓜鲨烯合酶(SQS)基因,并基于克隆的SQS序列分析该酶的分子结构,为佛手瓜生物活性成分的利用提供理论依据。[方法]根据SQS基因5'末端保守序列和3'race方法扩增的佛手瓜SQS基因3'末端序列设计佛手瓜SQS基因克隆引物。扩增的佛手瓜SQS基因片段插入p GEM-T Easy Vector后经DNA测序。应用生物信息学方法分析克隆序列的开放阅读框架(ORF)、酶蛋白的疏水性/亲水性和蛋白质磷酸化位点,预测酶蛋白的二级结构、结构域、三级结构和跨膜区。以布朗葡萄藻为outgroup,应用MEGA 5.0进行UPGMA算法构建系统树,并进行1 000次的Bootstrap测试。[结果]佛手瓜SQS由417氨基酸残基构成,等电点为6.983。构象预测提示该酶二级结构以α螺旋为主,是一种只有三级结构的单体酶,其活性中心是主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构,酶蛋白肽链中具有1个跨膜区。结构域分析表明SQS属于异戊二烯合酶家族。磷酸化位点分析显示该酶共有17个磷酸化位点,其中,S48位于与酶活性中心相关模体中,而S196为陆生植物SQS基因的正选择位点。以佛手瓜SQS基因ORF序列构建系统发生树得到的系统发生分类结果与形态学分类结果一致。[结论]佛手瓜SQS是由417氨基酸残基构成的单体酶,具有1个跨膜区和17个磷酸化位点,其中,S48和S196可能是佛手瓜SQS酶活性调节的关键性磷酸化位点。

广西地区壮、汉两族人群载脂蛋白B基因3′VNTR与冠心病、脑梗死关系研究

目的 探索广西地区壮、汉两族人群 Apo B基因 3端可变数串联重复序列 (3′ VNTR)的分布及其与冠心病、脑梗塞发病之间的关系。方法 应用聚合酶链反应 (PCR)对广西地区 5 9名 (壮族 17名、汉族 4 2名 )冠心病患者 (CHD)、 4 5名 (壮族 14名、汉族 31名 )动脉粥样硬化性脑梗塞患者 (ACI)和 111名 (壮族 6 2名、汉族 4 9名 )健康人的 apo B基因的 3′ VNTR进行了研究。结果 在所有受检的 2 15人中共分离出 3′ VNTR等位基因 16个 ,广西壮族人群冠心病组、脑梗塞组以 HVE34的频率为最高(32 .14 %、4 1.6 7% ) ,正常人群以 HVE30的频率 (2 5 .3% )为最高 ,大等位基因 (≥ 38)的分布频率在三组人群之间没有显著性差异 (P >0 .0 5 )。广西汉族冠心病组及脑梗塞组以 HVE32的频率最高 (4 0 .6 3%、 5 1.5 2 % ) ,正常组以 HVE34、HVE36、HVE38为主 ,正常人带大于 38的等位基因分布频率高于发病组 (P<0 .0 5 )。结论 广西地区汉族人群 Apo B基因 3′ VNTR的分布与冠心病、脑梗塞的发病有关联。

广西壮汉人群肥胖基因第一外显子的多态性分析

目的 :探讨广西肥胖症、非胰岛素依赖性糖尿病 (NIDDM)是否与肥胖基因突变有关 ,同时观察广西壮族汉族人群的肥胖基因 (ob基因 )多态性。方法 :将 2 96例研究对象分为三组 :肥胖 4 7例 ,NIDDM79例 ,对照组 170例 ,用 PCR法扩增各组 ob基因的第一外显子 ,再用改良的 SSCP法对 PCR扩增片段进行分析比较 ,并对异常扩增片段测序。结果 :广西壮族人 ob基因第一外显子存在多态性 A75→ T。结论 :ob基因第一外显子突变并非导致肥胖症。