mRNA疫苗制备技术在甲型流感病毒疫苗研究中的应用

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、H1N1和H3N2亚型人流感病毒(Influenza virus,IV)均属于甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)。IAV含有多种亚型,毒株变异快,因此IAV疫苗株需要根据当年的优势毒株进行相应的调整,这给疫苗的研制和生产带来巨大挑战。信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)疫苗制备工艺简单、生产时间短且容易规模化生产,在疾病预防方面具有广阔的应用前景。笔者对mRNA疫苗的种类、优化策略和IAV mRNA疫苗的研究现状进行了综述,旨在为IAV mRNA疫苗的研发提供理论参考。

广西规模水禽养殖场鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定与耐药性分析

为了解广西地区规模化水禽养殖场鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的流行血清型、耐药情况及遗传关系,从广西南宁、贵港等地规模化水禽养殖场中临床上疑似感染RA的病死鸭、鹅体内得到5株分离菌,对分离菌进行鉴定,检测其毒力基因,通过多重PCR检测方法鉴定血清型,并对其进行耐药性分析。经试验得到鉴定结果,RA分离菌株在血琼脂培养基上呈平滑圆润、露滴样,圆形隆起的灰白色菌落;革兰氏染色呈阴性短杆菌;5株分离菌经16SrRNA鉴定均为RA,将其命名为2022NNRA01~2022NNRA05;其中,血清鉴定2022NNRA01为血清1型,其余均为血清2型。药敏试验结果显示,5株RA对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢噻呋、大观霉素、氟苯尼考、磺氨甲唑敏感,对其他抗菌药物呈不同程度的耐药。其中,对安普霉素、庆大霉素、卡那霉素氨基糖苷类药物,四环素类药物多西环素和利福霉素类药物利福平的耐药率为100%。本试验经分离鉴定成功得到5株RA,且其耐药性分析结果可为广西地区RA疾病的疫苗免疫预防选择以及药物治疗提供依据。

广西鸭源H3N8亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

[目的]了解广西水禽中分离到的H3N8亚型禽流感病毒的分子遗传进化特征。[方法]将从活禽市场采集的水禽棉拭子样品经处理后接种SPF鸡胚,应用血凝试验和血凝抑制试验对收取尿囊液进行血清学鉴定,然后对分离到的禽流感病毒进行全基因序列测定和遗传进化分析。[结果]血清学及HA和NA基因测序结果显示,该分离毒株为H3N8亚型禽流感病毒,命名为A/duck/Guangxi/446D28/2021(H3N8)。全基因遗传进化分析显示,其HA蛋白无连续碱性氨基酸插入,符合典型低致病性禽流感病毒的特征;NA蛋白出现耐药性氨基酸位点突变;该毒株8个基因片段在GenBank中比对分析结果显示,其同源性最高的毒株基本主要来自越南和位于我国候鸟迁徙路线上的宁夏及江西等省(区)。[结论]该分离株可能是不同亚型禽流感病毒通过相互基因交换所形成的基因重组体。

广西地区鸽圆环病毒Cap和Rep基因的克隆及遗传进化分析

研究旨在了解广西某肉鸽场鸽圆环病毒(PiCV) Cap和Rep基因的遗传变异情况,通过PCR技术对感染PiCV的鸽组织样品克隆Cap和Rep基因并进行测序及序列分析。结果显示,克隆的Cap和Rep基因大小分别为816 bp和954 bp。核苷酸序列同源性比对分析结果显示,克隆的Cap和Rep基因与XJ1毒株核苷酸同源性最高,分别为95.5%和97.6%。遗传进化分析结果显示,Cap和Rep基因与XJ1毒株亲缘关系较近。研究表明,广西鸽群中存在PiCV流行,其Cap和Rep基因与XJ1毒株核苷酸同源性最高,亲缘关系较近,这为广西地区PiCV的诊断及防控提供了重要参考。

西番莲茎叶提取物对热应激下蛋鸡产蛋性能、蛋品质和抗氧化性能的影响研究

试验旨在了解西番莲茎叶提取物对夏季热应激下蛋鸡产蛋性能、蛋品质和抗氧化性能的影响。试验于夏季选取210日龄海兰褐蛋鸡240只,随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组4组,对照组饲喂基础日粮,低、中、高剂量组分别在基础日粮中添加250、500、1000 mg/kg的西番莲茎叶提取物,试验期42 d。结果显示,低、中、高剂量组蛋重均显著高于对照组(P<0.05),高剂量组产蛋率显著高于对照组(P<0.05),高、中剂量组平均日采食量显著高于对照组(P<0.05),高剂量组料蛋比显著低于对照组(P<0.05)。高、中剂量组鸡蛋的蛋白高度和哈夫单位显著高于对照组(P<0.05),高剂量组鸡蛋的蛋壳厚度显著高于对照组(P<0.05);各组蛋黄重、蛋黄比例、蛋形指数和蛋黄颜色无显著差异(P>0.05)。高、中剂量组血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于对照组(P<0.05);低、中、高剂量组血清中丙二醛(MDA)含量显著低于对照组(P<0.05);各组间血清中超氧化物歧化酶、总抗氧化能力和过氧化氢酶活性差异不显著(P>0.05)。说明西番莲茎叶提取物可提高夏季热应激条件下海兰褐蛋鸡产蛋性能、蛋品质和抗氧化性能。

1株植物乳杆菌的生物学特性及体外抑菌活性研究

【目的】试验旨在研究植物乳杆菌GX20200417-1菌株的生物学特性及体外抑菌活性,探讨其在生产中应用的可能性。【方法】将植物乳杆菌GX20200417-1菌株接种至不同pH和含不同浓度胆盐的PBS,以及人工胃肠液中,使用菌落计数分析其对酸、胆盐和人工胃肠液的耐受性。使用牛津杯法检测GX20200417-1菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的抑菌能力;通过与霉菌毒素共培养后使用ELISA方法研究GX20200417-1菌株对霉菌毒素的降解能力,并饲喂小鼠进行安全性试验。【结果】植物乳杆菌GX20200417-1菌株能够耐受pH 2.0及0.3%胆盐,并在人工胃肠液中有至少1×10^(4) CFU/mL的活菌数;GX20200417-1菌株发酵上清液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用,对玉米赤霉素及黄曲霉毒素均有降解作用,但对呕吐毒素无降解作用;灌服GX20200417-1菌株后小鼠安全、无毒副作用。【结论】植物乳杆菌GX20200417-1菌株具有优良的益生特性,在畜禽生产中有一定的开发潜力。

血清4型禽腺病毒广西分离株单克隆抗体的制备及鉴定

为制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)广西分离株(FAdV-4-GX2018-005)的特异性单克隆抗体,将FAdV-4-GX2018-005作为免疫原免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株。利用阳性杂交瘤细胞株制备腹水并纯化得到单克隆抗体,利用ELISA和IFA鉴定单克隆抗体的特异性。结果表明,成功获得3株单克隆细胞株3A3、13A11和4D5。3株杂交瘤细胞株分泌的抗体,能与FAdV-4产生特异性反应,与其他血清型禽腺病毒(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10和FAdV-11)不发生反应。本研究成功制备FAdV-4广西分离株单克隆抗体,为FAdV-4检测方法的建立奠定了良好基础。

2019—2022年广西部分地区猪场主要病毒性疫病流行病学调查及分析

为了解2019—2022年广西地区猪场主要病毒性传染病的流行特征,应用PCR及RT-PCR方法对近四年临床上送检的疑似猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PoRV)感染的1046份病料进行病原检测,并开展流行病学分析。结果显示:CSFV、PRRSV、PCV-2、PCV-3、PRV、TGEV、PEDV和PoRV的阳性率分别是3.91%(21/537)、20.46%(143/699)、29.90%(116/388)、16.10%(81/503)、27.75%(121/436)、2.10%(8/381)、28.50%(61/214)和13.74%(18/131)。其中,PCV-2和PEDV的感染率呈逐年递减的趋势,TGEV的感染率呈逐年上升的趋势。单一性感染中PRV和PEDV感染率较高,平均感染率为别为13.53%,18.22%;双重感染中PRRSV和PCV-2的感染率最高,平均感染率达11.34%。其次为PEDV和PoRV二重感染,平均感染率为8.05%。PCV-3和PEDV的感染率在春季较高,分别为18.80%和40.00%。PRRSV、PCV-2、PRV、TGEV、PoRV的感染率在冬季比较高,分别为24.40%、40.57%、37.30%、3.23%、19.44%。结果表明:对广西猪场危害较为严重的病毒性疫病为PRRSV、PCV-2、PRV和PEDV,需要加强病原的监测和提高综合防控能力,以减少疾病的发生及经济损失。

新型阿卡斑病毒NSs蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】对新型阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)非结构蛋白(non-structura,NSs)进行生物信息学分析,进而制备抗多克隆抗体,为新型AKAV检测及功能研究提供必要材料。【方法】使用蛋白生物信息学在线分析网站,对新型AKAV NSs蛋白进行系统分析。克隆NSs全长基因,利用大肠杆菌表达系统表达NSs重组蛋白,优化蛋白诱导条件并分析重组蛋白的可溶性;收获破碎菌体,经8 mol/L尿素变性、Ni 2+-NTA亲和层析纯化、透析及浓缩后进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定;将纯化的重组NSs蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;应用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)测定多克隆抗体效价及特异反应性。【结果】生物信息学分析表明,NSs蛋白由91个氨基酸残基构成,等电点为12.10,属于碱性蛋白,不稳定指数约为79.04,平均亲水性为指数为―0.059,为不稳定的亲水蛋白;无跨膜区和信号肽,属于非分泌蛋白。试验成功构建了NSs蛋白原核表达载体pET-32a-NSs,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定显示,成功表达重组NSs蛋白,分子质量为29.3 ku,主要以包涵体形式存在,与生物信息学分析结果一致;制备的多克隆抗体效价可达1∶16384000,Western blotting和IFA结果表明所制备抗体能够与NSs蛋白发生特异性反应,具有较好的特异性。【结论】试验成功获得纯化的新型AKAV NSs蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性;制备获得效价高、特异性好的多克隆抗体,为后续新型AKAV疫苗开发、检测及NSs蛋白功能研究提供了基础。

广西本地黄牛环形泰勒虫病的诊治报告

牛环形泰勒虫病是由泰勒科泰勒虫属的环形泰勒虫寄生于黄牛、水牛、瘤牛、牦牛及犏牛的红细胞和淋巴细胞内所引起的一种血液原虫病,该病表现为地方性流行并且季节性明显,多呈急性经过,发病率和死亡率高,可给养牛业造成巨大的经济损失^([1-2])。2020年9月,广西西部山区某县牛场发生一起病例,经流行病学调查、病理剖检和实验室检查,确定是由环形泰勒虫感染所致。现将情况报告如下。

猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体2D7的制备与生物学特性鉴定

为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并鉴定其生物学特性,本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因,构建表达质粒,转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌,诱导表达后获得PDCoV-N重组蛋白,将其进行纯化后再免疫小鼠,制备针对PDCoV-N蛋白的mAb,并进行了抗体的效价测定、免疫荧光(IFA)、Western blot、亚类的鉴定、mAb特异性的鉴定。结果,成功构建pColdⅡ-PDCoV-N重组原核表达质粒,SDS-PAGE显示重组N蛋白成功表达,分子质量约为38 kDa;经小鼠免疫、细胞融合、亚克隆筛选获得1株分泌PDCoV-N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株;制备的腹水经间接ELISA方法测定抗体的效价为2.048×10^(6)。IFA、Western blot试验表明该mAb可以与PDCoV-N蛋白及全病毒特异性结合,亚类鉴定其亚型为IgG1,轻链为κ链。该mAb只与PDCoV反应,而与其他猪肠道病毒无交叉反应,表明本研究制备的mAb具有良好的特异性。本研究成功制备了PDCoV-N蛋白的mAb,为进一步研究PDCoV的生物学特性和诊断试剂的开发提供技术支持。

马脓皮病的病原分离鉴定及生物学特性研究

为探究马脓皮病的病原种类及特性,从病马的皮肤脓汁中分离到一株革兰氏阳性菌,经16SrDNA鉴定为金黄色葡萄球菌。经致病性试验、药敏试验、毒力基因和耐药基因等检测。结果显示,以浓度为9.3×10~8 CFU/mL菌液攻毒小鼠,致死率为40%;分离菌对氧氟沙星等14种药物高敏,具有fnbA、hly/hla、hysA、clfA和clfB等5个毒力基因和norA和gyrA 2个耐药基因。此结果可作为诊治马脓皮病用药参考。

广西猪繁殖与呼吸综合征病毒感染情况调查及其欧洲型毒株ORF5基因变异分析

为了解广西近期猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染情况及其欧洲型PRRSVORF5的遗传变异特点,2020年6月至2021年5月,采集广西14个设区市疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪病料、血清共782份,进行PRRSV的qRT-PCR分型检测及ORF5基因扩增,并运用SPSS23.0、DNAStar、MEGA X等生物学软件对检测结果及获得的PRRSVORF5基因序列进行分析。结果显示:样品检测总阳性率为29.54%,其中欧洲型(PRRSV-1)PRRSV阳性率为6.78%,美洲型(PRRSV-2)PRRSV阳性率为22.76%,表明受检猪群普遍存在PRRSV感染;在不同设区市中,贵港、崇左感染率最高(50.00%);在不同季度中,冬季感染率最高(41.00%);在不同年龄阶段猪群中,保育猪感染率最高(53.42%);感染主要以PRRSV-2为主,新发PRRSV-1感染;广西新发PRRSV-1在ORF5基因上存在相同独特的核苷酸及氨基酸变异特点,与中国香港分离欧洲株HKEU16亲缘关系较近,可能是在引种等贸易过程中所引进,并在饲养环境、免疫压力等多种因素的作用下发生了一定的变异;广西近期受检猪群普遍存在PRRSV-2感染,新出现PRRSV-1的感染,猪场应重视并及时调整、实施针对性的PRRS防控计划。

广西玉林市规模猪场生物安全风险调查与评估

猪场生物安全防控是生猪健康养殖的最重要环节。为掌握广西玉林市规模猪场生物安全现状及主要风险因子,通过问卷调查方式,对玉林市83家规模猪场的生物安全状况进行了风险调查与评估。结果显示:广西玉林市规模猪场生物安全高、中、低风险占比分别为12%、42%、46%,主要风险因子为“围墙外未建立绿化隔离带”“隔离区在生产区上风向”“与其他畜禽养殖场、主干道或居民区的距离在500 m以下”“猪场未实行自繁自养”“猪场无围墙或防疫沟”“场内运输车辆未执行专用且不出场外”“猪场猪繁殖与呼吸综合征病原学PCR检测阳性”。结果表明,广西玉林市规模猪场应重点从猪场选址、场内布局、设施设备、饲养管理及卫生防疫、免疫等方面进一步提高猪场生物安全水平。

一株广西鸡源H6亚型禽流感病毒全基因组序列分析及其重要生物学特性

2017年对广西地区活禽交易市场进行低致病性禽流感流行病学调查,从采集的鸡咽喉和泄殖腔拭子中分离鉴定出一株鸡源H6N6亚型禽流感病毒,命名为A/chicken/Guangxi/286C10/2017(H6N6)。应用RT-PCR方法分别对分离毒株的8个基因片段进行扩增,同时将产物进行克隆和测序,然后对测序结果进行同源性比对及遗传进化分析。另外,还通过固相受体结合试验对毒株的唾液酸受体进行测定。结果显示,该分离株的HA基因与广东分离株A/chicken/Guangdong/G3249/2014(H6)的核苷酸同源性最高,裂解位点符合低致病性禽流感病毒的分子特征;NA基因与江西分离株A/duck/Ganzhou/GZ148/2016(H6N6)核苷酸同源性最高;内部基因中,PB1和NS基因来源于广东的鸡,PB2基因来源于越南的鸡,PA、NP和M基因来源于广西的鹅;同时,研究还发现该病毒的HA、NA、PA、NP和M基因来源H6亚型AIV,PB2、PB1和NS基因来源H9N2亚型AIV,推测A/chicken/Guangxi/286C10/2017(H6N6)可能是由不同地区、不同宿主来源的H6和H9亚型AIV通过基因重组产生的一株新的重配毒株。由于广西地理位置特殊,今后应加强对该地区H6亚型禽流感病毒变异情况的监测。

通过抑制caspase-8活性提高PRRSV体外培养滴度的初步研究

探讨通过凋亡抑制剂阻断PRRSV诱导的细胞凋亡来促进PRRSV体外复制,从而提高PRRSV体外培养滴度的可行性。本研究以PRRSV高致病毒株(HP-PRRSV)感染Marc-145细胞,并用三种凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHDFMK)分别处理PRRSV感染细胞,通过比较在不同的浓度、不同的作用时间处理下PRRSV培养滴度(TCID50)来筛选最佳抑制剂及其最佳使用浓度和作用时间。同时采用caspase-8活性蛋白酶检测试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、流式细胞术等检测在最佳抑制剂作用下caspase-8活性、细胞凋亡及其通路相关因子表达情况。结果显示:z-IETD-FMK(caspases-8特异性抑制剂)为最佳抑制剂,10μmol/L为最佳使用浓度,PRRSV感染细胞48 h后加入10μmol/L Z-IETD-FMK能最大限度提高PRRSV体外培养滴度。此外,PRRSV感染Marc-145细胞后,细胞caspase-8活性显著增加,且随着感染时间的延长,细胞凋亡率及促凋亡因子Bax均呈上升趋势,而抑凋亡因子Bcl-2表达水平却呈下降趋势;用抑制剂z-IETD-FMK处理后,细胞caspases-8活性下调,细胞凋亡率也下降,Bax表达量显著低于不加抑制处理的病毒感染组(P<0.01),与此相反Bcl-2的表达水平为升高趋势,显著高于不加抑制处理的病毒感染组(P<0.01)。说明,caspase-8特异性抑制剂能有效抑制PRRSV诱导的细胞凋亡。结果提示HPPRRSV感染可通过caspase-8途径诱导Marc-145细胞凋亡,从而抑制病毒的复制。使用caspase-8特异性抑制剂可有效抑制细胞凋亡,进而提高病毒体外培养滴度。

H9亚型禽流感病毒M1蛋白原核表达及免疫效果初步研究

旨在原核表达H9亚型禽流感病毒(AIV)M1蛋白,初步探究其免疫效果,为研制AIV疫苗奠定基础。通过构建重组质粒pET-32a-M1,诱导表达,Western blot验证蛋白表达情况,将重组蛋白免疫接种小鼠,通过测定血清中IgG抗体效价,脾细胞培养上清多细胞因子分泌情况评价其免疫效果。结果显示,M1重组蛋白主要以可溶性蛋白存在,Western blot结果可见特异性条带。免疫接种小鼠后,血清产生IgG抗体,抗体效价为1∶30000。小鼠脾细胞上清液IL-2、IL-4、IL-6与对照组相比较,含量显著增加(P<0.01),而抑制IL-1β、IL-5、IL-13、IL-12p70、IL-18、GM-CMF、IFN-γ、TNF-α分泌。结果表明,M1重组蛋白免疫原性良好,刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,为禽流感疫苗深入研究奠定了基础。

广西外观正常猪群中博卡病毒检测及全基因遗传演化分析

为掌握广西外观正常猪群中博卡病毒(PBoV)的感染情况,本研究采用PCR方法对采自广西境内的274份1~2月龄保育猪血清、咽拭子和肛拭子样品进行检测。结果显示:3种样品的阳性率分别为1.9%(2/106)、83.3%(75/90)和82.1%(64/78),不同PBoV基因群的检出率分别为G3(47.4%,130/274)>G2(32.8%,90/274)>G1(20.1%,55/274),说明PBoVG3是广西PBoV流行的主要基因群;不同基因群的混合感染情况普遍存在,G2+G3二重感染率最高,为17.9%(49/274);从PBoV阳性样品中扩增获得8条PBoV全基因序列;8个毒株分别处于PBoVG1、PBoVG2和PBoVG3三个进化分支,PBoVG2和PBoVG3的6个毒株均包括与磷酸酯酶A2(PLA2)活性相关的保守氨基酸序列HDXXY和YXGXF。本研究结果为PBoV的进一步防控提供了数据信息和科学依据。

2017年广西地区活禽市场新城疫病原学监测与遗传进化分析

为研究新城疫病毒(NDV)在广西活禽市场的感染情况,本研究随机从广西地区10个活禽市场采集家禽口咽、泄殖腔拭子共1352份,通过病毒分离、RT-PCR和序列测定,对广西NDV的感染情况和其F基因分子特征进行了分析。结果显示,2017年共分离到17株NDV (分离率为1.26%),其中,11株分离自鸭,6株分离自鸡,鹅和鸽子未分离到该病毒;17个NDV分离株的蛋白裂解位点氨基酸组成为^(112)G/E-K/R-Q-G/E-R-L^(117),符合NDV弱毒株的典型特征;遗传进化分析显示所分离的17株病毒,10株为Ⅰ类NDV基因3型,7株为Ⅱ类NDV基因I型。本研究为科学防控广西地区新城疫提供了参考数据。

2013～2016年广西部分规模猪场猪伪狂犬病gE抗体检测分析

为了解广西壮族自治区规模猪场猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒感染情况和流行态势,对2013年1月～2016年12月广西14个地级市290个规模猪场共送检的8676份血清样品,应用gE-ELISA进行PRV gE抗体血清学检测。结果显示,290个猪场中,142个猪场为PRV野毒感染阳性场,阳性率为48.97%;受检猪血清样品8676份中,PRV gE抗体检出阳性数为1957份,阳性率为22.56%; 2013～2016年,PRV gE抗体检出阳性率分别为4.68%、21.16%、24.00%和29.85%,PRV gE抗体检出阳性率呈逐年上升趋势。