一株鸭源基因Ⅸ型新城疫病毒广西分离株的生物学特性及全基因序列分析

为全面了解广西分离株GX19/2011的生物学和遗传特性,对分离株的鸡胚平均致死时间(MDT)、1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)、6周龄鸡胚静脉接种致病指数(IVPI)和对鸭的致病力进行测定,并对其全基因遗传特性进行研究研究。结果显示:该分离株的ELD50为10-9.48/0.1 mL、MDT为51.4h、ICPI为1.80、IVPI为2.82。使用该毒株分别感染35日龄和50日龄的鸭,发病率均为100%,死亡率分别为100%,70%。该毒株全长为15192bp,与F48E8和GD09-2等参考毒株的亲缘关系较近,均属于基因Ⅸ型。该分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-R-R-F117,具有强毒株的典型特征。生物学特性和遗传进化分析结果都表明该毒株为速发型强毒株,同时对鸭具有较强的致病力。

鸭源新城疫F基因和鸭圆环病毒Cap基因融合表达DNA疫苗的构建

设计了2对特异性引物,PCR扩增出鸭源NDV分离株GX2011/19的F基因和DuCV的Cap基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1,成功构建重组融合表达质粒pcDNA3.1-F-Cap。经酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒pcDNA3.1-F-Cap转染Vero细胞,采用间接免疫荧光检测到目的基因的体外表达。将pcDNA3.1-F-Cap作为DNA疫苗对2周龄的SPF雏鸭以胸部肌肉多点注射的方式进行免疫。分3个实验组,每组接种剂量分别为100、200和300μg/只,另设2组为载体质粒空白组和灭活疫苗组。ELISA检测抗体水平,试验结果显示:各DNA疫苗免疫组的NDV抗体和DuCV抗体水平明显高于载体空白对照组,差异显著(P<0.05);二免后不同DNA剂量组间的抗体水平随着免疫剂量的增大而增加,差异显著(P<0.05);于第二次免疫后2周,使用分离株GX2011/19以滴鼻的方式进行攻毒试验。接种pcDNA3.1-F-Cap剂量为300μg/只免疫组的保护率为40%,高于200μg/只组(30%)和100μg/只组(10%)。研究结果表明,构建的DNA疫苗对新城疫病毒的强毒攻击具有一定的抵抗力,此疫苗的保护率随着免疫剂量的增大而有所增加。

禽呼肠孤病毒强毒株和弱毒疫苗株感染Vero细胞的蛋白质组学研究

为研究在禽呼肠孤病毒(ARV)不同毒力毒株感染后不同时间点宿主细胞中蛋白质组变化,运用双向凝胶电泳技术和质谱鉴定的蛋白质组学方法,对ARV强毒株S1133、弱毒疫苗株aS1133感染Vero细胞和对照细胞在不同时间点的蛋白质样品进行检测。鉴定结果表明,共鉴定出44个差异表达蛋白质,这些蛋白质包括α-烯醇化酶(α-enolase)、过氧化物酶(Prx-4)、hnRNPs、微管蛋白(Tubulin)、蛋白磷酸酶、转录延伸因子等。GO软件分析显示这些差异蛋白质主要参与细胞信号、细胞骨架组成、能量代谢、核酸代谢、蛋白质折叠、细胞增殖及凋亡等生物学功能。荧光定量RT-PCR验证表明,hnRNP和Prx-4在S1133感染细胞中表达水平持续上调,而Tubulin和α-enolase仅分别在48和24h时表达上调,与双向凝胶电泳的结果一致。以上试验数据揭示了ARV不同毒力毒株感染后细胞中蛋白质表达的差异变化,有助于进一步阐明ARV和宿主之间的相互作用。

猪繁殖与呼吸综合征病毒及疫苗的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)严重危害养猪业的健康发展,每年给养猪业带来巨大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是PRRS的致病因子,其可引起孕猪在妊娠后期出现早产、流产或死产等繁殖障碍,并可在新生仔猪引起呼吸系统症状。目前虽然已有商业化的灭活疫苗及减毒活疫苗,但它们的保护效果仍不理想。因此深入研究PRRSV的基因结构、蛋白功能、病毒的生物学性状及致病机制将有助于研发安全、有效的PRRS疫苗。作者对PRRSV及其疫苗的研究进展作一综述。

4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定

本实验经尿囊腔接种方式从SPF鸡胚和健康鸭胚分离到4株广西鸭源坦布苏病毒。采集4羽病鸭的卵泡膜和输卵管无菌处理后接种SPF鸡胚和健康鸭胚。收获24h后死亡的鸡胚和鸭胚的尿囊液。所分离到的病毒经传4代后，鸡胚和鸭胚的死亡时间集中在90～110h之间。根据GENBANK已有的坦布苏病毒序列设计一对特异性引物，结果收获的尿囊液RT-PCR产物能扩增出特异性片段，并且排除其他引起鸭产蛋下降的病毒。参照文献用另外一对引物扩增出坦布苏病毒的部分E基因序列，比对分析后，这4株鸭源坦布苏病毒之间的核苷酸相似性为99．2％～99．9％，与中国其他坦布苏病毒分离株的相似性介于95．8％-97．64％，与马来西亚分离株sitiawan株和MM1775株相似性介于86．4％～87．6％。绘制系统进化树发现，这4个分离株处于一个独立的小分支，说明广西的鸭源坦布苏病毒与中国其他地区的分离株存在一定的差异。

甲型流感病毒M2e通用疫苗的研究进展

流感严重地影响人们的身体健康和工作生活,给社会带来巨大经济损失。疫苗接种是预防流感的有效措施之一,市场上的流感疫苗包括流感灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗等。这些流感疫苗只能预防相同亚型流感病毒的感染,无法预防不同亚型流感病毒引起的季节性流感和流感大流行,因此迫切需要研发广谱的能预防不同亚型的甲型流感病毒感染的通用疫苗。在此简要介绍甲型流感病毒M2e通用疫苗的研究进展。

牛结核病疫苗研究概述

BCG疫苗株自Calmette和Guerin俩人分离出至今已有近百年的历史。BCG疫苗可用于预防牛结核病,但对牛的保护效果不完全,所以人们仍在不断地研发新型的牛结核病疫苗。本文将介绍目前正在使用及研发的牛结核病疫苗的主要类型、面临的挑战及今后的发展方向。

鸭源新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭圆环病毒三重PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测鸭源新城疫病毒(DuNDV)、鸭瘟病毒(DPV)和鸭圆环病毒(DuCV)的方法,根据DuNDV、DPV和DuCV基因的保守序列设计了3对特异性引物,预特异扩增DuNDV片段大小为823bp,DPV为576bp和DuCV为338bp。经过反应条件的优化,建立了DuNDV、DPV和DuCV的三重PCR检测方法。该方法特异性好,对鸭的其他病原检测结果为阴性;敏感性高,DuNDV、DPV和DuCV的核酸最低检出限分别为2.59×103、1.12×103、4.67×102拷贝/μL。对180份病料进行检测,结果DuCV阳性10份,阳性率为5.6%;DuNDV阳性1份,阳性率为0.56%。结果表明,建立的多重PCR方法可以应用于DuNDV、DPV和DuCV的临床检测和流行病学调查。

鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank中鸭新城疫病毒(NDV)的F基因和鸭圆环病毒(DuCV)的V1/rep基因的保守序列,各设计一对特异性引物,并对二重PCR的扩增条件进行优化,建立了鸭NDV和DuCV的二重PCR检测方法。对混合样品进行扩增,得到2条大小为493bp(鸭NDV)和218bp(DuCV)的特异性条带,与预扩增片段相符。而对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原检测,结果为阴性。该方法的敏感性试验表明,鸭NDV的核酸最小量为40fg,DuCV为20fg。

基于纳米材料的电化学免疫传感器检测H5N1亚型禽流感病毒的研究

利用氧化石墨烯(GO)负载H5N1亚型禽流感病毒多克隆抗体(PAb-H5N1)及牛血清白蛋白(BSA)作为信号放大材料,构建一种新型电化学免疫传感器用于检测H5N1亚型禽流感病毒。结果表明:以PAb-H5N1-GO-BSA纳米复合物作为信号放大材料构建的电化学免疫传感器的灵敏度比不用此纳米复合物作为信号放大的高256倍。以PAb-H5N1-GO-BSA纳米复合物作为信号放大材料构建的电化学免疫传感器对H5N1亚型禽流感病毒的检测限为2-15 HA unit·50μL-1,检测线性范围为2-15～2-8 HA unit·50μL-1。此传感器特异性好,灵敏度高,在病原微生物快速检测领域具有良好的应用前景。

甲型流感病毒NS1、NS2和NS3蛋白的研究进展

甲型流感病毒基因组含有8个基因节段,其中血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、NP核蛋白(NP)及碱性聚合酶2(PB2)基因只能分别编码1个病毒蛋白质。而M基质蛋白(M)、碱性聚合酶1(PB1)、酸性聚合酶(PA)及NS非结构蛋白(NS)的基因均可编码2种以上的蛋白质,使得甲型流感病毒基因组编码的蛋白质种类多达17种。研究发现M基因编码M1、M2和M42 3种蛋白质;PB1基因编码PB1、PB1-F2和PB1-N40 3种蛋白质;PA基因编码PA、PA-X、PA-N155及PA-N182 4种蛋白质;NS基因则编码NS1、NS2和NS3 3种蛋白质。NS3蛋白于2012年首次报道,它是由NS3mRNA编码的1种新的流感病毒蛋白质。作者将对流感病毒NS基因编码的NS1、NS2和NS3 3种蛋白质的研究进展作简要的介绍。

桃金娘化学成分及生物活性的研究进展

桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa)是一种野生药用植物资源,具有新兽药开发潜在利用价值。作者主要介绍了桃金娘资源分布情况,综述了国内外桃金娘化学成分及其生物活性研究进展和临床应用概况,旨在为今后桃金娘在兽药学的研发提供理论基础。

H7N9亚型禽流感病毒研究进展

禽流感病毒(AIV)属于A型流感病毒,它不仅可感染其天然宿主野鸟,而且还可以感染家禽或某些哺乳动物,也会感染人。近年来AIV感染人的病例呈上升趋势,我国于2013年首次发现H7N9亚型AIV感染人并致死的病例。H7N9AIV感染人的病例至今仅限于中国大陆、香港和台湾,目前尚未在其他国家和地区被发现。H7N9亚型AIV虽然对家禽致病性低,但感染人后可以引起严重的呼吸系统症状及多个器官衰竭,甚至死亡。H7N9亚型AIV的感染不仅会影响人们的日常生活,而且对人的身体健康危害很大,同时还可能有引发流感大流行的潜在危险。目前仍缺乏用于预防和治疗H7N9亚型AIV感染的有效疫苗及药物。论文简要介绍H7N9亚型AIV的流行现状、病毒基因的来源及毒力等特点,并比较H7N9与H5N1亚型AIV之间的差异。

H10N8亚型禽流感病毒的研究进展

中国于2013年底首次发现H10N8亚型禽流感病毒(AIV)能感染人并致死的病例,而在此之前从未有过关于H10N8亚型病毒能感染人的报道,目前也未在其他国家监测到H10N8亚型AIV感染人的病例。与H7N9亚型AIV相似,H10N8亚型AIV在家禽中致病性很弱,可一旦感染人能表现出很强的致病性。感染了H10N8亚型AIV的患者病情恶化快、死亡率高、对人的健康危害很大,但至今尚无有效的防制手段。目前还不太清楚H10N8亚型AIV是通过何种途径传播给人的,今后H10N8亚型AIV是否会在人群中引发新的疫情暴发是人们普遍关心的问题。文章简要介绍了H10N8亚型AIV的特点及研究现状。

蛋白质组学研究方法及应用的研究进展

蛋白质是细胞生理功能的具体执行者,并常以蛋白复合体或与核酸相互作用的形式来发挥作用。蛋白质组代表在一定时间和特定条件下,1个细胞、组织或生物个体所表达的全部蛋白,因此蛋白质组会随着时间和空间的改变而发生动态变化。蛋白质组学从整体水平研究蛋白质组的结构、功能、表达模式及其相互作用的方式。根据研究内容的不同,蛋白质组学可分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学等。研究蛋白质组学有助于了解蛋白的结构、细胞的功能、生命的本质及活动规律,为疾病的诊断、治疗、疫苗及新药开发提供科学依据。研究蛋白质组学的常用手段主要有:双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱、酵母双杂交系统及蛋白芯片法等,文章将对蛋白质组学常用的技术方法及应用进行综述。

黄藤素研究进展

黄藤素是中国自行研制的纯天然植物药,主要用于治疗妇科炎症、外科感染、菌痢、肠炎、呼吸道及泌尿道感染、眼结膜炎等。作者就近年来黄藤素的提取及人工合成研究、检测方法、药理作用进行综述,以期为黄藤素作为新兽药的开发利用提供参考。

甲型流感病毒M1、M2和M42蛋白研究进展

甲型流感病毒基因组由8个分节段的基因组成,最初认为流感病毒的每个基因只能编码1个病毒蛋白,但随后发现M基因编码2种蛋白,即M1基质蛋白和M2离子通道蛋白。近年来的研究表明PB1基因编码PB1、PB1-F2和PB1-N40 3种蛋白,而PA基因则能编码PA、PA-X、PA-N155及PA-N182 4种蛋白。到目前为止,流感病毒的4个基因都已被证明能编码两种或两种以上的蛋白,说明流感病毒可以利用感染细胞的mRNA选择性剪接及蛋白翻译的不同机制实现其相关基因节段编码更多蛋白的能力。2012年发现流感病毒M基因可以编码一种新的蛋白,即M42蛋白。论文将对甲型流感病毒M基因所编码的M1、M2及M42这3种病毒蛋白的研究概况进行综述。

基于纳米材料电化学免疫传感器检测禽呼肠孤病毒研究

【目的】构建一种用于检测禽呼肠孤病毒(ARV)的新型电化学免疫传感器。【方法】将石墨烯(G)和甲壳胺(Chi)分散在乙酸溶液中得到均匀的混合物后,加入HAuCl4溶液于80℃还原成金纳米粒子(AuNPs),得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子(G-Chi-AuNPs)纳米复合物。将石墨烯(G)和甲壳胺(Chi)分散在乙酸溶液中得到均匀的混合物后,先加入AgNO3溶液于80℃还原成银纳米粒子(AgNPs),再加入禽呼肠孤病毒单克隆抗体(ARV-MAb),得到石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子-禽呼肠孤病毒单克隆抗体(G-Chi-AgNPs-ARV-MAb)纳米复合物。将G-Chi-AuNPs纳米复合物修饰金电极作为传感器平台,固定待检测样品,然后加入G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物,并对G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物的孵育时间进行优化,构建了ARV电化学免疫传感器。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对禽流感(H5N1、H3N6和H9N2亚型)、新城疫病毒(NDV)、喉气管炎病毒(LTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)进行检测,以确定ARV电化学免疫传感器的特异性。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对106.5—100.5 TCID50/mL的病毒进行检测,以确定ARV电化学免疫传感器的敏感性试验。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对临床样品进行检测,其确定ARV电化学免疫传感器的实用性。【结果】所建立的ARV电化学免疫传感器,G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物的最佳孵育时间为40 min。当检测的样品为阳性时,ARV与ARV-MAb特异结合,G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物被固定到电极的表面使其线性伏安曲线出现AgNPs的氧化峰;当检测样品为阴性时,其线性伏安曲线不出现AgNPs的氧化峰。特异性结果表明,所建立的方法仅对ARV的检测为阳性(出现AgNPs的氧化峰),而对非目标禽流感(H5N1、H3N6和H9N2亚型)、NDV、LTV、IBV和IBDV的检测为阴性(不出现AgNPs的氧化峰)。敏感性结果表明,所构建的ARV电化学免疫传感器,具有很高的敏感性,对ARV检测的敏感性达101.5 TCID50/mL。使用建立的ARV电化学免疫传感器对22份临床样品进行检测,结果与病毒分离方法相符。【结论】所建立的ARV电化学免疫传感器,具有特异性强、敏感度高及快速的特点,为有效检测诊断禽呼肠孤病毒提供了一种新的快速检测诊断技术。

中国沿海主要养殖贝类四种原虫病流行病学的调查研究

为全面系统了解中国沿海主要养殖贝类4种原虫病的分布和流行状况,本研究从2006年10月到2012年10月的6年间,在中国主要贝类养殖海区采集牡蛎、文蛤和扇贝等11种养殖贝类331批共11291份,并对其四种原虫的感染情况进行检测和调查。结果显示,4种原虫的感染率累计为15.28%(1725/11291),其中感染率最高的为派琴虫(9.98%)(1127/11291),其次为尼氏单孢子虫(3.99%)(451/11291),最低为折光马尔太虫(1.30%)(147/11291),未检出包拉米虫的感染。在单个的牡蛎、花甲螺、菲律宾蛤仔、扇贝、溢蛏和血蛤中,存在多种原虫混合感染的现象,混合感染率为6.78%(117/1725),其它贝类均为单一感染,感染率为93.22%(1608/1725)。调查结果还表明,中国不同海域和不同品种的牡蛎,尼氏单孢子虫和派琴虫的感染率存在明显差异。该调查结果将为中国贝类养殖原虫病的防治提供重要的科学依据。

贝类奥尔森派琴虫可视化LAMP检测技术的建立与应用

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg。用该项LAMP技术与OIE公布的派琴虫PCR检测技术分别对50份分别来自华东及华南沿海地区的牡蛎样品进行检测,同时对PCR阳性样品进行测序分析。结果 LAMP检测到2份奥尔森派琴虫,PCR方法检测到9份派琴虫。测序分析结果表明,PCR方法检测到的9份派琴虫阳性样品中有2份为奥尔森派琴虫,其结果与LAMP检测结果相符,说明该技术适用于贝类样品奥尔森派琴虫的检测。