蠕虫感染与过敏性和自身免疫性疾病

许多研究发现蠕虫感染后虫源性分子诱导免疫细胞形成免疫调节网络,介导免疫抑制,从而抑制过敏性和自身免疫性疾病。寄生虫可以通过诱导免疫调节细胞活化和产生细胞因子发挥抑制效应,从而影响其他免疫相关疾病。然而,蠕虫感染与免疫相关疾病之间的调节机制尚无明确的结论。一些蠕虫感染可以保护和控制过敏性疾病,而另一些蠕虫却加剧疾病的免疫病理损害。

淋病奈瑟菌孔蛋白PorB的原核表达及其在疫苗血清学检测中的初步应用

目的克隆并表达淋病奈瑟菌孔蛋白Por B,以重组蛋白为抗原,间接ELISA检测免疫血清的抗体水平。方法利用PCR从淋病奈瑟菌WHO株基因组中扩增出Por B的基因,克隆入原核表达载体p ET-30a中,构建出重组表达质粒p ET30aPor B,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。表达的蛋白进行SDS-PAGE分析,Western blot检测其反应原性。以纯化的重组蛋白r Por B作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测淋病疫苗p VAX1-Por B免疫小鼠后的血清抗体水平。结果 PCR扩增得到淋病奈瑟菌孔蛋白Por B基因,表达的重组蛋白r Por B相对分子质量约40 k D,经Ni-NTA亲和层析纯化后的r Por B在SDS-PAGE中显示单一条带,Western blot证明纯化后的r Por B可与淋病奈瑟菌免疫血清特异性结合,具有良好的免疫反应性。间接ELISA结果表明,淋病疫苗p VAX1-Por B免疫小鼠血清Por B特异性抗体滴度为1∶200。结论成功构建了重组原核表达质粒p ET30a-Por B,Por B在大肠杆菌中获得表达。以纯化的r Por B为检测抗原,间接ELISA可以用于淋病疫苗免疫效果的评价。该研究为淋病奈瑟菌感染诊断、疫苗的研究奠定了基础。

人体寄生虫学开展研究性教学的探索

人体寄生虫学是临床医学和预防医学的主要基础课程之一,也是基础医学与临床医学的桥梁。课堂教学中进行研究性教学,采用病例导入的形式,并结合不同的专业侧重于不同的内容,既有助于学生对课程内容的理解和掌握,更有利于培养学生的创新思维,提高其综合分析问题的能力。

脂多糖对B细胞的活化作用及机制的初步研究

目的观察TLR4配体脂多糖(LPS)对B细胞功能影响及相关的信号转导通路。方法利用免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD19+B细胞,体外用LPS刺激后,CBA(cytometric bead array)法检测B细胞分泌的Ig(immunoglobulin)亚型;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测B细胞表型;CBA法检测培养上清中细胞因子IL-6、IL-10、IL-12p70、TNF浓度。利用ERK、JNK、p38MAPK和NF-κB信号转导抑制剂检测B细胞内细胞因子分泌的信号转导通路。结果 LPS可以诱导B细胞产生IgG1-κ和IgM-κ抗体,上调B细胞表面CD40、CD80、CD86和MHCⅡ类分子的表达,促进IL-6、IL-10和TNF的高分泌。JNK、p38MAPK和NF-κB信号转导通路调控B细胞IL-6、IL-10和TNF的分泌。结论 LPS可以通过诱导抗体产生、上调共刺激分子表达和促进细胞因子分泌等多方面调节B细胞功能。

TLR3激动剂对B细胞功能的影响

目的观察TLR3激动剂Poly I:C对B细胞功能的影响,包括细胞增殖、共刺激分子表达、细胞因子和抗体的分泌情况。方法利用免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD19+B细胞,RT-PCR法证实其表达TLR3。体外用Poly I:C刺激B细胞一定时间后,CFSE分裂法检测B细胞增殖,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测B细胞表面共刺激分子表达,CBA(cytometric bead ar-ray)法或ELISA法检测培养上清中细胞因子含量,CBA法检测B细胞分泌Ig的亚型。结果 Poly I:C可以促进B细胞增殖,上调B细胞表面CD40、CD80、CD86和MHC II类分子的表达,促进IL-6和TNF-α的高分泌,诱导IgG1κ抗体的产生。结论 Poly I:C可以通过促进增殖、细胞因子分泌,诱导抗体产生和上调共刺激分子表达等多方面调节B细胞功能。

肠道线虫感染连续选择性化疗10年效果分析

目的分析试点村人群肠道线虫感染连续选择性化疗的效果，为防治提供依据。方法用改良Kato法和饱和盐水浮聚法对试点村人群进行肠道线虫感染普查，虫卵阳性者主要用阿苯达唑300mg和复方甲苯达唑375mg，1．5d疗法，连续选择性化疗10年。运用统计软件R2．2．1建立负二项模型拟合数据，统计分析疗效。结果试点人群肠道线虫总感染率从化疗前的89．73％降至化疗后的1．28％。钩虫感染率和感染度从58．79％和526．29降至1．08％和56．91，均呈“L”型下降趋势。感染率和感染度在第1～3次化疗后即出现低水平波动。蛔虫感染率和感染度从51．14％和25311．23均降至0。鞭虫感染率和感染度从64．17％和439．46降至0．20％和14．00。结论连续选择性化疔可使人群肠道线虫感染率和感染度迅速下降，并维持在较低水平。

慢性髓细胞白血病BCR-ABL融合基因片段的克隆表达及其单克隆抗体的制备

目的制备针对慢性髓细胞白血病(CML)bcr-abl融合蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法采用PCR方法扩增包含BCR-ABL(b3a2)融合位点周围约450bp的基因片段,将其定向克隆到pQE-31载体内,转化大肠杆菌M15菌株,诱导表达6×His标签的融合蛋白p18bcr-abl并对其进行纯化,用纯化后的蛋白免疫Balb/c小鼠,采用常规的细胞融合技术制备针对bcr-abl蛋白的mAb并对其特性进行鉴定。结果获得了6株分泌抗bcr-abl融合蛋白mAb的杂交瘤细胞株,所分泌的mAbs均特异性识别bcr-abl蛋白abl端。结论本研究中所表达的融合蛋白p18bcr-abl及其mAb的获得为慢性髓细胞白血病的研究提供了有效的工具。

应用dtSCT技术制备低亲和力抗原肽InsB_(15-23)肽的MHCⅠ四聚体

目的制备低亲和力InsB15-23抗原肽的MHCⅠ四聚体。方法应用二硫键捕获型单链三聚体(disulfide-trap singlechain trimer,dtSCT)技术,将InsB15-23抗原肽、小鼠β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)和H-2Kd分子以柔性接头(linker,L)依次连接,并在抗原肽的C末端与H-2Kd分子间引入了二硫键,以提高抗原肽与H-2Kd分子结合的稳定性。融合基因克隆入pET-22b原核表达载体,经过诱导表达、洗涤包涵体、稀释复性等步骤获得单体,生物素化后制成InsB15-23dtSCT型四聚体。结果我们比较了自制InsB15-23dtSCT四聚体和商品化G9V传统五聚体对小鼠外周血特异性CTLs的检出率。2种多聚体对阴性对照Balb/c小鼠都显示出很低的非特异性标记水平,都能检出4周龄NOD母鼠外周血中低水平的InsB15-23特异性CTLs,且二者的检出率无统计学差异。结论我们成功制备出稳定的InsB15-23dtSCT型四聚体。与商品化的传统五聚体相比,我们自制的四聚体具有类似的检出率和低非特异性标记水平。

NKG2D配体RAE1ε对乳腺癌细胞4T1衍生MDSC功能的影响

目的:探讨表达小鼠NKG2D配体之一视黄酸早期转录因子1ε(retinoic acid early transcript 1ε,RAE1ε)的原B淋巴细胞Ba F3对乳腺癌细胞株4T1成瘤小鼠来源的髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)功能的影响。方法:以小鼠原B淋巴细胞株Ba F3为基础,构建表达RAE1ε的Ba F3-RAE1ε细胞以及表达空质粒的Ba F3-mock对照细胞。通过4T1原位肿瘤模型诱导产生CD11b+Gr-1+MDSC,将Ba F3-mock细胞和Ba F3-RAE1ε细胞作为刺激细胞,分别与脾MDSC共培养,流式细胞术检测MDSC表面CD40、CD80、F4/80、CD11c的表达和MDSC内活性氧(ROS)的水平;ELISA法检测共培养上清液IL-10、IL-4和IFN-γ的含量;Griess法检测共培养上清液一氮化氮(NO)的浓度。磁珠分选共培养体系中的MDSC,检测裂解后精氨酸酶的活性;另外,将分选后的MDSC与抗CD3/抗CD28抗体活化的脾细胞共培养,CFSE法检测活化的CD3+CD8+T细胞增殖情况。结果:成功获得4T1原位肿瘤模型来源的小鼠脾MDSC。与Ba F3-mock细胞相比,Ba F3-RAE1ε细胞刺激对MDSC分泌IL-4、IFN-γ、IL-10和NO的水平没有明显影响(P>0.05);对MDSC表达CD40、CD80、F4/80、CD11c和ROS也没有显著影响(P>0.05)。与Ba F3-mock细胞相比,Ba F3-RAE1ε细胞刺激显著提高MDSC的精氨酸酶活性(156.166±1.209 vs 110.135±7.356,P<0.01),并明显增强MDSC对CD8+T细胞增殖的抑制作用。结论:RAE-1ε在体外增强4T1成瘤小鼠来源的MDSC的抑制功能。

膜型IL-15联合RAE-1ε增强小鼠NK细胞的杀伤活性

目的:探讨视黄酸早期转录因子1ε(retinoic acid early transcript 1ε,RAE-1ε)和膜型IL-15对小鼠NK细胞杀伤功能的影响。方法:前期研究以小鼠原B淋巴细胞株BaF3为基础构建了3株BaF3工程细胞株,即表达膜型IL-15的BaF3/mb15细胞、表达RAE-1ε的BaF3/RAE细胞和同时表达膜型IL-15和RAE-1ε的BaF3/mb15/RAE细胞。将γ射线灭活后的3株BaF3工程细胞株作为刺激细胞,分别刺激小鼠NK细胞。流式细胞术检测刺激后NK细胞表面分子的表达,胞内染色法检测NK细胞穿孔素和颗粒酶B的分泌,流式细胞术检测NK细胞对小鼠淋巴瘤YAC1细胞的杀伤活性。结果:与BaF3/mb15和BaF3/RAE细胞相比,BaF3/mb15/RAE细胞可有效上调NK细胞表面CD25、CD44、FasL和CD107a的表达,但对穿孔素和颗粒酶B的分泌没有明显刺激作用。当效靶比为20:1时,BaF3/mb15、BaF3/RAE和BaF3/mb15/RAE细胞刺激后NK细胞对靶细胞YAC1的杀伤率分别为(39.7±2.9)%、(45.3±2.3)%和(59.0±6.9)%,均高于BaF3组的(28.3±1.5)%(P<0.01),且BaF3/mb15/RAE组高于BaF3/mb15和BaF3/RAE组(P<0.05)。结论:膜型IL-15联合RAE-1ε可促进NK细胞活化并增强NK细胞的杀伤活性。

钩虫感染连续化疗效果分析

目的分析试点村人群钩虫感染连续化疗的效果。方法1987-1997年间，经定量透明法和饱和盐水浮聚法对试点村人群进行钩虫感染普查，对钩虫卵阳性者主要用阿苯达唑300mg和复方甲苯达唑375mg，1．5日疗法，连续选择性化疗11年。运用统计软件R2．2．1建立负二项分布模型拟合数据，统计分析疗效。结果钩虫感染率和感染度（EPG）从化疗前的58．79％和526．29降至化疗后的1．08％和56．91，均呈“L”型下降趋势，感染率和感染度在第1—3次化疗后即降到低水平，此后维持在低水平波动。结论连续选择性化疗可使钩虫病流行区的感染率和感染度迅速下降，并维持在较低水平。

钩虫病防治研究进展

钩虫病(ancylostomiasis)是由钩虫寄生人体引起以缺铁性贫血和营养不良为主要临床表现的疾病.

转基因细胞株BaF3-mb15-RAE对IKDC功能分子表达的影响

目的:探讨单独或共同表达视黄酸早期转录因子1ε(retinoic acid early transcript 1ε,RAE1ε)和膜型IL-15的B淋巴细胞BaF3对小鼠产生IFN的杀伤性DC(IFN producing killer DC,IKDC)功能分子表达的影响。方法:以小鼠原B淋巴细胞株BaF3为基础,分别构建表达膜型IL-15的BaF3-mb15细胞和表达RAE1ε的BaF3-RAE细胞及同时表达膜型IL-15和RAE1ε的BaF3-mb15-RAE细胞。通过体外细胞因子诱导产生骨髓来源的小鼠成熟DC,将丝裂霉素灭活后的3株BaF3工程细胞株作为刺激细胞,分别与DC共培养,流式细胞术检测其对DC中CD11clowB220+NK1.1+IKDC比例和DC表面CD40、CD80表达的影响。流式细胞术分选DC中的IKDC,将丝裂霉素灭活后的3株BaF3工程细胞株与其共培养24 h,流式细胞术检测共培养对IKDC表面CD40、CD80、CD86、NKG2D、MHCⅡ类分子、CD107a和FasL表达的影响。结果:成功获得骨髓来源的小鼠成熟DC。与BaF3-mb15细胞和BaF3-RAE细胞相比,BaF3-mb15-RAE细胞刺激显著提高DC中IKDC比例[(50.0±5.6)%vs(30.3±8.2)%、(36.0±4.6)%,均P<0.05],并且有效刺激IKDC表面CD40(180.1±28.2 vs 44.7±7.8、36.0±3.1,P<0.01)和FasL(P<0.05)表达上调;与BaF3细胞和BaF3-mb15细胞相比,BaF3-mb15-RAE细胞有效刺激IKDC表面CD80(P<0.05)表达上调,而3株BaF3工程细胞刺激均不影响DC表面CD40、CD80的表达(P>0.05);同时,3株BaF3工程细胞对IKDC表面CD86、MHCⅡ类分子、NKG2D和CD107a的表达也没有显著影响(P>0.05)。结论:RAE-1ε和膜型IL-15协同作用可促进IKDC增殖并诱导其高表达CD40和FasL。

膜表达型InsB_(15-23) H-2K^d dtSCT对NOD小鼠1型糖尿病发病的影响

目的:研究膜表达型Ins B15-23H-2Kddt SCT对NOD小鼠1型糖尿病发病率的影响。方法:用Ins B15-23mdt SCT真核表达载体皮下免疫3周龄NOD母鼠,连续监测NOD小鼠的血糖水平以判断小鼠的发病情况。通过连续切片对NOD小鼠胰岛单个核细胞浸润情况进行检测,并监测IGRP206-214特异性CTLs的变化,来阐明Ins B15-23mdt SCT分子影响1型糖尿病病程的细胞学机制。结果:Ins B15-23mdt SCT组小鼠30周龄时的发病率(9%)显著低于空质粒组(60%)和自然发病组(80%),胰岛单个核细胞浸润情况也较轻,但16和40周龄时两组小鼠外周血IGRP206-214特异性CTLs水平无差异。结论:Ins B15-23mdt SCT真核表达载体能降低NOD小鼠1型糖尿病发病率,并且这种免疫保护作用是IGRP206-214非依赖性的。

转基因细胞株BaF3-RAE1ε诱导产生的MDSC的杀伤功能及对NK细胞功能的影响

目的:探讨表达NKG2D配体视黄酸早期转录因子1ε(retinoic acid early transcript 1ε,RAE1ε)的原B细胞株BaF3诱导产生的髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)的杀伤功能及对NK细胞功能的影响。方法:以小鼠原B细胞株BaF3为基础,构建表达空质粒的BaF3-mock对照细胞和表达RAE1ε的BaF3-RAE1ε细胞。将BaF3-mock和BaF3-RAE1ε细胞分别注射小鼠后诱导产生CD11b^+Gr-1^+MDSC,磁珠分选MDSC后与NK细胞共培养后,流式细胞术检测其对NK细胞表面NKG2D和CD107a表达的影响,ELISA法检测其对NK细胞分泌IFN-γ的影响。将MDSC分别与BaF3-mock和BaF3-RAE1ε细胞共培养后,乳酸脱氢酶释放法检测其对靶细胞BaF3-mock和BaF3-RAE1ε细胞的杀伤作用。结果:与BaF3-mock细胞相比,BaF3-RAE1ε细胞诱导产生的MDSC对NK细胞表面NKG2D和CD107a的表达没有明显影响(P>0.05),对NK细胞分泌IFN-γ的水平也没有显著影响(P>0.05)。与BaF3-mock细胞相比,BaF3-RAE1ε细胞诱导产生的MDSC对靶细胞BaF3-mock和BaF3-RAE1ε的杀伤作用明显增强[(1.99±0.39)%vs(8.63±1.45)%、(5.09±0.67)%vs(17.33±0.41)%,P<0.01]。[(1.20±0.09)%vs(10.31±0.69)%、(5.52±1.64)%vs(18.91±3.04)%,P<0.01]。结论:RAE-1ε增强MDSC对靶细胞的杀伤功能。

日本血吸虫可溶性虫卵抗原对B细胞的活化作用及其机制的初步研究

目的:观察日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)是否能够诱导小鼠B细胞活化及其机制。方法:SEA和脂多糖(LPS)分别体外刺激小鼠脾脏CD19+B细胞,72 h后用流式细胞术分别检测B细胞表面CD80、CD86及CD40的表达和B细胞细胞周期的改变;用荧光染料CFSE分裂法检测B细胞增殖;用ELISA法检测培养上清中白介素(IL-)10、IL-6、γ干扰素(IFN-γ)和转化生长因子β(TGF-β)的水平。同时利用ERK、JNK、p38MAPK和NF-κB信号转导抑制剂检测B细胞分泌细胞因子水平的变化。结果:SEA与LPS组可以活化小鼠脾脏CD19+B细胞,使其表面高表达CD80、CD86和CD40;同时诱导S/G2期的B细胞比例显著增加,SEA可以诱导B细胞增殖。SEA与LPS能刺激脾脏CD19+B细胞分泌高水平的IL-10、IL-6。分别阻断NF-κB、ERK、JNK和p38MAPK信号转导通路后可以抑制B细胞IL-10和IL-6的分泌。结论:SEA可以上调小鼠脾脏B细胞表面共刺激分子表达、促进其增殖。同时,SEA可以通过NF-κB、ERK、JNK和p38MAPK信号转导通路刺激小鼠B细胞分泌细胞因子。

共表达膜型IL-15和RAE的细胞克隆的筛选和鉴定

目的筛选能够共表达膜型IL-15和RAE的细胞株,为扩增和活化特定免疫细胞提供有效的实验工具。方法前期工作中已通过潮霉素筛选获得共表达膜型IL-15和RAE的BaF3细胞,但阳性细胞所占的比例较低。本实验通过有限稀释法先筛选高表达RAE的单克隆细胞株,再筛选高表达膜型IL-15的单克隆细胞株,最终获得了1株共表达膜型IL-15和RAE的单细胞克隆。将该细胞株与NK细胞共培养后,通过IFN-γ的分泌验证其生物学活性。结果流式细胞仪证实该细胞株能够高水平共表达膜型IL-15和RAE。并具有很强的活化NK细胞的效应。结论成功地制备了共表达膜型IL-15和RAE的单克隆细胞株,为活化特定免疫细胞,如IKDC和NK细胞提供实验工具。

分泌IFN-γ的杀伤性树突状细胞的体外诱导培养及鉴定

目的从体外诱导的骨髓来源的树突状细胞(dendritic cells,DC)中分离分泌IFN-γ的杀伤性树突状细胞(IFN-γproducing killer dendritic cells,IKDC).方法取C57BL/6小鼠骨髓细胞,以小鼠重组GM-CSF和IL-4协同诱导下培养.培养第6天,加LPS刺激.培养第7天,收集细胞,通过流式细胞仪(flowcytometer,FCM)分选出CD11clowB220+NK1.1+的细胞,FCM进一步鉴定其表型.并将其与肿瘤细胞系B16F10共培养24 h后,CBA(cytometric bead array)法检测共培养上清中IFN-γ的分泌水平.结果体外培养的骨髓来源的DC中,FCM检测存在CD11clowB220+NK1.1+的细胞,进一步鉴定发现其高表达CD49b,低表达MHC II类分子,不表达Gr-1分子;并且与肿瘤细胞B16F10共培养后可分泌大量IFN-γ.结论通过FCM分选的方法可从体外培养的骨髓来源的DC中获得IKDC.

利用雌激素构建小鼠淋病奈瑟菌感染模型

目的探讨用雌激素构建淋病奈瑟菌感染小鼠模型的方法。方法淋病奈瑟菌WHO-A接种经皮下注射苯甲酸雌二醇和真皮下埋植尼尔雌醇片(雌三醇)预处理的雌性ICR小鼠,小鼠阴道拭子接种T-M选择培养基培养分离淋病奈瑟菌,取小鼠阴道分泌物涂片染色观察淋病奈瑟菌感染情况,比较两种雌激素对小鼠淋病奈瑟菌感染的差异。结果与对照组相比,苯甲酸雌二醇小鼠体内淋病奈瑟菌有短时间的定植,而尼尔雌醇组与对照组无差异。结论雌激素(尤其是雌二醇)有利于淋病奈瑟菌在小鼠阴道内的定植。

从黑色素瘤荷瘤小鼠中分离纯化髓系抑制性细胞

目的从黑色素瘤荷瘤小鼠脾脏中分离得到CD11b+Gr-1+的髓系抑制性细胞(Myeloid derived suppressor cells,MDSCs)。方法给C57BL/6小鼠注射LPS或者小鼠黑色素瘤细胞株B16BL6后,取小鼠的脾脏细胞,检测其中CD11b+Gr-1+的MDSCs细胞的比例。通过流式细胞仪(flow cytometry,FCM)分选出CD11b+Gr-1+的细胞,培养24小时后,CBA(cytometric bead array)法检测其分泌IL-10的情况;提取CD11b+Gr-1+细胞的总RNA,利用RT-PCR的方法检测其表达IFN-β、TGF-β、iNOS、ARG-1和IDO的情况。结果与注射LPS相比,注射B16BL6细胞株的小鼠脾脏中CD11b+Gr-1+的MDSCs细胞的比例更高;利用FCM分选得到CD11b+Gr-1+的MDSCs,进一步鉴定发现其表达IL-10、IFN-β、TGF-β、iNOS、ARG-1和IDO。与先前报道的MDSCs的特征相一致。结论可从B16BL6荷瘤小鼠脾脏中获得高纯度的MDSCs用于实验研究。