miR-27a通过TLR4/NF-κB信号通路对类风湿关节炎滑膜细胞生物学行为的影响

目的:探讨miR-27a通过Toll样受体(TLR)4/NF-κB信号通路对类风湿关节炎(RA)滑膜细胞生物学行为的影响。方法:选择行膝关节置换术的30例RA患者(RA组)和同期因创伤急诊截肢的18例患者(对照组)的滑膜组织,采用qRT-PCR法检测miR-27a的表达。将RA成纤维样滑膜细胞MH7A分为4组:空白对照组,不进行任何处理;TNF-α组,加入终浓度为20μg/L的TNF-α处理24 h;TNF-α+miR-NC组,加入终浓度为20μg/L的TNF-α处理后转染miR-NC;TNF-α+miR-27a mimic组,加入终浓度为20μg/L的TNF-α处理后转染miR-27a mimic,采用qRT-PCR法检测组织或细胞中miR-27a的表达量,CCK-8法检测细胞增殖情况,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡情况,双荧光素酶报告实验验证TLR4 mRNA与miR-27a的靶向关系,Western blot法检测细胞中TLR4、NF-κB、磷酸化TLR4(p-TLR4)和磷酸化NF-κB(p-NF-κB)蛋白的表达情况。结果:对照组和RA组滑膜组织中miR-27a的表达量分别为(1.00±0.08)和(0.36±0.05),RA组低于对照组(P<0.001)。与空白对照组比较,TNF-α组和TNF-α+miR-NC组细胞中miR-27a表达量下降,TNF-α+miR-27a mimic组miR-27a表达量升高;与TNF-α组和TNF-α+miR-NC组比较,TNF-α+miR-27a mimic组细胞中miR-27a表达量升高(P<0.05)。与空白对照组比较,TNF-α组和TNF-α+miR-NC组细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力增强,细胞凋亡率降低;与TNF-α组和TNF-α+miR-NC组比较,TNF-α+miR-27a mimic组细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力减弱,细胞凋亡率升高(P<0.05)。双荧光素酶报告实验证实TLR4是miR-27a的靶基因。与空白对照组比较,TNF-α组和TNF-α+miR-NC组p-TLR4/TLR4、p-NF-κB/NF-κB升高;与TNF-α组和TNF-α+miR-NC组比较,TNF-α+miR-27a mimics组p-TLR4/TLR4、p-NF-κB/NF-κB降低(P<0.05)。结论:miR-27a可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,降低RA成纤维样滑膜细胞的增殖、侵袭和迁移能力,促进其凋亡。

miR-708-5p对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡、炎症因子分泌和TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的:探讨miR-708-5p对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡、炎性因子分泌的调控机制。方法:将体外培养的人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞MH7A分为对照组(未处理)、miR-NC组(转染miR-NC)和miR-708-5p组(转染miR-708-5p模拟物)。采用qRT-PCR法检测转染48 h后各组细胞中miR-708-5p的表达,CCK-8法检测各组细胞存活率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,ELISA法检测细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量,Western blot法检测细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Toll样受体4(TLR4)、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白的表达。结果:与对照组相比,miR-708-5p组细胞中miR-708-5p的表达水平、细胞凋亡率和Bax、Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平均升高,而细胞存活率、细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量以及TLR4、p-NF-κB p65蛋白的表达水平均降低(P<0.05)。结论:miR-708-5p可诱导类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡并减轻细胞炎症损伤,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路的活化有关。

艾拉莫德对类风湿关节炎滑膜细胞凋亡及炎症因子水平的影响

目的:研究艾拉莫德对类风湿关节炎滑膜细胞凋亡及炎症因子水平的影响。方法:分离培养类风湿关节炎滑膜细胞,给予0、600、1200、1800μg/L的艾拉莫德处理后,采用Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞凋亡,ELISA法检测培养液中IL-1β、TNF-α含量,Western blot法测定活化的Caspase-3(C-Caspase-3)、Bcl-XL、NF-κBp65蛋白和胞质、线粒体细胞色素C蛋白的表达。结果:不同剂量艾拉莫德处理后,滑膜细胞凋亡率升高,培养液中IL-1β、TNF-α含量下降;胞质细胞色素C蛋白表达水平升高,线粒体细胞色素C蛋白表达水平下降;细胞中C-Caspase-3蛋白表达水平升高,Bcl-XL、NF-κBp65蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论:艾拉莫德可能通过抑制NF-κB诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡,减少炎症因子分泌。

调控类风湿关节炎PBMC中miR-142-3p的表达对ADAM17表达及成纤维样滑膜细胞活性的影响

目的:探讨类风湿关节炎(RA)外周血单个核细胞(PBMC)中微小RNA-142-3p(miR-142-3p)的表达对RA成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖和凋亡的影响。方法:采用生物信息学预测和双荧光素酶报告实验分析miR-142-3p和解聚素金属蛋白酶17(ADAM17)的靶向关系。分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测人正常PBMC和RA-PBMC中miR-142-3p和ADAM17蛋白的表达。利用miR-142-3p模拟物或抑制物转染调控RA-PBMC中miR-142-3p的表达,观察低表达miR-142-3p,及过表达ADAM17和miR-142-3p的RA-PBMC对RA-FLS增殖和凋亡的影响。RA-FLS增殖的检测采用MTT法,RA-FLS凋亡的检测采用Annexin V-FITC和PI双染法。结果:ADAM17和miR-142-3p存在靶向关系。与正常PBMC相比,RA-PBMC中miR-142-3p表达上调,ADAM17蛋白表达下调(P<0.05)。低表达miR-142-3p的RA-PBMC和过表达ADAM17的RA-PBMC均可增强RA-FLS增殖活性,减少其凋亡(P<0.05)。过表达miR-142-3p的RA-PBMC可降低RA-FLS的增殖活性,促进其凋亡(P<0.05)。过表达ADAM17和过表达miR-142-3p的作用可以相互拮抗(P<0.05)。结论:调控RA-PBMC中miR-142-3p的表达可以通过调控ADAM17而影响RA-FLS的增殖和凋亡。

miR-26a-5p通过JAK2/STAT3信号通路对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响

目的:探讨miR-26a-5p对人类风湿关节炎(RA)-成纤维样滑膜细胞(FLSs)凋亡及炎性因子分泌的影响,阐明其作用机制。方法:分离RA患者的膝关节滑膜组织RA-FLSs,将miR-26a-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及阴性对照转染RA-FLSs,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测转染效果,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养液中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6 (IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,CCK-8法检测各组细胞增殖活性,AnnexinⅤ-FITC/PI与Hoechst 33342染色检测各组细胞凋亡情况,Western blotting法检测各组细胞中凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2 (Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)与酪氨酸激酶2 (JAK2)/信号传导及转录活化因子3 (STAT3)信号通路相关蛋白表达水平。结果:与空白对照组和NC-mimic组比较,miR-26a-5p mimic组RA-FLSs中miR-26a-5p mRNA表达水平升高(P<0.05),RA-FLSs增殖活性降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中Bcl-2、 JAK2、 p-JAK2、 STAT3和p-STAT3蛋白表达水平降低(P<0.05),Bax蛋白表达水平升高(P<0.05);与空白对照组和NC-inhibitor组比较,miR-26a-5p inhibitor组RA-FLSs中miR-26a-5p mRNA表达水平降低(P<0.05), RA-FLSs细胞增殖活性升高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05), Bcl-2、 JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平升高(P<0.05), Bax蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:过表达miR-26a-5p能够抑制RA-FLSs细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路的激活有关。

miR-122-5p对类风湿关节炎滑膜细胞增殖与凋亡的影响及其机制

目的 研究miR-122-5p对类风湿关节炎(RA)滑膜细胞增殖、凋亡的影响及其机制。方法 运用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分别检测正常关节滑膜细胞、RA滑膜细胞中miR-122-5p以及盘状结构域受体激酶(DDR2)的表达。实验分为阴性对照(miR-NC)组(转染mimic NC序列)、miR-122-5p寡核苷酸模拟物(miR-122-5p)组(转染miR-122-5p模拟物mimics)、miR-122-5p特异性寡核苷酸抑制剂阴性对照(anti-miR-NC)组、miR-122-5p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-122-5p)组、miR-122-5p+pcDNA组(共转染miR-122-5p mimics和空载体(pcDNA))、miR-122-5p+pcDNA-DDR2组(共转染miR-122-5p mimics和DDR2过表达载体(pcDNA-DDR2)),用脂质体法转染至RA滑膜细胞。采用Western blot方法检测细胞中DDR2、P21和Survival的蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞中miR-122-5p与DDR2的结合力。结果 与正常滑膜细胞相比较,RA滑膜细胞中miR-122-5p的表达显著降低,DDR2的表达显著升高(t=27.714~48.853,P<0.001)。过表达miR-122-5p可抑制RA滑膜细胞增殖,促进其凋亡(t=16.716~121.500,P<0.001)。miR-122-5p可抑制野生型DDR2细胞的荧光活性。过表达DDR2可以逆转miR-122-5p对RA滑膜细胞的增殖抑制和凋亡促进作用(t=106.335~327.990,P<0.001)。结论 miR-122-5p可抑制RA滑膜细胞的增殖,促进其凋亡,其机制可能与靶向DDR2有关。