转录组测序分析细粒棘球绦虫原头蚴刺激后巨噬细胞Raw264.7 lncRNA表达的研究

为了解巨噬细胞Raw264.7在应对细粒棘球绦虫原头蚴(PSC)刺激时其长链非编码RNA(lncRNA)的差异表达规律,本研究采用Illumina Hiseq 3000高通量RNA sequencing测序技术对PSC处理以及PBS处理的Raw264.7细胞进行lncRNA测序和生物信息学分析后,进一步采用GO和KEGG数据库分别对差异表达的lncRNAs进行富集分析。结果显示,和PBS对照组相比,PSC处理组有60个lncRNA分子的表达出现显著差异变化,其中17个表达上调,43个表达下调。GO分析结果显示,差异表达的lncRNA分子的靶基因主要与钠离子跨膜转运体活性调节,2型免疫反应正向调节以及自然杀伤细胞凝集素样受体结合等相关;KEGG分析结果显示,差异表达的lncRNA分子的靶基因主要参与VEGF信号、Toll样受体信号通路、NOD样受体等信号通路。本研究进一步分析了与Raw264.7细胞固有免疫相关的lncRNA分子,结果发现有11个模式识别受体(PRR)相关的lncRNA分子。随机选取6个差异表达的lncRNA分子进行了qRT-PCR验证,结果显示其表达趋势与lncRNA测序结果一致。本研究首次系统解析了巨噬细胞Raw264.7应对PSC刺激时其lncRNA的差异表达谱特性,为进一步解析lncRNA在巨噬细胞Raw264.7应对PSC刺激时的免疫调控机制奠定了基础。

绵羊血清蛋白双向凝胶电泳技术的建立

【目的】建立和优化绵羊血清蛋白双向电泳体系(2-DE)。【方法】从样品提取及处理、IPG胶条的选择、SDS-PAGE浓度的选择等多个方面对双向电泳分离条件进行比较。【结果】采用10%TCA/丙酮沉淀法处理血清蛋白质,18 cm p H 4~7的IPG胶条2.5 mg上样量,10%SDS-PAGE,获得的2-DE图谱效果较好。【结论】获得良好的绵羊血清蛋白双向电泳图谱,建立并优化了绵羊蛋白质组学的双向电泳技术体系,为转基因绵羊生物安全性评价提供了重要的技术条件。

绵羊Fsp27基因5'-UTR区碱基突变与尾脂沉积能力的关联性

【目的】明确绵羊脂肪特异蛋白27基因(Fsp27)5'端非编码区(5'-UTR)g.16767527位点和g.16767779-16767780位点突变与其尾脂沉积能力的关联性,为低脂肪绵羊品种选育提供理想的分子标记,提高低脂肪绵羊品种改良选育效率。【方法】以5个不同尾脂沉积能力的绵羊品种为研究对象,包括脂尾型绵羊品种阿勒泰羊,短脂尾型绵羊品种小尾寒羊和湖羊,长瘦尾型绵羊品种中国美利奴细毛羊和萨福克羊,采用PCR-SSCP结合基因测序对绵羊Fsp27基因5'-UTR区碱基突变情况进行检测,并分析相关突变与绵羊尾脂沉积能力的关联性。【结果】绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点为C/A突变,在所检测的绵羊群体中均存在3种基因型(CC、CA和AA),但在不同尾脂沉积能力绵羊品种群体中的基因型频率存在明显差异:阿勒泰羊群体中以CC基因型为主,基因型频率为0.869;小尾寒羊和湖羊群体中以CA基因型为主,基因型频率分别为0.698和0.628;中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体则以AA基因型为主,基因型频率分别为0.616和0.833。g.16767527位点的基因型分布在阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(PHWE<0.01),在萨福克羊群体中显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(PHWE<0.05)。g.16767779-16767780位点为双碱基突变,对应为GG/GG、GG/TC和TC/TC基因型;在尾脂沉积能力强的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中,g.16767779-16767780位点以TC为优势等位基因,对应的等位基因频率分别为0.862、0.954和0.927;在尾脂沉积能力差的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中则以GG等位基因为主,其等位基因频率分别为0.980和0.983。这2个位点的突变均对绵羊Fsp27基因5'-UTR区二级结构产生明显影响。【结论】绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点的C/A突变和g.16767779-16767780位点的GG/TC突变与其尾脂沉积能力密切相关,可作为分子标记应用于低脂肪绵羊品种的辅助选育。

绵羊iPS细胞诱导及转录组学分析

【目的】建立绵羊(Ovis aries)诱导性多能干细胞系,为绵羊转基因育种、应用绵羊诱导性多能干细胞奠定基础。【方法】利用电转将OCT4、SOX2、KLF4、l-Myc、Lin28转染至绵羊成纤维细胞中并诱导培养至有光滑隆起、边缘整齐的细胞克隆,形态学、碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光染色以及实时荧光定量PCR检测克隆细胞的生物学特性;利用高通量测序技术对诱导0、10、20、30 d的阳性细胞的差异表达基因进行筛选。【结果】克隆细胞中SOX2、OCT4、SSEA-1蛋白免疫荧光染色均呈阳性; OCT4、SOX2、Nanog基因表达量均极显著高于成纤维细胞;0和30 d转录组测序表明,被注释到GO数据库的差异表达基因有9 465个,其中,上调基因6 987个,下调基因2 478个;KEGG分析共有5 773个基因注释到259个通路中,其中,P53信号通路显著富集,且其在干细胞增殖方面起着非常重要的作用。【结论】初步成功建立了绵羊诱导性多能干细胞。

新疆小海子垦区牛梨形虫感染情况的调查

为调查新疆小海子垦区牛梨形虫感染情况,采用PCR对垦区9个采样点共568份牛全血样本进行检测,扩增牛梨形虫18S rRNA基因部分序列并测序,经比对确定虫种,构建系统发育树。结果显示,共检测出44份阳性样品,总阳性率为7.75%,其中45团的牛感染率较高,约14.58%,叶城牧场与53团的牛感染率较低,均在5%以下,46团的牛未发现梨形虫。在44份阳性样品中,发现42份环形泰勒虫(Theileria annulata),2份感染东方泰勒虫(T.orientalis),未发现巴贝斯虫感染。此次对于新疆小海子垦区牛梨形虫的感染情况和感染虫种进行了调查,提供了一线数据,为小海子垦区牛梨形虫病的综合防控提供了技术支撑。

多胎萨福克与阿勒泰羊杂交F1羔羊生长性能研究

【目的】多胎萨福克具有良好的生长发育和产肉性能,本研究分析了多胎萨福克为父本和阿勒泰羊为母本的杂交F1羔羊生长发育情况,为开展合理的杂交利用提供依据。【方法】测定羔羊从出生到断奶前的体重数据,分析羔羊的生长发育情况。【结果】结果显示:(1)产羔数与多胎萨福克羔羊初生重相关,羔羊初生重随产羔数的增加而降低;(2)萨阿杂交F1羔羊初生重显著高于多胎萨福克羔羊(P<0.01),杂交优势明显;(3)在萨阿杂交F1羔羊群体上初步建立的羔羊生长发育评测指数表现出一定的正态分布特点,且不同性别指数的分布范围略有不同。【结论】多胎萨福克羊与阿勒泰羊中的杂交效果明显,杂交羔羊的初生重和断奶前日增重都有显著提高。

优质绵羊冷冻胚胎引进及胚胎移植试验

2014—2015年先后从澳大利亚西奥谷河育种公司引进萨福克和肉用美利奴肉羊冷冻胚胎773枚。解冻后可用于移植的胚胎为739枚,移植受体羊739只。其中,A级胚胎553枚,B级胚胎186枚,且A级胚胎移植受胎率为50.27%(278/553),明显高于B级胚胎的39.25%(73/186),差异显著。同时,对比了大尾羊和细毛羊2种受体羊品种间的受胎率,结果为差异不显著。不同饲养条件下胚胎移植受胎率结果显示,全舍饲羊受胎率为39.56%(178/450),放牧羊受胎率为49.48%(143/289),两者差异显著。大规模进口肉羊冷冻胚胎进行移植在基层生产单位的成功应用,为肉羊产业发展提供了优良的种质资源。

高产奶牛产后护理关键节点控制及对受胎率的影响

本试验旨在研究奶牛产后子宫复旧的生理变化规律,制定出一套产后护理技术程序,能够促进产后奶牛子宫复旧,缩短产后复旧时间和产犊间隔,提高高产奶牛的受胎率。本试验共分为4组,分别为奶牛产后监护组与自然恢复组、无抗治疗组与PGF2α治疗组、繁殖障碍监护组与对照组、妊娠检测直肠把握组与B超组。结果表明:(1)奶牛产后监护组的淘汰率显著低于自然恢复组,而妊娠率明显高于自然恢复组,且差异显著(P<0.05);(2)因乳品抗生素残留的存在,试验中采用了无抗组和激素处理组,产后奶牛的两种处理方法均取得较为理想的效果,但是两组之间的差异不显著(P>0.05);(3)将产后奶牛护理程序应用到大群试验中,监护群的受胎率为90.8%,极显著高于对照群(P<0.05)。(4)分别对复旧后的奶牛进行配种,在配种后30d和45d,采用B超法和直肠把握法进行妊娠检测,在30d时,两种妊娠检测方法差异显著(P<0.05),在45d时,两种妊娠检测方法之间没有差异性,都可以达到100%的妊娠检测准确性。综上所述,在本试验条件下,在奶牛产后的关键时间节点进行护理是十分必要的,可以达到早配种、早妊娠、缩短产犊间隔,增加高产奶牛养殖的经济效益和生态效益。

牛源A型多杀性巴氏杆菌(Pm12)灭活疫苗的制备及小鼠攻毒保护试验

为了防控新疆北疆A型多杀性巴氏杆菌(Pm)引起的牛纤维素性化脓性肺炎,分析制备的A型Pm12灭活疫苗在试验小鼠体内抗体产生情况和保护作用,试验按细菌灭活疫苗制备程序将分离筛选自新疆北疆部分地区发病牛场的1株毒性强、免疫原性好的牛源A型Pm12制备成灭活疫苗,并进行安全检验。根据棋盘法对全菌抗原包被浓度、封闭液、血清稀释度、酶标二抗工作浓度、封闭时间、一抗孵育时间、二抗孵育时间及底物反应时间等检测条件进行筛选,建立检测小鼠血清抗体的间接ELISA方法,用建立的间接ELISA方法测定免疫小鼠血清抗体产生规律,对免疫小鼠以不同半数致死量(LD50)的Pm12进行攻毒保护试验,同时用A型和B型Pm对免疫小鼠进行交叉保护试验。结果表明:制备的牛源A型Pm12灭活疫苗含菌量为8×109cfu/mL,安全检测合格。根据棋盘法确定全菌抗原包被浓度为1∶25,最佳血清稀释度为1∶320~1∶640,最适封闭液为5%BSA,最适封闭时间为1 h,血清最适作用时间为1 h,酶标抗体最适稀释度为1∶3 000,底物最适作用时间为15 min;用制备的疫苗免疫小鼠后,60天的血清抗体效价均高于28天水平;Pm12灭活苗对不同LD50攻毒小鼠的保护率为80%、80%、50%,对A型Pm保护率为80%,对B型Pm的交叉保护率为60%。说明可用试验建立的方法检测小鼠血清抗体水平,制备的牛源A型Pm12灭活疫苗能够诱导小鼠产生较高水平且持续较长时间的血清抗体,能够有效保护小鼠对抗A型Pm感染,且对B型Pm呈现部分交叉保护作用。

NAC通过调控活性氧影响脂肪间充质干细胞增殖和分化

【目的】细胞在体外培养过程中易受氧化应激,细胞内活性氧水平升高,影响细胞功能。通过探究N-乙酰-L半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)对猪脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)活性氧的调控作用,进一步明确对其增殖和分化的影响,为培养脂肪种子细胞体外大量扩增和提高分化效率提供理论基础和参考依据。【方法】为建立ADSCs体外培养氧化应激模型,在ADSCs增殖过程中加入不同浓度的H_(2)O_(2)(0、25、50、100μmol·L^(-1)),通过细胞计数结果、细胞形态、细胞活力、高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测细胞内活性氧水平,确定H_(2)O_(2)的添加浓度。为了筛选NAC促进ADSCs增殖的最佳添加浓度,在ADSCs增殖过程中加入不同浓度的NAC(0、1、2、3 mmol·L^(-1)),通过细胞计数结果和细胞形态,确定NAC的适宜添加浓度。通过EdU染色和细胞计数分析不同处理条件下(Control、1 mmol·L^(-1)NAC、50μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)、1 mmol·L^(-1)NAC+50μmol·L^(-1)H_(2)O_(2))的细胞增殖情况,为进一步探究NAC对氧化应激的ADSCs增殖的影响。为探究不同处理条件下ADSCs内活性氧的水平,对不同处理条件下增殖3 d后的ADSCs进行CellRox染色,通过高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测细胞内活性氧水平,明确ADSCs增殖与细胞内活性氧水平的关系。为探究ADSCs内活性氧水平对其分化的影响,ADSCs在不同处理条件下分化10 d,对其进行油红O染色,Image J分析染色面积评估ADSCs的分化脂质积累量并通过RT-qPCR检测ADSCs分化相关基因的相对表达量。【结果】ADSCs在增殖过程中,与对照组相比较,添加50μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)组的ADSCs呈梭形,细胞内活性氧含量显著升高(P<0.05),氧化应激模型成功建立。与对照组相比,ADSCs在增殖过程中添加50μmol·L^(-1)H_(2)O_(2),ADSCs增殖数目显著降低(P<0.05),但是在ADSCs分化过程中添加50μmol·L^(-1)H_(2)O_(2),ADSCs的脂质积累量显著升高(P<0.05)。ADSCs在增殖过程中,与对照组相比较,添加1 mmol·L^(-1)NAC组的ADSCs呈梭形,细胞内活性氧含量显著降低(P<0.05),ADSCs增殖数目显著升高(P<0.05),但是1 mmol·L^(-1)NAC的添加对ADSCs的脂质积累没有显著影响(P>0.05)。【结论】氧化应激的产生提高ADSCs中活性氧水平,不利于ADSCs体外大量扩增,诱导细胞分化,加速细胞衰老。在ADSCs体外扩增体系中添加1 mmol·L^(-1)NAC可以降低因长期培养、外源刺激等因素带来的氧化应激损伤,对氧化应激的ADSCs具有保护作用,能有效促进细胞的增殖,并且不会影响细胞的分化能力。

原代犬小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立原代犬小肠上皮细胞分离培养及纯化的方法,为犬肠道病毒性、细菌性及寄生虫相关疾病研究提供细胞材料。采用组织块培养法分离培养原代犬小肠上皮细胞,胰酶差速消化法进行纯化,利用细胞形态学、间接免疫荧光法鉴定上皮细胞特性,脂多糖(LPS)刺激原代上皮细胞,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测炎性因子转录水平,鉴定原代犬小肠上皮细胞的功能。结果显示:组织块培养法获得的原代犬小肠上皮细胞可在24 h内贴壁,第3天细胞开始增殖,第4天时达到增殖顶峰,第5~7天细胞活性逐渐降低,在体外连续传代可培养至第10代。经胰蛋白酶差速消化纯化后,获得铺路石样原代犬小肠上皮细胞,生长曲线类似“S”形,上皮细胞特异性细胞角蛋白18(CK18)鉴定呈阳性,LPS可诱导犬小肠原代上皮细胞炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的转录水平在12 h(P<0.05)、24 h(P<0.01)表达量呈显著和极显著差异。研究表明,利用组织块培养法可成功分离获得数量较多、纯度较高且具有典型上皮细胞形态和功能的犬小肠上皮细胞,获得的细胞为研究犬肠道疾病致病机理和相关研究提供了细胞模型。

石河子地区临床奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定与药敏试验

为研究新疆石河子地区某奶牛养殖场临床奶牛乳房炎的病原菌及耐药情况,对送检的15份乳样进行病原菌的分离鉴定、形态学观察、16S rRNA基因序列对比以及药物敏感性试验。结果显示,分离到1株大肠杆菌和5株金黄色葡萄球菌。菌株16S rRNA序列比对,大肠杆菌同源性大于99.9%,金黄色葡萄球菌的同源性在97.49%~99.71%之间。将两类分离菌对临床上常用的20种药物进行药物敏感性试验,结果显示金黄色葡萄球菌对17种药物敏感,对3种药作用尚不清楚;大肠杆菌对9种药物敏感,对7种药作用尚不清楚,对剩余的4种药物表现为中介。试验结果为临床治疗奶牛乳房炎的合理用药提供了理论依据。

一起羔羊腹泻病病原调查及防治

本文就一起较为典型的由大肠杆菌引起的羔羊腹泻进行了病原调查和实验室检测诊断,并通过病畜的隔离饲养,改善养殖场的卫生条件,加强饲养管理,改善和提高兽医保健水平,以及使用敏感药物针对性治疗和自家灭活疫苗预防接种等防控策略,基本控制了该病的再次发生。