新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16型E6基因突变分析

背景与目的:高危型人乳头状瘤病毒16和18(humanpapillomavirustype16and18,HPV16,HPV18)是宫颈癌主要病因之一,尤其以HPV16最为常见,其中HPV16E6是主要癌基因之一。在一些地区,特定的E6基因突变株是宫颈癌发生的危险因素。新疆南部维吾尔族聚居区是宫颈癌高发区,我们已在前期的研究中发现该地区HPV16E6基因发生突变,本研究旨在检测该突变在新疆南部维吾尔族妇女宫颈癌组织中的分布规律,并探讨其与该地区宫颈癌高发的关系。方法:从35例中国新疆南部维吾尔族妇女宫颈癌活检标本中提取组织DNA作为模板,PCR扩增HPV16E6全长基因,PCR产物直接测序或克隆后测序,分析新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16E6基因的突变。结果:PCR检测结果表明宫颈癌组织中HPV16E6阳性率为82.86%(29/35);26例中E6分离片段的测序和序列分析表明,15例(57.69%)分离株E6基因与原型相同,另有11例(42.31%)E6基因突变,其中9例(34.62%)分离株发生了L83V突变,2例(7.69%)分离株发生了L83V/D63E突变。结论:中国新疆南部地区HPV16E6基因发生变异,其原型和变异型在该地区维吾尔族宫颈癌患者中的分布规律可能与该地区宫颈癌高发存在一定关系。

新疆荒漠昆虫光滑鳖甲cDNA文库的构建及功能基因筛选

以过冬后早春的新疆荒漠拟步甲属昆虫光滑鳖甲(Anatolica Polita borealis)成虫为研究材料,应用SMARTTM cDNA Library Construction技术,通过总RNA提取,反转录合成cDNA,定向构建至噬菌体载体λTripEx2,经体外包装构建了光滑鳖甲的cDNA表达文库。测试结果表明库容量为2.2×106,重组率为84.8%。通过对cDNA文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,获得28个光滑鳖甲表达序列标签(ESTs),包括17个EST(60.7%)与NCBI中已注册的已知功能基因相似性较高,另外的11个EST(39.3%)则没有发现与之相似的序列,推测可能是功能未知的新基因。同时,利用PCR扩增文库技术从cDNA文库中克隆获得了光滑鳖甲的抗冻蛋白基因,初步表明光滑鳖甲cDNA表达文库构建的成功,为深入研究新疆荒漠昆虫的抗冻机理及发现新的昆虫功能基因奠定了基础。

昆虫抗冻蛋白的结构与生物学特性研究

抗冻蛋白(antifreeze proteins AFPs)是一类抑制冰晶生长的蛋白质,它能以非依数性形式降低溶液的冰点而对其熔点影响甚微,因而也被称作热滞蛋白。近几年来对于昆虫抗冻蛋白的研究取得了较快的发展,已有20多种昆虫抗冻蛋白被分离纯化。就昆虫抗冻蛋白的结构特征、生物学特性以及在农业、医学和食品工业等方面的应用进行介绍。

检测抗冻蛋白生物学活性两种方法的比较

为了比较两种方法测定昆虫抗冻蛋白生物学活性的优劣．通过抗冻蛋白细菌低温保护实验测定菌液OD500和菌落计数两种方法同时研究洛氏脊漠甲抗冻蛋白对大肠杆菌的低温保护效果，实验表明发现这两种方法所得结果相近，相关系数r=0.82～1．0，相关性显著（p〈0．05）．菌落计数法的误差小NOD值法，适用于菌落数少的情况，OD值法适用于菌落密度大的情况，两种方法都可用于研究抗冻蛋白低温保护活性.

新疆妇女宫颈脱落细胞HPV16E6基因的PCR及荧光定量PCR检测

目的 了解新疆妇女人乳头瘤病毒 16型 (HPV 16)的感染状况。方法 用PCR及荧光定量PCR(FQ -PCR)方法检测妇科门诊普通患者宫颈脱落细胞及分泌物中人乳头瘤病毒 16型E6基因 (HPV16E6) ,以普通门诊患者宫颈脱落细胞及分泌物DNA作为样本 ,以人乳头瘤病毒 (HPV16E6)作为扩增的靶基因 ,同时以人 β -actin基因片段作为细胞内参照 ,借助于两对引物 ,两个特异的荧光探针 ,用荧光定量PCR(FQ -PCR)方法对这两个片段进行扩增 ,得到单位细胞HPV16E6的相对含量 ;同时进行定性PCR检测。结果 宫颈脱落细胞标本 15 9例中 ,β -actin阳性 15 4例 ;HPV 16E6阳性共 12例 ,阳性率为 7.8%。PCR与FQ -PCR结果基本一致 ,但FQ -PCR更敏感。结论 建立的FQ -PCR检测宫颈脱落细胞内HPV 16E6基因的方法 ,能反映单位细胞内病毒的复制情况 ,可用于性传播感染 (STI)

新疆家蚕抗菌肽Cecropin-XJ与细菌DNA相互作用的光谱研究

抗菌肽的抗菌机理研究主要集中在抗菌肽与细菌细胞膜作用方面,抗菌肽是否与细菌的染色体DNA作用尚不清楚。为了探讨新疆家蚕抗菌肽Cecropin-XJ抗细菌的作用机理,利用紫外光谱及以溴化乙锭(EthidiumBromide,EB)为荧光探针的荧光光谱方法研究抗菌肽Cecropin-XJ与金黄色葡萄球菌DNA在体外的相互作用,计算获得抗菌肽与DNA的结合常数和成键位点数。结果显示,抗菌肽使DNA发生了明显的增色效应,并使DNA的荧光强度增强,抗菌肽能与EB竞争性的结合DNA,表明抗菌肽可能与DNA双螺旋的沟槽结合;在抗菌肽存在下,DNA与EB作用的结合常数和成键位点数都发生变化,表明抗菌肽以嵌入和非嵌入两种方式与DNA相互作用。文章从分子水平上初步阐述了抗菌肽与细菌DNA的作用模式和结构特征,为深入研究抗菌肽的作用机理奠定了基础。

新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的:利用酵母Pichia pastoris 蛋白表达系统,表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。方法:根据新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白(MPAFP5)基因序列设计引物,并分别在5’引物和3’引物中引入了EcoRI和SalI酶切位点,经PCR扩增MPAFP5基因成熟肽序列后与pGEX4T-1载体相连,再将MPAFP5从pGEX4T-1 载体上切下亚克隆至穿梭质粒pGAPZαA上,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA-MPAFP5,经线性化后采用电转化法将重组穿梭质粒转入酵母细胞SMD1168内,Zeocin+筛选鉴定重组子,小瓶发酵后取上清作SDS-PAGE检测,并用Western-blot检测表达蛋白的正确性。结果:MPAFP5成功地在酵母表达系统获得表达,Western-blot检测表明表达产物为准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。结论:酵母表达系统能够高效表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白,为高密度发酵大量生产抗冻蛋白奠定了基础。

新疆灰绿藜花粉发育的显微观察

灰绿藜（Chenopodium glaucumL．）种子萌发后于温室（25℃）下培养30d左右，随机取300朵不同发育阶段的花蕾测量其大小（对生花被的最大距离）及花药大小（2个花粉囊的最大距离）。花粉取自不同发育阶段的花，经终浓度为2μg·mL^-1的与DNA强力结合的荧光染料4’，

盐生植物盐爪爪甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及在盐胁迫下的BADH基因的表达

根据已发表的几种藜科植物甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的同源保守区设计了一对引物,采用RT-PCR方法从盐生植物盐爪爪(Kalidium foliatum)中扩增出BADH基因的1个开放阅读框架,其核苷酸序列长1503bp,推测的氨基酸序列全长为500个氨基酸残基。核苷酸序列与藜科几种盐生植物如滨藜、碱蓬、菠菜、山菠菜和甜菜等的同源性为81%,与甜土植物水稻的同源性为69%。氨基酸序列与以上两类植物(盐生植物和甜土植物)的同源性比对为80%和71%,说明BADH基因在藜科盐生植物中是一种较高保守的基因。BADH基因编码的多肽在高等植物中行使重要的功能。用不同浓度的NaCl胁迫处理盐爪爪植株,BADHmRNA的表达水平比对照植株高,说明盐爪爪BADH基因的表达受盐诱导,间接说明甜菜碱醛脱氢酶催化合成的甜菜碱作为渗透调节的小分子物质,它的积累与盐胁迫存在紧密关联,本研究为进一步从生理和分子水平阐明盐爪爪的耐盐机制提供一定的参考。

盐渍化土壤改良利用新方法——植物耐盐基因的遗传转化

土壤盐碱化是目前全球最严重的环境问题之一,包括人口膨胀在内的各方面因素使人类不断开发和利用大面积的土地,逐渐生成新的次生盐渍化,加速了土壤盐碱化的进程。通过农业生物技术培育耐盐植物品种或开发利用有经济价值的盐生植物资源以改良土壤已成为研究热点。文中综述了植物耐(抗)盐碱逆境胁迫的相关基因和外源基因遗传转化的方法,并对现今生物耐(抗)盐碱逆境胁迫的基因转化研究进行了展望。

红花基因组DNA的提取及RAPD体系的优化

用多种方法提取红花老叶及嫩叶DNA,进行比较,最后确定老叶DNA的提取用高盐低pH法,嫩叶用Michael等的方法。设计两次正交实验来确定红花RAPD体系中各成分的浓度,最终确定了一个既稳定又能扩增出最多条带的适合红花的RAPD最优体系,即25μL反应液中,dNTP200μM,Mg2+1.5mM,引物0.8μM,Taq酶1U,模板30～60ng。

地高辛标记探针Southern印迹杂交技术要点及改进

Southern印迹杂交技术是检测特定DNA片段的常规方法之一,其操作程序繁琐,对基因组DNA的提取、纯化、酶切等均有较高要求,要获得理想杂交结果需要反复摸索。总结地高辛标记探针Southern印迹杂交的技术要点,并结合具体操作提出改良方案。

胡杨Na^+/H^+反向运输载体(PeNHX2)基因的克隆与序列分析

植物液泡膜上Na+/H+反向运输载体(Na+/H+antiporterNHX)已被证明在盐胁迫中发挥关键作用,该研究旨在从胡杨中克隆获得耐盐相关的的完整cDNA序列,为进一步比较胡杨的耐盐基因的差异,探讨胡杨的耐盐分子机理奠定了基础,并为通过转基因手段提高木本植物的耐盐能力提供侯选基因。根据已发表NHX的同源基因序列,采用特异性引物扩增核心片段,并结合5’与3’RACE技术,成功地从胡杨(populus euphratica)克隆获得PeNHX2,其cDNA全长1638bp。测序和序列分析结果表明该基因与已发表毛白杨(Populus tomentosa)PtNHX基因在核酸水平及蛋白质水平上同源性均达到最高,依次为90.6%和88.25%。利用DNAMAN软件进一步分析得知,该基因与新疆盐生植物中所克隆获得的的犁苞滨藜(Atriplex dimorphostegia)AdNHX1、灰绿藜(Chenopodium glaucum)CgNHX1、盐爪爪(Kalidium foliatum)KfNHX同源性也较高,核酸水平上依次为75.1%、74.8%、74.3%,蛋白质水平依次为78.3%、79.0%、78.3%。PeNHX2与NCBI已注册的部分PeNHX1序列,在核酸或蛋白质水平同源性(72.34%和73.72%)均较低,分析它们可能同属于胡杨NHX基因家族,相关生物学功能有待于进一步研究。

单引物方法克隆盐角草orf25基因

采用单引物RT PCR扩增的方法 ,从新疆野生植物盐角草 (Salicorniaeuropaea)中克隆获得了 1.7kb的cDNA片段 ,经过测序和序列分析 ,发现基因片段包含了orf2 5基因完整的读码框架。采用序列同源性分析方法 ,结果显示新疆盐角草orf2 5基因与甜菜线粒体同源性高达 98% ,与烟草线粒体同源性达到 95 % ,与小麦同源性为 92 % ,与玉米同源性为 88% ,表明orf2 5基因在植物中是高度保守的一种基因 ,同时说明野生植物盐角草中也存在与农作物相似的雄性不育相关基因 ,orf2 5基因编码的功能性蛋白可能在影响植物雄性不育改良作物品种方面具有重要的意义。

农杆菌介导SsNHX基因转化中林美荷杨的研究

方法:以中林美荷杨组培苗的茎段为转化受体,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将盐地碱蓬(Suaedaheteroptera)的Na+/H+反向运输体基因SsNHX导入中林美荷杨组培苗中,实验过程中对影响遗传转化的一些关键因素进行了筛选研究。结果:最佳浸染条件为茎段外植体预培养1d,菌液浓度OD6000.3,浸染时间15-30min,共培养时添加AS 200μmol/L。经过抗性植株的PCR检测证明外源基因SsNHX已整合到中林美荷杨基因组中,获得了抗卡那霉素的再生植株及PCR阳性植株。结论:初步建立了中林美荷杨的遗传转化体系,为其遗传转化培育出抗盐碱的转基因植株奠定了理论基础。

草原兔尾鼠ZP3基因密码子优化及其在酵母中的表达

目的:提高草原兔尾鼠(L agurus lagurus)卵透明带3(LZP 3)基因在酵母细胞中表达的水平.方法:利用重叠PCR技术,定点突变LZP 3基因上6个稀有的密码子簇,将LZP 3基因中11个稀有的密码子更换成毕赤酵母(P ich ia Pastoris)最常用的相应密码子.将获得的LZP 3突变基因(LZP 3m)插入pGAPZαA中,构建穿梭表达载体.以重组体转化P ich ia Pastoris SM D 1168菌株进行表达.结果:LZP 3m基因的表达量比野生型LZP 3基因明显提高.结论:通过密码子优化,能显著提高LZP 3基因在酵母细胞中的表达水平.

草原兔尾鼠透明带3(lZP3)基因序列同源性比较

透明带3作为精子的初级受体是透明带的一种主要糖蛋白,而抗ZP3抗体能够阻止精卵结合.因此,ZP3被认为是避孕疫苗的候选免疫原.草原兔尾鼠是新疆的重要害鼠,将它的ZP3基因序列与GenBank上已发表的几种鼠的ZP3基因序列进行同源性比较,将有助于哺乳动物受精机理的阐明与免疫不育疫苗的设计,同时也有助于了解这些鼠在系统进化中的相对地位.

新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16型L1基因突变谱分析

目的 探讨新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒 16型L1基因的变异 ,并预测L1蛋白的功能变化。方法 从 19份中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取DNA ,以此DNA为模板 ,PCR扩增HPV16L1全长基因 ,PCR产物直接测序或克隆后测序 ,分析新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织HPV16L1基因多态性及HPV16L1蛋白功能的变化。结果PCR检测结果显示宫颈癌组织中HPV16L1阳性率为 84 2 1% (16 / 19) ;测序和序列分析表明L1基因核苷酸多处发生变异 ,并引起编码氨基酸的变异 ,L1基因在核苷酸水平形成上 6种突变模式(XJL1 1～XJL1 6 ) ,各模式与HPV16原型比较 ,同源性在 99 6 9%～ 99 87%之间。XJL1 1发生的 4处变异是所有变异序列所共有的 ,XJL1 2～XJL1 6在XJL1 1变异的基础上增加了不同的变异 ;在氨基酸水平上形成 4种突变模式 ,其中XJL1 1/ 2 / 3突变模式占 76 92 % (8/ 13) ,是突变的主流模式 ;以上突变引起HPV16L1蛋白疏水性和抗原性的改变 ,继而改变了L1蛋白的结构及功能。结论 中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌患者组织中HPV16L1基因发生多位点变异 ,并形成多种突变模式和突变的主流模式 ;这些突变引起HPV16L1蛋白疏水性和抗原性的改变 。

枸杞干红酒对小鼠抗疲劳、抗氧化作用的影响

将枸杞干红酒、枸杞干红三倍浓缩液以及枸杞多糖分别灌胃小鼠,进行游泳疲劳实验,结果显示枸杞干红酒能明显降低运动时血清尿素氮水平,减少肝糖原的消耗量,并且它能使血清SOD的活性明显提高,说明枸杞干红酒具有明显的抗疲劳作用和抗衰老作用.