运动性骨疲劳大鼠0PG／RANKL／RANK系统和雌激素变化的实验研究

目的研究骨疲劳大鼠OPG／RANKL／RANK系统和雌激素的变化，为寻找骨疲劳早期预警指标提供参考。方法雌性SD大鼠适应性训练1周后随机分为对照组（n=10）和训练组（n=lO）。用Instron5800双立柱万能材料试验机测定胫骨骨刚度判定骨疲劳是否建模成功。用HOLOGICDiscoveryW（S／N87901）双能骨密度检测仪检测骨密度，用荧光实时定量RT—PCR和WesternBla进行骨组织RANKL、OPG和ERa的mRNA测定和蛋白相对定量，ELISA检测血清RANKL、OPG和E2。结果6周训练后，训练组比对照组的骨刚度下降27．43％，提示大鼠骨疲劳建模成功。训练组骨密度【（0．247±0．011）g／cm。1低于对照组【（O．266±0．004）g，cm。1（t=4．244，P=0．001）。骨疲劳大鼠骨组织OPGmRNA和蛋白，ERa蛋白低于对照组，RANKLmRNA和蛋白高于对照组，差异均有统计学意义。训练组大鼠的血清OPG、E2及OPG／RANKL比值低于对照组，RANKL水平高于对照组，差异均有统计学意义。血清OPG与血清E2、骨组织OPG呈正相关；血清E2与骨组织OPG、ERa呈正相关关系。结论骨疲劳大鼠血清E2降低，骨吸收增强，血清OPG、RANKL和E2可作为运动性骨疲劳发生的早期预警指标。

苯丙烯类葡萄糖氧苷的合成及其抗缺氧活性

以取代苯甲醛(1a^1t)为原料,通过Knoevenagel缩合、酯化和Li Al H4还原等反应制得苯丙烯醇衍生物(3a^3t);以取代肉桂醛(1u^1x)为原料,经Na BH4还原制得苯丙烯醇衍生物(3u^3x);3a^3x与全乙酰化溴代葡萄糖经Koenigs-Knorr偶联反应及Me ONa/Me OH体系脱除乙酰保护基反应,合成了24个苯丙烯类葡萄糖氧苷(5a^5x),其中5c,5f^5x为新化合物,其结构经1H NMR和ESI-MS表征。采用MTT法测定了5对缺氧损伤的内皮细胞(EA.hy926)的抗缺氧活性。实验结果表明:5b,5e,5g,5p,5q,5s,5t和5y对EA.hy926的抗缺氧活性均高于红景天苷。

新型HIV逆转录酶和整合酶双靶点抑制剂的虚拟筛选

目的构建3-OH HEPT类针对HIV逆转录酶非核苷类抑制剂作用靶点和整合酶的双靶点抑制剂[RT(NNRTI)/IN]药效团模型,对中药化学数据库(TCMD)进行搜索,寻找潜在的新型HIV双靶点抑制剂。方法从已知的3-OH HEPT类HIVRT(NNRTI)/IN双靶点抑制剂出发,构建药效团模型,基于药效团模型和Lipinski五规则对TCMD进行筛选,发现新的抗HIV双靶点抑制剂。结果构建的药效团模型包括6个药效特征基团,以符合6个药效特征基团中任意5个为条件,在测试集数据库中验证性搜索命中全部16个化合物,检出率达到了100%。利用所建的六点药效团模型和Lipinski五规则对TCMD筛选,得到符合条件的化合物229个,其中包含已知的抗HIV活性化合物。结论建立的药效团模型和筛选策略为后续研究打下了较好的基础。

HPMTP缩L-苯丙氨酸乙酯席夫碱配体及其配合物的合成、结构表征和抑菌活性

目的合成1-苯基-3-甲基-4-甲基苯甲酰基-5-吡唑啉酮(HPMTP)缩L-苯丙氨酸乙酯席夫碱及其Cu(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)金属配合物,并对合成的化合物进行结构表征和抑菌活性检测。方法通过元素分析、核磁(1H NMR)和红外光谱(IR)对合成化合物进行结构表征检测,采用琼脂扩散法测定化合物对大肠杆菌(革兰阴性菌)和枯草芽孢杆菌(革兰阳性菌)的抑菌活性。结果由1H NMR和IR数据推断出席夫碱配体及其金属配合物可能的结构;发现在1.25、2.50、5.00 g·L-1时,HPMTP、HPMTP缩L-苯丙氨酸乙酯席夫碱及其金属配合物对革兰阳性/阴性菌都具有抑制活性,其中浓度为2.50 g·L-1时抑菌效果最佳。抑菌能力的强弱是金属配合物>席夫碱配体>HPMTP,其中Cu(Ⅱ)和Co(Ⅱ)配合物的活性最高。结论 Cu(Ⅱ)和Co(Ⅱ)配合物具有进一步研究开发为广谱抗菌药物的潜力。

抗HIV中药复方的优选及其小分子数据库的构建和类药性分析

目的优选抗HIV中药复方,通过复方小分子数据库的构建和类药性分析,为复方抗HIV活性分子研究奠定数据库基础。方法查阅文献和国内专利搜集抗HIV中药复方,优选复方确定研究对象,在中药系统药理学数据库和分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)分别下载该复方单味中药化学成分,构建复方小分子数据库,并基于"Lipinski规则"进行类药性分析。结果检索得到48个抗HIV复方,其中单味中药组成明确的复方有11个,优选双黄连粉针剂为研究对象,构建双黄连粉针剂复方小分子数据库,命名为SHLMD,包括481个化合物,包含萜类(121个)、黄酮类(61个)、苯丙素类(31个)和有机酸及其酯类(23个)等11类化合物,以萜类和黄酮类化合物居多。基于"Lipinski规则"筛选得到323个化合物,组成的新数据库命名为Lipinski-SHLMD。结论双黄连粉针剂是适合优先展开研究的抗HIV中药复方,构建的SHLMD为双黄连粉针剂的分子研究奠定了数据库基础,利用"Lipinski规则"初筛突出了研究重点。

转录因子ZFP580在缺氧预处理抗大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用

目的:通过观察缺氧预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及锌指核转录因子ZFP580表达的改变,探讨ZFP580的作用及机制。方法:培养大鼠H9c2心肌细胞,分为3组:(1)缺氧/复氧(H/R)组:H9c2心肌细胞换用模拟缺血溶液(pH=6.2)缺氧(95%N2+5%CO2)培养3 h,复氧培养2 h;(2)缺氧预适应(HPC)组:H9c2心肌细胞经3个循环的短暂缺氧(10 min)/复氧(20 min)处理后,进行同上H/R实验;(3)对照(C)组:正常培养的H9c2心肌细胞。通过MTT染色及LDH水平判定HPC的作用。Western blotting方法观察心肌细胞中转录因子ZFP580表达及ERK1/2磷酸化情况,以及ERK1/2磷酸化抑制剂PD98059对ZFP580表达的影响。分别构建高/低表达ZFP580的慢病毒载体并转染H9c2心肌细胞,经H/R实验后利用Annexin V-PE/7-AAD染色及流式细胞术检测H9c2细胞凋亡情况,Western bloting方法观察caspase-3活化情况。结果:HPC能显著改善H/R处理后H9c2心肌细胞存活率降低和LDH漏出的现象。Western blotting结果显示,HPC组心肌细胞中ZFP580表达及ERK1/2磷酸化程度较H/R处理组明显上升,且PD98059预处理明显抑制HPC诱导的ZFP580的表达上调。慢病毒介导的基因转染实验发现,ZFP580高表达的H9c2心肌细胞在H/R损伤后凋亡率降低且细胞中活化caspase-3表达下降。结论:HPC可引起心肌细胞中转录因子ZFP580表达上调,ZFP580作为ERK1/2通路的下游靶分子发挥抗心肌细胞凋亡的作用。ZFP580表达上调可能作为内源性保护机制之一介导了HPC的细胞保护作用。

甲硫氨酸诱导高Hcy血症的抗氧化作用研究

为探讨甲硫氨酸在诱导高Hcy血症过程中的抗氧化作用,将Wistar大鼠随机分为正常组和1%甲硫氨酸组,喂养6周后,采用高效液相色谱法测定血清中同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽含量(GSH),全自动氨基酸分析仪测定蛋氨酸和牛磺酸含量,转氨酶活性采用试剂盒测定。肝组织丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法,黄嘌呤氧化酶法和比色法测定肝组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(FRAP值)和还原性谷胱甘肽含量。结果表明,1%甲硫氨酸组血清Hcy和牛磺酸含量分别为3.56±0.68μmol·L-1和568.68±57.02μmol·L-1,较正常组显著升高(p<0.05)。1%甲硫氨酸组肝组织GSH含量和SOD活性分别为132.19±25.49mg·g-1和6.86±1.46U·mg-1,较正常组103.97±16.30mg·g-1和5.01±1.24U·mg-1显著升高(p<0.05)。1%甲硫氨酸组较正常组肝组织FRAP值亦升高而MDA含量降低。结果表明,甲硫氨酸在诱导高Hcy血症过程中同时具有抗氧化作用。

束缚应激对大鼠同型半胱氨酸代谢的影响

为了探讨束缚应激对大鼠血清含硫氨基酸代谢的影响,根据同型半胱氨酸(Hcy)水平,将32只雄性Wistar大鼠分为对照组(control)、束缚应激组(RS)、1%蛋氨酸组(1%Met)和1%蛋氨酸+束缚应激组(1%Met+RS)。采用高压液相色谱法检测血清中的Hcy、半胱氨酸(Cys)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量,采用全自动氨基酸分析仪测定血清中蛋氨酸(Met)和牛磺酸(Tau)含量。结果显示,RS组大鼠血清Hcy、Cys和GSH含量随着束缚时间延长而降低,且较对照组和1%蛋氨酸组有显著性差异(p<0.05);RS组大鼠血清Met和Tau含量较对照组和1%蛋氨酸组则显著升高(p<0.05)。束缚应激可能降低血清抗氧化能力和总Hcy水平。

应力性骨折早期诊断技术研究进展

应力性骨折(stress fracture,SF)是反复持久应力作用下导致的骨局部损伤,主要发生于运动员和部队官兵,其早期诊断对避免严重性后果具有重要意义。目前,临床诊断主要依赖影像学,但影像诊断技术存在早期诊断率低、价格昂贵、先进仪器设备普及难等问题。基于对SF骨代谢的研究分析,探索一种或几种SF的早期生化标志物,建立敏感性高、特异性强、价格低、操作简单的早期诊断方法,可能是SF早期诊断领域一个值得探索的课题。笔者分别从SF早期影像学诊断、骨转换生化标志物两个方面进行综述。

白藜芦醇对不同受体亚型MCF-7细胞增殖的影响

目的观察0.1μmol/L白藜芦醇作用不同受体亚型(ERα+/ERβ+)MCF-7细胞的增殖情况,并探讨其作用机制。方法采用MTT法和流式细胞术检测白藜芦醇对细胞增殖及周期的影响;Western-blot法检测白藜芦醇与不同受体亚型结合后对细胞信号通路的影响。结果白藜芦醇作用后,细胞增殖活性ERα-ERβ+-MCF-7<MCF-7<ERα+ERβ--MCF-7;同时流式细胞术结果显示,ERα+细胞S期比例增加(P<0.05),而ERβ+细胞周期阻滞于G0/G1期。western-blot结果显示,白藜芦醇可提高ERα+细胞bcl-2、ERK-P和AKT-P蛋白表达,减少caspase-3、p38-P蛋白表达;对ERβ+细胞作用则相反。结论白藜芦醇对MCF-7细胞的双相调节作用可能与ER不同亚型亲和力有关。

军校学员综合评定系统的初步开发

随着军队改革和国防现代化建设的稳步推进,《军队生长干部学员毕业分配规定》的出台极大地激发了军校学员的学习热情。为简化毕业评定工作,配合将来有可能实施的全程淘汰制度,初步开发了实时学员综合排名的军校学员综合评定系统,从而提高军校教育管理的工作效率,显著提升未来新军事人才的综合素质水平。

应激性心肌病大鼠心率变异率变化

目的 观察束缚（IMO）应激大鼠心率变异率（HRV）、心肌组织学及心电图变化,研究自主神经在应激性心肌病（SC）中的作用.方法 建立IMO SC动物模型,检测HRV时域、频域指标、心电图、血浆NE、心肌损伤标志物浓度、左心室血流动力学及H＆amp;E染色心肌组织学变化.结果 大鼠IMO应激后心率增加、ST段明显偏移及严重心律失常,QTc间期延长[（0.202±0.012）s比（0.172±0.017）s],VLF[（855.92±407.21）ms2比（12853.82 ±5765.48）ms2]、NN50[（29.10 ±5.11）ms比（448.50 ±88.89）ms]、LF[（1760.22±783.57）ms2比（24505.12±10819.95）ms2]明显降低,SDNN[（150.52±29.64）ms比（241.92±78.90）ms]、RMSSD[（206.68±43.48）ms比（343.66±117.68） ms]、HF[（3862.72± 1500.32）ms2比（21947.71 ±10591.51）ms2]及LF/HF[（0.60±0.18）ms2比（0.71±0.18）ms2]轻度降低,左心室内压[（188.87±21.55）mm Hg比（117.91±9.08）mm Hg]、＋dp/dt[（18921.27±8582.54）mm Hg/s比（7475.00±1408.33）mm Hg/s]显著增高,-dp/dt明显减低[（-13417.21±6859.33）mm Hg/s比（-7175.70±2166.30）mm Hg/s].血浆NE、cTnⅠ浓度明显升高,心肌炎性细胞聚集,心尖部片状心肌坏死,中部、心底心肌细胞水肿.结论 IMO应激可诱发与临床特征相近的SC.HRV变化提示IMO后交感神经激活,同时迷走神经张力增强,说明心脏自主神经平衡在本病发生过程中可能有重要意义.

Caco-2细胞模型的建立及其在真菌毒素吸收率研究中的应用

目的构建Caco-2单层细胞转运5种毒素的吸收率模型并验证。方法以Caco-2细胞系为工具，以脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、黄曲霉毒素B1（AFB1）、AFB2、黄曲霉毒素G1（AFG1）和AFG2为研究对象，通过对转运介质溶液中毒素的初始浓度、温度、pH值、抑制剂存在与否等实验条件的优化，构建Caco-2细胞转运DON和4种黄曲霉毒素的生理模型并进行验证。结果DON、AFB1、AFB2、AFG1及AFG2透过Caco-2单层细胞的量和表观渗透系数（Papp）随着体系溶液中pH的升高有下降趋势。AFB，在pH7．4—7．5溶液中的Papp值最高，AFB2、AFG1、AFG2及DON在pH7．0～7．1溶液中的Papp值最高。随着体系温度的升高，DON、AFB1、AFB2、AFG3及AFG2的透膜能力均有所增加。无论体系中AFB1、AFG1及AFG2浓度低或高，均在60min时透过率达到平台期并维持稳定；而AFB，及DON从高浓度到低浓度均在120min时透过率达到平台期并维持稳定。结论所建5种毒素Caco-2单层细胞模型灵敏、稳定、可靠、有效。

H274Y突变型H5N1流感病毒神经氨酸酶对奥司他韦的耐药机制研究

【目的】揭示H274Y突变型H5N1流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)对奥司他韦(Oseltamivir,OTV)产生耐药的机制。【方法】利用BLAST序列比对工具和MOE软件的蛋白质结构比对模块,对野生型和突变型NA(PDB ID:3TI6和3CL0)的一级结构、二级结构、三级结构以及活性位点进行比对,在分子水平探讨H274Y突变型H5N1流感病毒NA对OTV产生耐药的机制。【结果】3CL0中S1区与OTV羧基形成氢键作用的残基由保守残基Arg292变为了非保守残基Asn347;在S2区增加了OTV与Ile222的疏水作用;由于受到突变后酪氨酸残基较大侧链对羟基苄基的空间位阻作用,3CL0中Glu276的空间形态发生较大变化,影响了活性位点S5疏水口袋的形成。【结论】3CL0活性位点S1区保守残基与OTV的氢键作用被非保守残基取代,S2区突变型NA与OTV之间的疏水作用增加,且突变残基的空间位阻影响了活性位点S5区疏水口袋的形成,均可能是造成H274Y突变型H5N1流感病毒NA对OTV耐药的重要原因。

鬼臼毒素衍生物ZM-10对口腔鳞状细胞癌KB细胞株的作用及其机制研究

【目的】对鬼臼毒素进行结构改造得到新衍生物ZM-10,观察其对口腔鳞状细胞癌KB细胞株的作用,并探讨其作用机制。【方法】MTT法和流式细胞术检测鬼臼毒素衍生物ZM-10对KB细胞增殖作用的影响;荧光染色实验检测鬼臼毒素衍生物ZM-10作用后KB细胞形态学变化情况;RT-PCR法检测鬼臼毒素衍生物ZM-10作用KB细胞后P53、Caspase-3、Bcl-2以及Bax等相关基因表达的变化情况。【结果】MTT结果显示鬼臼毒素衍生物ZM-10对口腔鳞状细胞癌KB细胞株的半数抑制浓度为3μmol/L。流式细胞检测结果显示鬼臼毒素衍生物ZM-10对KB细胞增殖的各个时相均有抑制作用,且使细胞周期阻断在G2+M期。RT-PCR结果显示鬼臼毒素衍生物ZM-10作用后,细胞中P53、Caspase-3和Bax的m RNA的表达量均显著增加(P<0.05),而Bcl-2的m RNA的表达明显下调(P<0.05)。【结论】鬼臼毒素新衍生物ZM-10通过诱导KB细胞发生凋亡而抑制细胞增殖。

Pseudomonas putida ND6中两个高度同源catA基因的分离、克隆及比较

【目的】分别对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ND6基因组中基因高度同源的儿茶酚1,2-双加氧酶基因catA_1、catA_2进行克隆和原核表达,并进行生物信息学分析和酶学性质比较。【方法】通过生物信息学软件对catA_1和catA_2进行序列分析和进化树构建,利用经典的酶切连接方法和核酸外切酶III介导的无缝连接两种方法分别对catA_1和catA_2进行了表达载体的构建,对表达产物的酶学性质(最适反应温度,最适反应p H,耐热性,底物特异性等)进行了研究。【结果】catA_1和catA_2在基因序列上相似性为73.57%,两个酶的最适反应p H均为7.4,最适反应温度分别为45℃、50℃,Km值分别为1.28、1.66μmol/L,酶活力单位分别为9.00、8.35 U/mg,两个酶对儿茶酚和4-甲基儿茶酚具有较好的反应活性,在C12O分类中属于同一类型。【结论】本研究通过两种方式成功构建了高度同源性两个基因的表达载体,对于分离高同源性基因有一定的参考意义,同时通过对ND6菌株中同工酶的酶学性质进行研究和比较,加深了对ND6萘降解机制的理解,进一步探讨了冗余降解基因存在的意义。