应用生物素-链霉亲和素的酶联免疫吸附法检测谷物中的玉米赤霉烯酮

基于生物素-链霉亲和素的酶联免疫吸附法(ELISA),建立了玉米赤霉烯酮(ZEN)的ZEN-ELISA检测方法。该方法的检测灵敏度为0.8 ng/ml,批内、批间变异系数分别为5.1%和8.6%,平均加样回收率为91.2%;抗ZEN单克隆抗体与玉米赤霉醇的交叉反应度为12.3%,而其与赭曲霉素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉素B1无交叉反应;相关试剂在4℃存180 d后各检测参数基本无变化;该方法与商品ELISA试剂盒对同一样品ZEN测定结果的相关系数为0.943 2。说明该方法的特异性和稳定性较好,测定结果准确,可用于ZEN的大量筛查。

应用生物素-链霉亲和素的时间分辨荧光免疫分析检测玉米赤霉烯酮

采用基于生物素（Biotin）-链霉亲和素（Strepavidin）的时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术建立了快速灵敏的玉米赤霉烯酮（ZEN）检测方法。以strepavidin包被板条，加入生物素化的ZEN—BSA，结合在板条上的ZEN—BSA与标准／样本中的游离ZEN共同竞争限量的抗ZEN单克隆抗体，用稀土离子Eu“标记的羊抗鼠IgG进行示踪，建立了间接竞争的ZEN-TRFIA。该方法的检测灵敏度为0．2ng／ml，测量范围是0．2～200．0ng／ml，批内、批间变异系数分别为5．7％和8．3％，平均回收率为91．1％。与玉米赤霉醇的平均交叉反应是12．3％，与赭曲霉素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉素B1无交叉反应，说明该方法的特异性较好。相关试剂在4℃放6个月后各检测参数基本无变化，说明该方法稳定。样品同时用ZEN—TRFIA和商品ELISA试剂盒测定样品ZEN含量，两者的相关系数为0．9664，说明该方法测量准确。ZEN—TRFIA具有测量准确、检测灵敏度高、检测范围宽、操作简便、标记物稳定等优点，适合于ZEN大量筛查的应用。

白藜芦醇抑制耐阿霉素人乳腺癌细胞系MCF-7/ADM增殖的研究

目的观察白藜芦醇对耐阿霉素人乳腺癌细胞系MCF-7/ADM增殖和细胞周期的影响及探讨其靶点蛋白质。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、光学显微镜观察观察白藜芦醇对MCF-7/ADM细胞增殖的影响,流式细胞仪检测观察白藜芦醇对细胞周期的影响,Western blot法、亲和甄别磁珠法鉴定白藜芦醇的靶点蛋白质。结果白藜芦醇作用MCF-7/ADM 72 h之后,细胞增殖大量下降并且呈剂量依赖关系,而对正常肝细胞毒性很小。白藜芦醇可导致MCF-7/ADM细胞阻滞于G0/G1期。Cdk2、myosin和actin蛋白可能是白藜芦醇的靶点蛋白质之一。结论白藜芦醇可能是1种新发现的Cdk2的抑制剂,同时通过作用于细胞的骨架结构蛋白质来干扰细胞的有丝分裂过程,使细胞周期延长从而导致MCF-7/ADM的增殖受到抑制。提示白藜芦醇是1种活性强、低毒的抗癌化学前体分子。

赭曲霉毒素A的高灵敏时间分辨荧光免疫分析

采用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术建立快速的高灵敏度的赭曲霉毒素A(OTA)全自动检测方法.将OTA-BSA作为免疫分子免疫Balb/c小鼠,OTA-KLH为筛选用抗原包被板,用间接酶联免疫分析(ELISA)法筛选出专一针对OTA的高效价的阳性克隆3G9,用杂交瘤细胞制备抗OTA单克隆抗体.用OTA-BSA包被96孔板为固相抗原,与游离OTA共同竞争有限的抗OTA单克隆抗体,以稀土离子Eu3+标记的羊抗鼠抗体进行示踪,采用间接竞争免疫分析方法在解离增强荧光免疫分析体系中建立OTA-TRFIA.该方法的灵敏度为0.03μg/L,测量范围为0.03￣1000μg/L,批内和批间变异分别为3.7%和5.3%,平均回收率为94.2%,与赭曲霉毒素B的平均交叉反应为3.7%,与黄曲霉毒素B1、牛血清白蛋白和苯基丙氨酸无交叉反应,说明抗体的特异性很好.8条不同时间进行的间接竞争OTA-TRFIA的效应点均值ED80、ED50、ED20分别为(0.33±0.02)μg/L、(1.44±0.08)μg/L和(5.22±0.12)μg/L,说明方法的稳定性好,样品经TRFIA和ELISA试剂盒同时检测OTA,两者的相关系数为0.925,结果相符.研究表明,OTA-TRFIA是目前报道的OTA检测中最灵敏的方法,该分析方法稳定性好,可测范围宽,具有很好的应用前景.

壳聚糖物化性质对其体外结合脂类和胆酸盐能力的影响

在体外模拟人体消化环境,测定了不同脱乙酰度和粘均分子量的壳聚糖对脂肪、胆固醇和胆盐的结合能力,探讨了壳聚糖物化性质对结合能力的影响。结果表明,壳聚糖结合脂肪能力受脱乙酰度和粘均分子量共同影响而呈现规律性变化,表现为随着这两个指标的增高而相应增强,而结合胆固醇能力则没有变化,但随着其粒径的增大,结合能力下降。壳聚糖结合胆盐能力受粘均相对分子质量影响较大,分子量高,则结合能力强,不同脱乙酰度的壳聚糖结合能力相差不大。说明壳聚糖物化性质对其结合能力有影响,影响大小取决于结合物和壳聚糖之间的作用机制。

产高活性抗癌物质的粘细菌的定向筛选

粘细菌是一类复杂的具有多细胞行为的原核生物,属于革兰氏阴性菌。粘细菌能够产生丰富的活性物质,并且具有菌株特异性,为人类不断发现新的活性物质提供了广阔的前景。本文以3株肿瘤细胞系为筛选模型,采用MTT法,对370多株分离的粘细菌及其代谢产物进行定向筛选,获得六株产高活性物质的粘细菌,并根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版),初步把这六株菌株归属到属。

壳聚糖降脂保肝作用的研究

目的研究壳聚糖(Chitosan)对高血脂及脂肪肝造型大鼠的降脂作用,初步探讨壳聚糖的降脂作用机制。方法将40只SD大鼠随机分为5组:正常对照组、高脂模型组、阳性对照组、壳聚糖1组(建模前给药)、壳聚糖2组(建模后给药),分别以各组饲料连续喂养6周。结果与模型组相比较,两个壳聚糖组血清总胆固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)均显著降低,血清高密度脂蛋白胆固醇(HDLc)升高。同时,壳聚糖对大鼠肝脏Tc,TG、肝重、腹脂等均有显著效果,能显著升高大鼠盲肠内容物pH。结论壳聚糖具有较显著的降脂效果和脂肪肝防治效果,其降脂作用机制应以包裹作用为主。

病毒性肝炎治疗药物干扰素的研究进展

目的:了解病毒性肝炎治疗药物干扰素的进展状况,为制备新型干扰素提供依据。方法:查阅国内外近年有关文献资料加以分析、归纳、总结并提出新的观点。结果:聚乙二醇(PEG)化的方法用来延长干扰素的半衰期,已经取得了很好的效果,并且有些药物已经上市。血清白蛋白融合干扰素在延长干扰素的半衰期效果上比PEG修饰更有效,值得关注和深入研究。结论:由于干扰素半衰期短,靶向性不足,所以半乳糖基化白蛋白融合干扰素(GHSA-IFNα-2b)不仅长效且靶向性好,有望成为治疗病毒性肝炎的新一代药物。

水蛭素促尿激酶纤溶作用研究

目的研究水蛭素对尿激酶诱导的纤溶作用的影响,并分析可能的机制。方法采用尿激酶为纤溶激酶,复钙柠檬酸钠抗凝血浆为纤溶酶原来源的体外溶栓模型,通过测定纤溶产物D-D imm er生成量,微孔板分光光度法跟踪纤溶过程,比较水蛭素与肝素对纤溶的影响。运用土豆羧肽酶抑制剂(CPI)对TAFIa的专一性抑制作用,分析水蛭素与肝素对TAFI活化的影响。结果水蛭素组D-D imm er较肝素组高(P<0.01),水蛭素加CPI组较水蛭素组更高(P<0.01);微孔板分光光度法跟踪纤溶过程,肝素组有明显的纤溶停止和血栓再形成倾向,水蛭素组则可观察到明显的溶栓现象,水蛭素加CPI组效果最好。结论对尿激酶诱导的纤溶,水蛭素比肝素有更好的间接促纤溶作用,其原因主要是水蛭素能有效抑制再次血凝的发生,减少了尿激酶和纤溶酶原的短暂性耗竭。在这一过程中,水蛭素不能彻底抑制TAFI活化,表明对TAFI活化的抑制可能不是水蛭素促尿激酶纤溶作用的主要原因。

粘细菌AHB125代谢产物的理化特征及其体外抗癌活性

介绍分离的粘细菌AHB125代谢产物的一些理化特征,并以小鼠黑色素瘤(B16)、人胃腺癌细胞(SGC7901)细胞株为模型,对粘细菌AHB125代谢产物的甲醇提取干燥物进行了体外活性试验,结果表明:其IC50分别达到了0.008 2μg/mL和0.036μg/mL,并且对Bel7402、H446、MCF-7也表现出了极高的活性.

产高活性抗癌物质卵黄状多囊菌JSW103(粘细菌)的筛选

以肿瘤细胞株为筛选模型,对分离的粘细菌代谢的产物进行定向、高通量筛选,在较短时间内得到了1株产高活性抗癌物质的粘细菌。根据其形态鉴定为多囊菌属(Polyangium)的卵黄状多囊菌(Polyangium vitellinum),命名为JSW103。JSW103代谢产生的甲醇提取的混合物对肿瘤细胞系B16和SGC7901体现有较强的选择性,其IC50分别达到了0.2701μg/mL和0.097μg/mL,并且对Bel 7402、H446、MCF-7也表现出较高的活性。

Angiostatin作用靶点的初步研究

目的研究血管抑素对血管内皮细胞作用的靶点。方法以99Tcm-重组人血管抑素、FITC-重组人血管抑素和FITC-重组人血管抑素抗体为示踪分子,进行小鼠S180肿瘤模型显像、Matrigel血管模型放射自显影和HMEC-1细胞的流式细胞术。采用亲和甑别技术对重组人血管抑素结合分子实施了分离,MS测序,并与蛋白质数据库进行了比较。结果99Tcm-重组人血管抑素可聚集在S180肿瘤部份,其特异地识别部位为新生血管。流式细胞术提示HMEC-1细胞表面存在重组人血管抑素的结合位点,亲和甑别发现3种结合蛋白,其中预测分子tubulin是重要的肿瘤药物靶点。结论血管抑素的作用靶点是特异靶向新生血管内皮细胞的,且其作用可能是多因素的。

血管钠肽促进小鼠3T3-L1脂肪细胞合成脂联素及其可能机制

目的探讨血管钠肽(VNP)对脂肪因子脂联素生成的影响及其机制。方法在3T3-L1细胞分化的脂肪细胞中加入不同浓度的VNP,分别用实时定量PCR法和Western blot法检测脂联素的mRNA水平和蛋白表达,放免法测定细胞内cGMP的水平。结果 VNP可显著增加脂联素mRNA水平和蛋白表达,同时提高细胞内cGMP,含量为(38±5)～(265±35)nmol/L,显著高于对照组的(10±2)nmol/L(P<0.01);该效应可用8-Br-cGMP诱导,可被cGMP依赖性蛋白激酶抑制剂KT-5823或钠尿肽受体NPR阻断剂HS-142-1抑制。结论 VNP可通过NPR/cGMP/PKG信号通路增加脂肪细胞脂联素的表达。

人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

制备人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。从新鲜人外周血中分离单核细胞,给予大肠杆菌脂多糖刺激后,RT-PCR制备G-CSF cDNA,以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区序列(525 bp)。重叠PCR拼接HSA-GCSF融合基因(2277 bp),序列测定正确,中间未加入任何连接肽。插入表达载体pPIC9K中α交配因子的开放阅读框内,构建分泌型表达重组质粒pPIC9K-HSA-GCSF。电击转化毕赤酵母菌KM71,G418筛选得到高拷贝转化子。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的相对分子质量约为84 k,Western blot分析融合蛋白为G-CSF与HSA的杂合分子,NFS-60细胞/MTT比色法测定融合蛋白具有G-CSF的生物学活性。结果:构建了可分泌表达HSA-GCSF融合蛋白的毕赤酵母工程菌,为进一步对其进行药学研究奠定了基础。

提高重组毕赤酵母表达hIFNβ-HSA的碳源控制策略

研究了重组毕赤酵母KM71/IH菌体生长阶段饥饿培养对其细胞相对活性及人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白(hIFNβ-HSA)表达的影响.结果表明,在以甘油为唯一碳源的细胞培养后期进行饥饿培养以耗尽培养基中的甘油会导致重组细胞相对活性的降低,进而减少hIFNβ-HSA的表达量.在此基础上,提出了菌体培养后期,即过渡阶段流加甘露醇碳源代替饥饿培养的策略,不仅可以消除培养液中甘油残留对甲醇诱导表达hIFNβ-HSA的不利影响,而且能够保持重组细胞培养物较高的相对活性(>97%),从而可以提高甲醇诱导表达hIFNβ-HSA的水平,表达量可达37.3mg/L,最大生产强度为0.78mg/(L-h),较对照分别提高了92.3%和44.4%