Rac1对巨噬细胞RAW264.7细胞生物学作用的影响

目的分析巨噬细胞RAW264.7的Rac1表达水平,通过构建Rac1载体和特异性siRNA探讨其对RAW264.7细胞生物学活性的影响。方法经反转录法克隆Rac1的cDNA并构建Rac1基因表达载体,Western blot技术检测Rac1的蛋白表达水平,定量荧光PCR(qRT-PCR)测定Rac1 mRNA,流式细胞术分析细胞表面膜分子表达的改变,Transwell法观察细胞的迁移能力,ELISA法检测细胞培养上清中相关细胞因子的表达。结果经测序等手段鉴定表明,Rac1载体构建成功,且将Rac1载体转入RAW264.7细胞可见其mRNA和蛋白表达均明显上调、细胞迁移能力增强,但对RAW264.7细胞膜表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达没有明显影响。然而,Rac1抑制剂及其特异性siRNA却可上调上述3种膜分子的表达。此外,Rac1转染的RAW264.7细胞分泌的IL-1β水平显著低于siRNA处理组及Rac1抑制剂组,而IL-6、IL-33、TNF-α的表达各组之间没有显著差异。结论 Rac1的表达有助于RAW264.7细胞的迁移和抑制IL-1β的分泌,而对细胞的抗原提呈作用无显著影响。

桥本甲状腺炎ILC2相关分子表达与自身抗体水平关系的研究

目的Ⅱ型固有淋巴细胞(group Ⅱ innate lymphoid cells,ILC2)是近年来新发现的非T非B淋巴细胞,在IL-25或IL-33刺激下产生和分泌IL-5、IL-13等2型免疫应答的细胞因子,参与Th2优势分化状态的维持。桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)是一类器官特异性的自身免疫性疾病,其甲状腺球蛋白抗体(ATG)和甲状腺过氧化物酶抗体(ATPO)等自身抗体均显著升高。ILC2参与的Th2细胞应答是介导抗体产生的重要途径,其与HT自身抗体的产生关系尚未见报道。方法本研究采用q RT-PCR法检测HT患者外周血ILC2特征性细胞因子和转录因子的表达水平,并对其与血清ATG和ATPO水平的相关性进行了分析。结果 HT患者外周血单个核细胞(PBMC)ILC2特征性转录因子(RORα)和细胞因子(IL-13)的m RNA明显增加,且与血清ATG及ATPO自身抗体水平的显著升高呈现明显正相关。结论 ILC2的活性与HT患者自身抗体的产生有着密切的关系,其作用可能是通过维持Th2极化状态促进自身抗体的产生,拟或影响IL-10的产生降低自身抗体应答的负向调控,有待进一步深入研究。

小GTP酶Rac1对肺癌A549细胞凋亡和吞噬作用的影响

目的:分析肺癌A549细胞Rac1的表达水平及其对细胞吞噬功能的影响。方法:采用姜黄素诱导A549细胞凋亡;采用流式细胞术检测Rac1抑制剂对A549细胞凋亡的影响;将A549细胞与同系凋亡细胞共培养,应用荧光显微镜技术观察Rac1下调对A549细胞清除凋亡细胞能力的影响。用qRT-PCR检测细胞Rac1 mRNA表达水平。结果:流式双染和Hoechst染色荧光显微镜观察结果显示,Rac1抑制剂能够明显增强姜黄素诱导的A549细胞凋亡,凋亡细胞率相对于未加入Rac1抑制剂时显著上升,且呈现与Rac1抑制剂的剂量依赖特性。此外,Rac1抑制剂能明显下调A549细胞的吞噬能力。结论:Rac1可抑制肺癌A549细胞的凋亡,增强其吞噬功能。

低氧诱导高迁移率组蛋白B1对人胰腺癌细胞凋亡抵抗和迁移的作用研究

目的观察低氧诱导人胰腺癌细胞系(SW1990)分泌高迁移率组蛋白B1(HMGB1)作用,并探讨胞外HMGB1在胰腺癌细胞凋亡抵抗及转移中的作用。方法取对数生长期SW1990细胞分别给予以下处理:(1)常氧+PBS;(2)低氧+PBS;(3)低氧+HMGB1(100μg/L);(4)低氧+HMGB1(100μg/L)+EP(胞外HMGB1特异性抑制剂)。细胞处理72 h后,ELISA检测(1)及(2)2组细胞培养上清中HMGB1表达的差异;Annexin V/PI流式细胞术检测(2)、(3)、(4)各组细胞的凋亡率;Transwell迁移实验检测(2)、(3)、(4)各组细胞迁移能力差异;Western-blotting检测(2)、(3)、(4)各组细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2)及迁移相关蛋白(E-cadherin、MMP-9)表达的差异。结果 ELISA结果显示低氧条件下,细胞培养上清中HMGB1表达含量升高,是常氧条件下的5倍;Annexin V/PI流式细胞术检测以上3组细胞的凋亡率分别为:(23.47±2.20)%、(6.57±1.20)%、(20.03±1.89)%;低氧+HMGB1处理组细胞凋亡比率明显低于其他2组,差异有统计学意义(P<0.05);Transwell迁移实验中各组穿至下室的细胞数分别平均为(161.3±16.0)、(399.7±13.0)、(184.3±16.0)个,差异有统计学意义(P<0.05),提示低氧条件下HMGB1能明显促进人胰腺癌SW1990细胞的迁移;Western-blotting结果显示HMGB1处理组Bcl-2及MMP-9表达增高,E-cadherin表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论低氧可以促进肿瘤细胞释放HMGB1,从而促进人胰腺癌SW1990凋亡抵抗与迁移。

HBV基本核心启动子和前C区变异的深度测序分析

目的利用Ion Torrent PGM深度测序技术,探讨乙型肝炎病毒e抗原（HBe Ag）阳性慢性乙型肝炎（CHB）患者乙型肝炎病毒（HBV）基本核心启动子和前C区突变特征。方法收集HBe Ag阳性CHB患者血清样本25例,提取HBV DNA,采用巢式PCR方法扩增HBV基本核心启动子和前C区片段,构建深度测序文库,基于Ion Torrent PGM平台深度测序,生物信息学分析突变位点及其突变率;构建HBV基本核心启动子和前C区突变型和野生型参考质粒,作为深度测序质控品。结果在25例HBe Ag阳性CHB患者HBV基本核心启动子和前C区检出流行率达20%的突变位点10个：G1746A、A1752G/T、T1753C/G、A1762T、G1764A、C1817G/A、T1825C/A、A1846T、G1896A、G1899A;G1746A和T1825C/A的流行率分别达92%和100%。突变位点在HBV B基因型和C基因型感染者的分布情况显示,A1752G/T和G1896A主要流行于B基因型感染者（63.6%vs 0.0%,χ^2=12.374、P=0.0007;72.7%vs 28.6%,χ^2=4.812、P=0.0472）,A1762T和G1764A主要流行于C基因型感染者（27.3%vs 78.6%,χ^2=6.579,P=0.0172）;C基因型感染者A1762T/G1764A突变率显著高于B基因型感染者,但差异无统计学意义（25.7%±28.4%vs 68.4%±42.7%,t=1.614、P=0.1326）。25例HBe Ag阳性CHB患者中,32.0%患者仅有A1762T/G1764A突变,24.0%患者仅有G1896A突变,24.0%患者同时携带A1762T/G1764A和G1896A突变。结论深度测序分析可用于定量检测HBV基本核心启动子和前C区突变,为HBV突变研究的临床应用提供了技术平台。