猪肺炎支原体气溶胶富集检测技术的初步研究

为了建立一个简单易行的猪肺炎支原体气溶胶富集和检测技术,结合液体冲击式采样器和过滤式采样器的原理,自行设计一个气溶胶双重富集装置,并在密闭环境下采集人工制备的猪肺炎支原体气溶胶,荧光定量PCR检测以确定该装置的采集效率。再通过收集不同猪群中的气溶胶进行检测以确定该装置临床应用的可行性。首先,收集人工感染Mhp阴性仔猪后不同时间猪舍内的气溶胶;其次,收集1个猪支原体肺炎发病猪场和1个阳性未发病猪场的产房、保育舍和育肥舍共11个猪舍的气溶胶,荧光定量PCR或套式PCR检测所收集的气溶胶。结果显示:实验室模拟采样的采集效率达到(37.04±6.43)%,人工感染猪肺炎支原体后7天即在饲养房间的气溶胶中检到猪肺炎支原体;2个猪场共11个不同猪舍气溶胶中猪肺炎支原体检测结果均为阳性,检出率100%。成功建立了一个简单易行的猪场猪肺炎支原体气溶胶富集及检测技术。

猪伪狂犬病病毒新流行变异毒株的研究进展

近30年内,猪伪狂犬活疫苗的应用对中国猪伪狂犬病的防控贡献巨大。2011年以来,中国许多免疫猪场相继暴发猪伪狂犬疫情,给养猪业造成了巨大的损失。研究显示最新流行的PRV毒株为变异株,部分商品化活疫苗不能对其提供完全的保护。本文详细介绍了2011年以来中国猪伪狂犬病的发病情况及其分子流行病学调查结果,分析了猪伪狂犬新变异株的分子生物学特性及其变异株来源,同时论述了针对PRV突变株新型疫苗的研究进展,最后对深入开展中国猪伪狂犬病控制与净化研究进行了展望。

江苏省及周边地区猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)分子流行病学调查

为了解中国江苏省及周边地区猪圆环病毒Ⅱ型（ PCV2）的分子流行病学以及毒株的遗传变异情况，本研究运用PCR技术对来源于不同地区、不同猪场且PCV2检测为阳性的样品进行全基因组序列的扩增和测序，共获得18株PCV2全基因序列，并对所得到的毒株进行遗传变异分析。结果表明，18株毒株与国内外的参考毒株同源性为93．5％～99？7％，而ORF2核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别为87．1％～99？9％和84．2％～99？6％，说明毒株存在一定程度的变异。系统进化树分析结果显示18株毒株中有5株PCV2a，7株PCV2b，6株PCV2d，其中20150429YC全长为1766 bp，与（HM038031．1 PCV2d等）参考毒株的同源性为100？0％，未发现PCV2c。同时，Cap蛋白的抗原表位和抗原性也发生了变化。说明，目前江苏省及周边地区猪群中PCV2感染较为普遍，PCV2的流行毒株以PCV2b基因型为主，PCV2d次之。

1株绵羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及致病性研究

为确定导致绵羊细菌性感染死亡的病原,从送检病死绵羊肺脏中分离纯化出1株细菌,并对其进行培养特性观察、生化反应、PCR鉴定、药敏试验和动物致病性试验。结果显示,分离纯化的细菌为革兰氏阴性短杆菌,经生化反应和PCR鉴定为溶血性曼氏杆菌;该细菌对庆大霉素、头孢噻肟高度敏感;对青霉素、四环素、红霉素、利福平、卡那霉素、恩诺沙星和大观霉素耐药;将1×10~9CFU/m L菌液10倍系列稀释后感染6~8周龄小白鼠,该细菌对小白鼠的半数致死量为1×10^(6.2)CFU/m L;死亡动物的剖检病变与发病绵羊类似,并从病变器官内分离到细菌。本研究为进一步探讨溶血性曼氏杆菌的致病机理奠定了基础。

猪肺炎支原体致病机理研究进展

猪肺炎支原体是猪支原体肺炎的主要病原。近年来对该病原研究较多,但主要都集中在基因和膜蛋白方面。论文从猪肺炎支原体基因结构、黏附蛋白、蛋白组学和猪肺炎支原体的细胞炎性因子反应等方面对猪肺炎支原体的致病机理进行综述,为相关研究提供参考。

猪支原体肺炎活疫苗佐剂体内外促进细胞免疫刺激能力的研究

为增强猪支原体肺炎活疫苗在肌肉注射免疫时的细胞免疫刺激能力,对7种猪支原体肺炎活疫苗可用佐剂的细胞免疫应答促进作用进行了体外及体内试验评价。7种佐剂中除皂角素外,其余6种对活疫苗活力皆无明显影响。用这6种佐剂体外刺激淋巴细胞,发现左旋咪唑、免疫刺激复合物基质、黄芪多糖和胞壁酰二肽可以在体外单独刺激或协同刀豆蛋白刺激小鼠脾淋巴细胞及猪外周血淋巴细胞增殖,其中免疫刺激复合物基质仅需ng/ml级别浓度即可起效,而壳聚糖和卡波姆不能在体外刺激细胞增殖。选用其中5种佐剂与活疫苗配合肌肉注射免疫小鼠,发现左旋咪唑、免疫刺激复合物基质、黄芪多糖、卡波姆可以显著增加机体针对猪肺炎支原体抗原的细胞免疫应答。结果表明,利用适当佐剂可以实现猪支原体肺炎活疫苗在肌肉注射条件下对机体细胞免疫应答的有效刺激。

猪鼻支原体表面可变脂蛋白vlpA黏附宿主细胞功能研究

猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎、肺炎及中耳炎等多种慢性炎症,感染率极高,且与人类肿瘤的发生有关,对人类健康构成威胁。已有研究表明猪鼻支原体表面可变脂蛋白(vlp)家族参与支原体黏附宿主细胞的过程,本试验主要详细研究vlp家族成员之一vlpA的黏附细胞功能,特别是其Ⅲ区重复片段重复次数变化对其黏附能力的影响。根据GenBank中已公布的vlpA的基因序列,设计引物,从菌体DNA中扩增获得vlpA基因,或者人工合成Ⅲ区重复片段重复次数不等的一系列vlpA基因,均克隆至pET-32a(+)质粒中进行表达,获得目的蛋白质。同时利用固相合成法制备含两段Ⅲ区重复片段的多肽。利用间接免疫荧光试验和微孔板黏附试验检测所制备的各种重组vlpA蛋白和多肽的黏附功能。通过诱导表达和镍柱亲和层析纯化,成功获得纯度较高的各个目的蛋白质。利用间接免疫荧光试验证实vlpA可以黏附宿主细胞;利用微孔板黏附试验定量检测不含Ⅲ区的重组vlpA0蛋白及Ⅲ区重复片段多肽的黏附能力,结果发现vlpA0可黏附细胞,而Ⅲ区重复片段多肽无明显黏附能力;进一步利用微孔板黏附试验检测含Ⅲ区重复片段次数分别为3、6、9、12次的重组蛋白vlpA3、vlpA6、vlpA9、vlpA12的黏附能力,结果显示四种重组蛋白质均可黏附细胞,但黏附水平均低于不含Ⅲ区的重组vlpA0蛋白,且随着Ⅲ区重复片段重复次数的增加黏附能力下降。本研究结果提示vlpA为猪鼻支原体黏附因子之一,其Ⅱ区含有黏附位点,而整体分子的黏附能力随着Ⅲ区重复片段重复次数的增加明显减弱。本研究结果有助于进一步研究猪鼻支原体的黏附及致病机制。

伪结核棒状杆菌的分离鉴定及病原性研究

从疑似羊干酪性淋巴结炎的肩前淋巴结脓肿中分离到1株细菌,经革兰氏染色为无芽孢的阳性棒状杆菌;伪结核棒状杆菌特异性引物进行PCR扩增测序表明,该细菌的序列与伪结核棒状杆菌同源性达99.0%以上,确定其为伪结核棒状杆菌。用15种常用抗生素纸片进行药敏试验,结果显示,该菌对青霉素、头孢曲松、左氧氟沙星和氟苯尼考高度敏感;对链霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星、林可霉素和大观霉素耐药。致病性试验发现,腹腔注射小白鼠的半数致死量为1×10-6.0CFU/m L;皮下注射小白鼠2 d后出现大小不等的脓肿;分别用2×108、2×106CFU/m L 2种剂量皮下注射羊后出现体温持续升高,接种部位和周边的浅表淋巴结出现脓肿,切开后有干酪样脓汁,并从病变器官和脓汁中分离到细菌。组织病理学观察显示,皮肤和肌肉层有坏死灶及肉芽肿形成,肌纤维断裂坏死,淋巴细胞浸润,淋巴结出现化脓灶,并有大量上皮样细胞和成纤维细胞增生。本研究为伪结核棒状杆菌疫苗研制及致病机理研究奠定了基础。

樱桃谷鸭OASL基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析

为了获得樱桃谷鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白质基因(OASL)全长cDNA,并且初步了解其生物学特性,采用RT-PCR和RACE方法从鸭脾脏组织总RNA中扩增OASL基因cDNA片段,应用生物信息学方法,系统分析鸭OASL的遗传进化以及蛋白质的理化性质、二级结构和亚细胞定位。结果表明,樱桃谷鸭OASL基因(Gen Bank登录号:KX255654)全长1 630 bp,其中包含19 bp的5'UTR(Untranslated region,UTR)、99 bp的3'UTR(Untranslated region,UTR)和PolyA尾巴、1 512 bp的编码区(Coding region,CDS),翻译编码504个氨基酸多肽。鸭OASL蛋白具有寡腺苷酸合成酶(OAS)蛋白家族的典型特征,即N端为寡腺苷酸合成酶样结构域(OAS-like domain,OLD),C端为2个串联的泛素化样结构域(Ubiquitin-like domains,Ub LDs),不具有信号肽和跨膜区。序列比对和系统进化分析结果表明,OASL氨基酸序列在同种之间比较保守,与已报道的鸭OASL的同源性高达100%,与鹅同源性为78%,与人、鼠和猪等哺乳动物的同源性仅为43%~45%。

瑞士减群法在猪肺炎支原体净化中的应用研究进展

猪支原体肺炎(猪气喘病)是由猪肺炎支原体引起的一种严重危害全球养猪业生产的传染病之一,可以感染任何日龄和任何品种的猪只,且一旦侵入就难以清除。很多发达国家,特别是西欧和北美,均通过彻底净化病原的方式来控制该病的爆发。然而每个猪场都有各自的特殊性,完全套用其他猪场的模式未必能成功。瑞士减群法因其成本低、操作简便、成功率高,灵活多用而被很多猪场活用,本研究就瑞士减群法在不同猪场成功的活用做一综述,为国内猪肺炎支原体净化提供临床经验和理论依据。

小鼠转录因子STAT1真核表达质粒的构建及生物学功能分析

本研究以小鼠组织的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到小鼠信号转导子和转录激活子1(STAT1)基因完整开放阅读框的碱基序列,然后将其克隆到真核表达载体p DsRed-N1中,构建p DsRed-N1-STAT1重组质粒。测序成功的真核质粒转染至BHK-21细胞,通过α干扰素(IFN-α)分子刺激,检测细胞中STAT1分子的活化状态与定位,最终通过坦布苏病毒刺激,荧光显微镜检测STAT1分子的细胞内定位。结果表明,小鼠的STAT1基因开放阅读框为2 250 bp,编码749个氨基酸。同源性比对结果表明,小鼠STAT1与人、大鼠、猪、马等哺乳动物STAT1氨基酸序列的一致性分别为92%、97%、91%、91%。转染结果表明,构建的p DsRed-N1-STAT1真核表达质粒在BHK-21细胞中成功表达,无IFN-α刺激时,红色荧光只在BHK-21细胞的细胞质中出现,而加入IFN-α后,红色荧光则大多分布于细胞核内。用坦布苏病毒感染细胞后,红色荧光多分布于细胞质中。说明,构建的真核质粒p DsRed-N1-STAT1在哺乳动物细胞中能够正确表达融合蛋白质Red-STAT1,而且在IFN-α刺激下,Red-STAT1可由细胞质向细胞核转运,同时发现,坦布苏病毒感染能够有效抑制STAT1分子的核转运。

耐热保护剂提高鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗保存效果研究

为提高鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗的耐热性能,根据前期研究设计了3个耐热保护剂配方,比较不同配方对疫苗的抗原冻干损失、温度耐受性和保存期的影响。结果显示,保护剂TS11、TS37、TS51所制备疫苗的抗原冻干损失均在0.5 lg以下,相互之间差异不明显。但TS37所制备疫苗在37℃和45℃耐受后的抗原效价下降滴度明显低于TS11和TS51,这说明TS37具有更好的耐热保护效果。另外,25℃、2~8℃保存试验显示,配方TS37可使疫苗在室温下至少能保存1个月、冷藏条件下至少保存27个月而抗原含量和攻毒保护仍能达到质量标准要求。因此,本试验研制成功针对鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗的耐热保护剂TS37,该保护剂可使疫苗实现2~8℃下长期保存。

猪支原体肺炎活疫苗(168株)滴鼻免疫保护效果的研究

本研究通过滴鼻免疫新途径免疫猪支原体肺炎活疫苗168株,与肺内免疫组及对照组进行比较,来确定滴鼻免疫猪支原体肺炎活疫苗(168株)的免疫保护力。将20只猪随机分为肺内免疫组、滴鼻免疫组、健康对照组和攻毒对照组。定期观察和检测各组猪免疫后的临床症状。结果表明:滴鼻免疫组免疫后,猪群体温正常,无免疫引起的局部或全身不良反应,免疫途径安全可行;滴鼻免疫组和肺内免疫组与健康对照组相比,SIgA水平显著升高,差异极显著(P<0.01),但滴鼻免疫组与肺内免疫组相比,差异不显著。流式细胞仪检测显示CD4+数值未发生显著性变化。肺脏剖检评分显示滴鼻免疫组的肺脏的病变水平与攻毒对照组相比呈极显著降低(P<0.01),保护率达到60%,相对低于肺内免疫组100%的保护率。猪支原体肺炎活疫苗(168株)通过滴鼻免疫方式,可以产生较好的免疫保护力。

猪肺炎支原体醛缩酶原核表达及致猪气管上皮细胞凋亡的研究

为了研究Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶(FBA)是否为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的毒力因子,并参与其致病作用,根据已发表的猪肺炎支原体醛缩酶全基因序列设计特异性的引物,以猪肺炎支原体168株基因组为模板,通过Overlap PCR点突变扩增醛缩酶基因。将FBA克隆至pET-28a(+)载体后进行序列测定和分析,结果表明,FBA基因全长864 bp。将构建的重组表达质粒pET-28a(+)/FBA转化至大肠埃希菌BL21(DE3),通过筛选获得阳性克隆,重组工程菌在IPTG诱导下成功获得表达融合蛋白猪肺炎支原体Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶(Mhp FBA),大小约为35 ku。纯化蛋白并接种于猪气管上皮细胞至FBA终浓度分别为0、10、50、100、150、200μg/mL,孵育24 h后进行上清中丙酮酸浓度的检测和细胞凋亡检测。结果上清中丙酮酸浓度随着FBA浓度的上升,出现先极显著上升(P<0.01)、后急剧下降的现象;细胞平均凋亡率依次分别为3.54%、10.91%、13.99%、27.19%、32.84%和40.71%,并随着FBA浓度的升高而升高,且相比阴性对照组差异均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。成功构建了Mhp FBA重组菌,表达获得了Mhp重组蛋白FBA,该蛋白可能为猪肺炎支原体的毒力因子,参与猪肺炎支原体的致病作用,从而为进一步开展Mhp致病机理和药物研究奠定基础。

鸭源坦布苏病毒株NJX-4的分离鉴定及部分生物学特性

采用vero细胞与鸡胚传代接种法,从江苏省南京市某肉鸭场发病鸭(临床表现为瘫痪、卧地不起、全身多器官出血)肝脏、脾脏病料组织中分离出1株病毒。RT-PCR结果排除了分离病毒为禽流感、新城疫、鸭减蛋综合征、传染性支气管炎、鸭病毒性肝炎、鸭瘟等病毒的可能性;禽坦布苏病毒特异引物扩增结果呈阳性。序列测定与分析结果显示,分离病毒与GenBank上登录和实验室保存的坦布苏病毒E基因序列同源性在99%以上;部分生物学特性结果显示,该分离病毒不能凝集鸡红细胞,且对乙醚、三氯甲烷敏感,可引起试验鸭感染发病。分离毒株NJX-4是一种新的坦布苏病毒,属于黄病毒科坦布苏病毒属,暂称为鸭坦布苏病毒。

猪肺炎支原体净化检测程序研究进展

猪支原体肺炎(猪气喘病)是由猪肺炎支原体引起的一种严重危害全球养猪业生产的传染病之一。很多国家,特别是西欧各国和北美,均通过彻底净化病原的方式来控制该病的爆发。实行净化程序必须对净化后的猪群进行各项检测以确定净化成功与否。然而,每个猪场采用的检测方案都不一样,也没有形成一个统一的阴性群标准。本研究就国外猪肺炎支原体净化后阴性群的检测方法和不同检测方案做一综述,给国内猪场实施气喘病净化后检测方案的制定提供依据。

2014年江苏省部分中小规模猪场PCV-2的流行病学调查

应用韩国JBT公司的PCV-2抗体检测试剂盒,对2014年江苏省农业科学院兽医研究所动物疫病诊断检测中心临床门诊收集的。来自宿迁、连云港、南通、盐城和徐州5市未进行PCV-2疫苗免疫接种的32个中小规模猪场的990份血清进行PCV-2的抗体检测,并对其中50份阳性血清进行PCV-2的PCR检测,以诊断和分析PCV-2在江苏的感染情况。抗体检测结果表明,990份血清样品平均抗体阳性率为83.8%。PCR检测结果显示:50份阳性血清的PCV-2检出率为32.0%。表明,PCV-2感染在江苏省中小规模猪场普遍存在。

高渗溶液条件下猪肺炎支原体形态和活性变化的研究

为研究高渗溶液对猪肺炎支原体（Mhp）形态、大小,以及活力的影响。Mhp经终浓度为1.8%NaCl的高渗溶液分别作用1、2、4、6、8min后,分别进行染色镜检、粒径分析仪测定粒径、CCU测定和PCR鉴定。结果表明：在高渗溶液作用不同时间后,从2min开始,Mhp皱缩变圆,且直径变小,菌体数量也快速变少至消失;测定的终CCU降低了一个梯度,且时间延长了1天;在作用不同时间后的样品中,PCR均能扩增出Mhp目的条带。经终浓度为1.8%NaCl作用1~6min,Mhp的形态大小发生了变化,且具有活性,这将为Mhp经肌肉注射进入血液循环研究和猪支原体肺炎活疫苗的新免疫途径研究提供参考数据。

人和动物支原体蛋白组学研究进展

支原体可感染人、动物、植物及细胞等,给人类、动植物健康和科研工作带来不利影响,危害巨大。目前,研究人员开始从蛋白质水平阐述病原菌的致病机制,研发新型疫苗和药物,从而控制支原体疾病的发生与危害。本文将近年来的人和动物支原体蛋白质组学的研究方法和研究成果进行综述,以为今后更进一步的研究提供参考。

自动测温技术用于猪瘟活疫苗兔体热型判定研究

比较无线自动测温技术与常规水银体温计对兔子体温检测的符合率合格后,将无线自动测温技术用于猪瘟活疫苗兔体热型反应的测定。研究结果表明,无线自动测温技术与常规水银体温计对兔子体温检测的符合率高达98.81%,温差≤0.5℃,且不受环境温度、湿度的影响,对被检动物安全。临床上分别用TOSHONGTM体温连续远程监测平台与常规水银体温计对96只伊拉兔接种猪瘟兔化弱毒疫苗进行兔体热型反应鉴定,2种测温方法对热型判定结果符合率为87.5%(84/96)。对存在鉴定差异的12只兔子的体温数据进一步分析表明,体温连续远程监测平台因高频率的实时监测,其鉴定结果的准确性与可靠性优于人工监测中的常规水银体温计。