2015—2017年江苏省水产品中副溶血性弧菌污染状况及毒力基因与耐药性

目的了解江苏省水产品中副溶血性弧菌的污染状况、毒力基因分布及耐药情况。方法 2015—2017年,采集市售水产品,分离培养副溶血性弧菌,用荧光定量PCR方法对副溶血性弧菌毒力基因(tdh、trh、tlh)进行检测,用微量肉汤稀释法对菌株进行15种抗生素药敏试验。结果从1 554份市售水产品样品中检出副溶血性弧菌阳性335份,检出率为21.56%;海产品中副溶血弧菌的检出率(31.19%)高于淡水产品(13.35%),差异有统计学意义(χ~2=72.65,P<0.01);流通环节采集的样本检出率最高(25.64%);267株菌均携带tlh基因,不携带tdh基因和trh基因;副溶血性弧菌分离株对15种抗生素有不同程度的耐药,耐药率高达93.88%,主要是对头孢唑啉耐药(95.51%);多重耐药率4.11%,最高耐受6大类10种抗生素。结论江苏地区水产品中副溶血性弧菌污染状况严重,流通环节水产品中副溶血性弧菌检出率较高,应重视耐药谱的变化和多重耐药菌,加强对副溶血弧菌的监测和防控。

2013年3月江苏省禽流感职业暴露人群H5N1抗体水平及影响因素分析

目的:调查H7N9流行初始江苏省职业暴露人群H5N1禽流感抗体水平及其影响因素。方法:分别使用香港株、广东株与安徽株抗原,用血清凝集抑制法(hemagglutination inhibition,HI)测定血清样本抗体滴度,计算几何平均滴度(geometric mean titer,GMT),统计分析影响抗体水平的因素。结果:检测职业暴露人群血清标本416份,性别与抗原株对职业暴露人群抗体滴度有显著影响。结论:江苏省职业暴露人群H5N1禽流感抗体滴度普遍较低。男性抗体滴度低于女性,广东株抗原与禽流感病毒现有流行株较为接近。

2012年江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒携带状况调查

目的了解江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）携带状况,探讨其可能的传播媒介和自然宿主。方法 2012年3月-12月在江苏省发现发热伴血小板减少综合征病例的7个市/县,采集鼠、牛、羊、刺猬、鸟类和蜱等动物标本,提取总核酸后,应用实时荧光RT-PCR法对标本进行布尼亚病毒S基因核酸的检测,阳性标本采用Vero细胞进行病毒分离。结果采集761只（管）动物,43只（管）检出SFTSV核酸阳性,阳性率为5.65%。采集3 728份标本,阳性49份,阳性率为1.31%。鼠的病毒携带率最高（6.84%）,蜱标本阳性率最高（4.94%）。除蜱标本外的3 647份标本中检出阳性45份,阳性率为1.23%,不同器官阳性率分别为淋巴结（50.00%）、血清（2.34%）、脾（1.64%）、心（1.64%）、肝（1.28%）、肺（1.09%）、脑（0.94%）、肾（0.73%）、血块（0.41%）。5月标本阳性率最高（4.01%）。从1份羊血清及其体表1份蜱标本中各分离出1株SFTSV病毒。结论鼠、牛、羊和蜱均可携带SFTSV,可能是其自然宿主或传播媒介。

一种基于NASBA技术的新型快速肠道病毒检测方法的应用研究

目的:基于核酸等温扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)荧光分子信标探针检测技术,进行肠道病毒的快速检测与辅助诊断。方法:根据Genebank上肠道病毒5′端非编码区序列,设计特异性引物与捕获探针,应用纳米技术对商品化磁珠进行偶联,NASBA方法进行扩增,NucliSens读数仪检测,荧光定量RT-PCR方法进行验证,同时验证NASBA方法的特异性、灵敏度和重复性。结果:该方法对肠道病毒具有高度特异性,与RSV等呼吸道相关病毒均无交叉反应,反应体系具有很高的稳定性。结论:本研究应用的肠道病毒NASBA检测方法特异、灵敏、快速简便,适用于肠道病毒的日常监测和爆发疫情的应急诊断。

逆转录-环介导等温扩增技术结合横向流动试纸条法快速检测肠道病毒

目的建立一种快速特异敏感的肠道病毒检测方法。方法针对肠道病毒保守区基因序列,设计6条逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)特异性引物,经过优化,用毛细管电泳及横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物,建立RT-LAMPLFD检测方法,并与荧光定量PCR法进行比较。结果 LFD与毛细管电泳法检测特异的RT-LAMP扩增产物具有同样的敏感度,RT-LAMP-LFD法检测肠道病毒与其他病毒无交叉反应,最低检出限为10拷贝RNA分子,与荧光定量PCR法检测结果一致性为99.2%。结论建立的RT-LAMP-LFD方法,具有较高的特异性及灵敏度,操作简单、快速且不需要昂贵的仪器设备,适合应用于基层实验室肠道病毒的快速检测。

江苏省医疗机构内镜清洗消毒现状及影响因素分析

目的了解江苏省医疗机构内镜清洗消毒现状,分析危险因素。方法采用问卷调查和现场采样检测方法,对江苏省医疗机构内镜消毒状况及其影响因素进行调查与分析。结果江苏省拥有内镜的医疗机构全自动清洗消毒机和超声清洗机配置率分别为21%和30%;负压吸引器、高压水枪和干燥装置配置率约70%左右;均配有流动水清洗槽和酶洗剂。仍然有67%的医疗机构使用戊二醛消毒内镜。消毒后胃镜、肠镜、支气管镜、喉镜管腔内及内镜冲洗用水细菌总数超标率分别为10.42%、17.95%、7.14%、14.29%和14.67%。影响内镜消毒管理水平的主要因素是缺乏投入和技术落后,存在由内镜引发医院感染的风险。结论江苏省医疗机构内镜清洗消毒不够规范,多数为手工清洗,消毒后内镜细菌污染超标率较高。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体,并探讨其在该病诊断中的作用。方法克隆NP基因,构建原核表达载体pComb3XSS-NP,并转化大肠杆菌Top10F′,经诱导表达,纯化获得6HIS-NP融合蛋白。以该融合蛋白免疫Balb/c小鼠,经杂交瘤技术制备NP的鼠源单克隆抗体。经鉴定后,选择1株1C8-C6进行大量制备、纯化,并偶联辣根过氧化物酶(HRP),用该酶标抗体对SFTSV感染人的急性期血清进行Western blot检测。结果成功表达、纯化SFTSV重组的NP。经小鼠免疫、细胞融合和ELISA筛选后,共获得4株鼠源单克隆抗体。具较高滴度的1C8-C6酶标抗体能与SFTSV感染人的急性期血清中的NP在Western blot水平上结合,而与汉坦病毒、登革热病毒感染人急性期血清及正常人血清不反应。结论 SFTSV NP的表达及其单抗的制备为该病的实验室诊断奠定了基础。

H5N1型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的筛选及其中和机制初步研究

利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,单抗8G10D7可对clade2和clade9的H5N1型禽流感病毒起中和作用.Western-blot及血凝抑制实验进一步证明了该单抗的结合位点位于HA蛋白的HA1亚基上.鸡胚感染病毒预防试验结果表明,8G10D7对禽来源的和人来源的H5N1型禽流感病毒均可达到100%的保护率;在治疗试验组中,8G10D7对禽来源的病毒感染具有较高的保护率,可达100%,对人来源的H5N1型禽流感病毒最高也可达87.5%的保护率.该抗体的获得不仅为H5N1型高致病性禽流感病毒的预防和治疗带来了希望,同时其中和位点的发现也为以后亚单位疫苗的研制提供新的思路.

单克隆抗体S2C4对2型志贺毒素及其亚型毒性的中和作用(英文)

纯化的2型志贺毒素(Shiga toxin2,Stx2)经福尔马林脱毒后免疫BALB/c小鼠制备Stx2单克隆抗体,用体外中和试验对具有中和活性的阳性抗体克隆进行初筛,对所获得的中和抗体的重、轻链同种型及结合特异性进行鉴定,其中和保护作用通过体内、体外中和试验加以验证,最后,中和抗体对Stx2亚型Stx2c和Stx2vha的中和谱用体内中和试验验证.结果显示,12株抗Stx2的阳性抗体克隆中,只有1株具有中和活性,命名为S2C4,其重、轻链同种型为G1/κ,其靶分子为Stx2的A亚单位,与Stx2的B亚单位或Stx1不结合.在体外中和试验中S2C4可有效中和Stx2对Vero细胞的杀伤作用,同样,S2C4可中和致死量的Stx2及其亚型Stx2c和Stx2vha对小鼠的毒性作用.该抗体有望成为治疗产志贺毒素大肠杆菌感染的候选分子.

高通量测序H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法的优化及应用

目的:建立一种较优的高通量测序H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法,用于H7N9禽流感病毒基因组监测。方法:分别以6碱基随机引物反转录生成单链cDNA,合成双链cDNA;流感病毒通用反转录引物U12反转录生成单链cDNA,6碱基随机引物合成双链cDNA;U12引物反转录生成单链cDNA,通用流感病毒全基因扩增引物混合物生成双链cDNA制备高通量测序模板、构建测序文库、测序并分析数据,比较3种方法对高通量测序效率的影响,并与传统Sanger测序方法比较其测序的准确性,选择其中较优的方法用于高通量测序。结果:以U12引物反转录cDNA,通用流感病毒全基因扩增引物混合物生成双链cDNA制备的高通量测序模板,在测序族生成数、覆盖率、单核苷酸多态性及读长等方面均优于另外两种方法。结论:本研究建立的H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法用于高通量测序具有准确性高,周期短,成本相对较低,可同时检测多个样本等特点,可用于大规模H7N9禽流感病毒基因组监测。

多孔“类碳糊电极”的羧基化及其对Escherichia ocli O157:H7的检测

以吡咯为前驱体,羧基化碳纳米管、石墨粉为填料和碳酸钙微球为模板直接诱导合成,制备出一种高灵敏的多孔"类碳糊电极"生物电化学传感器,讨论了羧基化碳纳米管含量、银染时间对检测结果的影响。结果表明,最佳羧基化碳纳米管含量为8%,最佳银染时间为12min,银的阳极溶出峰电流与E.ocliO157:H7浓度在1.0×104～1.0×106cells/mL范围内呈线性关系,其线性回归方程为:IP=-5.582+1.972logC,相关系数(R2)为0.9912,检出限为5.1×103cells/mL,实现了对E.ocliO157:H7快速、准确地检测。

羊及其体表蜱中SFTSV的分离培养与全基因序列分析

目的 调查2012年春季江苏省某县羊及其体表蜱中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）感染情况,并对分离到的毒株进行全基因序列分析.方法 采用荧光定量RT-PCR法对标本进行SFTSV核酸检测,所有阳性标本进行病毒分离并测序,序列结果用Lasergene和MEGA4软件进行拼接和分析.结果 7只羊和从羊体上采集的93只长角血蜱中,1只羊的血清和淋巴结SFTSV核酸检测呈阳性,附着于该羊体表的1只长角血蜱病毒核酸也呈阳性,通过病毒分离获得2株SFTSV毒株,JS2012-yang01（羊）和JS2012-pi01（蜱）.序列分析结果显示,JS2012-yang01和JS2012-pi01的L、M和S基因片段的核苷酸同源性分别为99.8％ 、99.8％ 、100.0％,氨基酸同源性分别为99.6％ 、99.6％、100.0％,进化树分析显示两株病毒处于同一亚分支.2株毒株与中国其他地区流行的SFTSV毒株核苷酸序列同源性介于95.9％～～ 99.6％（L基因）,94.7％～～99.5％（M基因）和95.0％～99.5％（S基因）,与布尼亚病毒科白蛉病毒属其他毒株序列差异较大.结论 该调查中分离自羊和蜱的SFTSV高度同源.蜱虫通过叮咬吸血,可能在SFTSV从动物到人的传播过程中起媒介作用.

重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。

基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

目的建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法。方法针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件。用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法。进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较。结果以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应。RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P>0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918)。结论建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测。

人源Fab抗体库的构建和抗HBsAg抗体的筛选和鉴定

目的构建人源Fab抗体文库,筛选抗HBsAg抗体片段并进行初步鉴定。方法收集20份临床检验废弃的成人乙肝感染者淋巴细胞,抽提总RNA,逆转录成cDNA,构建抗乙肝病毒人源免疫型Fab抗体文库。以HBsAg包板进行4轮循环的吸附-洗脱-扩增,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,对阳性克隆进行可溶性表达,并用ELISA对其特异性进行鉴定。结果构建的人源Fab型抗体文库的库容为2.0×108,并具有良好的多样性。经过4轮筛选,成功获得4株能与HBsAg结合的人源抗体克隆,分别命名为hFabHB1、hFabHB2、hFabHB3和hFabHB4。对其中的hFabHB1进行可溶性表达,ELISA鉴定阳性。结论成功构建了抗乙肝病毒人源免疫型Fab抗体文库,从中筛选获得的4株人源Fab抗体片段有望在乙型肝炎的预防和治疗上发挥作用。

人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选、鉴定

目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定。方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞,用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库。以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后,随机挑选60个克隆用Phage ELISA、BstOⅠ酶切片断分析进行检测,阳性克隆作可溶性表达和鉴定。结果:构建的Fab噬菌体抗体库的库容为1.2×109,从中筛选到1株与c-Met特异性结合的人源抗体克隆,命名为AM2-26。DNA序列分析证明为人免疫球蛋白可变区基因,Western blot证实为人源抗c-Met Fab抗体片段,ELISA特异性鉴定阳性。结论:构建了大容量人源天然Fab抗体库,从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,有望为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子。

慢病毒介导的H7N9禽流感病毒血凝素基因快速真核表达系统的建立

目的利用慢病毒载体构建新型H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因的快速真核表达体系,在人胚肾细胞(HEK293T)中表达并进行功能鉴定。方法提取H7N9禽流感病毒基因组RNA,采用反转录PCR技术扩增HA读码框全长基因,将HA基因连接pMD18-T载体构建pMD18-T-HA重组载体。设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-HA质粒中扩增出平末端HA基因,采用Topo克隆构建表达载体pLenti-HA-V5。将表达载体转染HEK293T细胞,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法鉴定HA蛋白的表达,通过血凝实验鉴定重组蛋白的生物学活性。结果经反转录PCR获得1 683 bp的HA全长基因,完成真核表达载体的构建并表达出相对分子质量(Mr)为70 000的重组蛋白。IFA和Western blot法结果显示该蛋白与阳性血清具有良好的免疫反应,同时血凝实验证实其具有血凝活性。结论成功利用慢病毒载体建立了HA蛋白的快速真核表达系统,为研制H7N9病毒亚单位疫苗、中和表位研究、假病毒包装奠定基础。

寡核苷酸阵列芯片快速鉴定大肠杆菌O_(157):H_7初步研究

目的设计、制作一种微型化寡核苷酸阵列芯片,评价快速鉴定肠出血性大肠杆菌O157:H7的效果。方法多重PCR扩增大肠杆菌O157:H7七个特异性基因位点(rfbEf、licH7i、ntimin、Shiga-like toxins I and II、hemolysin A和uidA),通过PCR反应掺入SpectrumOrangTM-dUTP获取荧光标记的靶序列,与制备的芯片寡核苷酸探针杂交。结果寡核苷酸阵列芯片检测结果与试验预期相符,获取的杂交图分辨效果明显优于多重PCR琼脂糖凝胶电泳。结论基于玻片的寡核苷酸阵列芯片制作简便,鉴定病原菌检测细菌毒力因子快速、灵敏、特异,有良好的应用前景。

时间分辨荧光免疫分析法检测产志贺毒素大肠杆菌

目的基于时间分辨荧光免疫分析技术,建立高灵敏性、高特异性的产志贺毒素II(StxⅡ)大肠杆菌(STEC)全自动超微量检测方法。方法以StxⅡ单克隆抗体S1D8包被96孔板,采用双功能螯合剂异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸络合Eu3+标记StxⅡ单克隆抗体S2C4,以β-二酮体为主的增强液为发光增强系统。建立StxⅡ双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法,并其对特异性、检出限、健全性进行评估。结果建立以StxⅡ为靶标的时间分辨荧光免疫法检测STEC法,检出限为0.023μg/L,与产StxI的STEC无交叉反应;平均回收率为98.95%,批内、批间CV分别为3.5%和4.7%。该方法灵敏性和特异性分别为100.0%和97.4%,阳性预测值和阴性预测值各是92.6%和100.0%,误诊率和漏诊率则分别是2.6%和0,假阳性率和假阴性率分别是2.6%和0。TRFIA检测StxⅡ毒素的诊断符合率为98.1%;约登系数为0.974,Kappa检验u系数为0.95。结论 StxⅡ时间分辨荧光免疫分析法灵敏度高、稳定性好,具有很好的临床应用前景。

抗体组库技术研究进展

抗体组库技术主要用于研究免疫系统中B细胞编码的全部抗体信息,经历了B细胞Sanger测序、抗体分子质谱分析和高通量测序等3个发展阶段,该技术的发展正不断改变人们的传统认知。高通量测序技术使抗体组库容量不断提高,偏差不断减小;而分析软件的不断更新大大提高了在海量数据中发现低拷贝数稀有序列和其他相关生物信息的可能性。抗体组库技术可用于快速制备特异性人源抗体,B细胞源性恶性肿瘤和自身免疫性疾病的早期诊断、治疗效果评价、病情监测,感染性病原致病机理的研究,以及疫苗的研发和优化。它为科学家打开了一个窥视免疫系统的窗口,使人们能够从生物信息学的角度去理解疾病与健康的关系。