非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示:成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,特异性强,所获抗体均识别p54蛋白C端127—146 aa肽段。本研究成功获得了ASFV p54蛋白和p54单克隆抗体,并鉴定了6株单克隆抗体的抗原表位,为p54蛋白功能研究和ASFV新型表位疫苗研究奠定了基础。

我国酒精性脂肪肝病的研究进展

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)是过量饮酒引起的肝细胞损伤性疾病,表现为渐进性的肝脏脂肪变性、肝炎和肝硬化。目前我国人民的生活水平不断增高,酒类产品的消耗量也逐年递增,从而导致人群中酒精性脂肪肝病的发病率明显上升。本文就我国酒精性脂肪肝病的流行状况、易感因素、发病机制和预防治疗等方面作一概述,并对瘦素(leptin)在酒精性脂肪肝病治疗中的作用进行展望。

AAV-SaCas9敲除MSTN基因病毒的构建及鉴定

为了研究肌肉生长抑制素(MSTN)的相关功能,应用分子生物学方法构建敲除MSTN的AAVSaCas9载体,通过转染293T细胞提取基因组后进行T7酶切鉴定、TA克隆及测序确定该基因的敲除效果;将鉴定正确的AAV-SaCas9重组质粒与pHelper质粒共转染AAV-293细胞3 d后,分离纯化病毒并用实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。结果显示,成功构建了敲除MSTN基因的AAV-SaCas9重组载体,T7酶切和测序鉴定出sgRNA2位点可以对MSTN进行编辑,并成功将其包装成病毒,经荧光定量PCR鉴定病毒滴度为2.73×10^(12)vg/mL。

猪cGAS基因的克隆与原核表达

【目的】环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,c GAS)是近期在哺乳动物细胞中发现的一种新型核酸转移酶,能够识别胞质DNA,催化ATP和GTP生成第二信使c GAMP,继而通过STING依赖的方式活化转录因子IRF3,启动机体固有免疫。通过构建含猪c GAS基因的重组质粒p Bb B3a-His6-Nus A-c GAS,进行原核表达,得到c GAS蛋白,为进行体外催化合成c GAMP及探讨其在天然免疫过程中的作用奠定基础。【方法】以猪脾脏c DNA为模板克隆猪c GAS的蛋白编码区(open reading frame,ORF),用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体p Bb B3a-His6-Nus A-LIC中。菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序。将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中。当细菌生长到对数期时,丙酸钠诱导表达His6-Nus A-c GAS融合蛋白,用20 mmol·L^(-1)丙酸钠在20℃,180 r/min分别诱导0、2、4、6、8、10 h,以确定最佳诱导时间;然后,分别用0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 mmol·L^(-1)的丙酸钠在20℃,180 r/min诱导6 h,以确定最佳诱导丙酸钠诱导浓度;另外,分别在20℃,30℃,37℃条件下用20 mmol·L^(-1)丙酸钠,180 r/min培养6 h,以确定最佳诱导温度。筛选最佳诱导条件,并用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。【结果】(1)本试验成功克隆了猪c GAS基因,其ORF长度为1 494 bp;(2)构建了c GAS丙酸诱导型原核表达载体p Bb B3a-His6-Nus A-c GAS;(3)His6-Nus A-c GAS融合蛋白在37℃,添加20 mmol·L^(-1)丙酸钠,诱导6 h时表达量最高。(4)His6-Nus A-c GAS融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有表达,相对分子质量为111.87 k D。【结论】运用大肠杆菌表达系统成功表达了c GAS融合蛋白,本试验为体外表达c GAS融合蛋白提供技术方法。

CFTR基因在小鼠肠道组织中的差异表达

目的研究肠道组织CFTR基因表达与分泌性腹泻发生的关系。方法选取KM小鼠24只,雌雄各半,随机分为3组(每组8只):对照组经小鼠腹腔注射0.2 mL生理盐水,实验组小鼠经腹腔注射LPS[6 mg/(kg·bw)]分别作用1 h、8 h,于注射后通过小鼠精神状态、肠道组织形态学判定分泌性腹泻模型的建立,利用荧光定量PCR法检测各段肠道组织CFTR基因的表达。结果 LPS成功诱导小鼠发生了分泌性腹泻;CFTR基因在小鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠组织中均有不同的表达丰度,以结肠最高,但各段肠道间差异不显著;与对照组相比,LPS上调了十二指肠、空肠和回肠CFTR基因的转录,下调了结肠CFTR基因的转录。结论提示肠道组织CFTR基因转录水平的上调与LPS诱导分泌性腹泻的发生密切相关,且在各肠段发挥的作用不同,其中空肠在氯离子(Cl-)分泌中发挥主要作用,结肠的作用最弱。

猪Lipin基因克隆及其组织分布的研究

采用逆转录PCR、电泳检测等方法，成功克隆得到了猪的Lipin1、Lipin2和Lipin3基因。这3个基因与小鼠的相应基因均具有较高的同源性，达83．2％～86．7％。组织分布结果显示：Lipin1广泛分布在猪的多种组织中，但Lipin2和Lipin3仅在肌肉、肺、回肠和睥中有分布。

靶向akirin2基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效率的测定

为了抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达,试验采用siRNA表达载体法构建了靶向akirin2基因的RNA干扰(RNAi)真核表达载体。首先针对akirin2基因设计并合成了相应的干扰序列,退火后将其与RNAi表达载体psiRNA-h7SKGFPzeo进行连接,构建成干扰载体akirin2-pshRNA0、akirin2-pshRNA1。将构建好的载体通过Turbofect转染试剂转染小鼠成肌细胞C2C12,通过荧光定量PCR检测其干扰效率,经酶切和测序鉴定所构建的akirin2基因RNA干扰载体与设计序列完全相符。结果表明:重组干扰载体akirin2-pshRNA0和akirin2-pshRNA1构建成功。将重组RNAi载体转染C2C12细胞,与正常对照组相比,转染akirin2-pshRNA1组的akirin2基因mRNA相对表达量显著降低,表达量下调了60.62%(P<0.05)。说明试验构建的靶向akirin2基因的RNAi载体akirin2-pshRNA1可以有效地抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达。

分泌性腹泻对小鼠钙激活Cl^-通道基因表达的影响

目的探讨肠道组织钙激活Cl^-通道(CLCAs)基因表达与分泌性腹泻发生的关系。方法选取昆明小鼠24只,雌雄各半,随机分为3组:对照组、实验1h和8h组,每组8只。对照组小鼠经腹腔注射0.2ml生理盐水,实验组小鼠经腹腔注射脂多糖(LPS,6mg/kg)分别作用1h和8h,于注射后观察小鼠活动特征及肠道组织形态,以判定分泌性腹泻模型的建立,利用实时光定量PCR法检测各段肠道组织CLCAs基因的表达。结果 LPS成功诱导小鼠发生了分泌性腹泻;小鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠中均有CLCAs基因的转录;注射LPS后,十二指肠、空肠、回肠和结肠的CLCA1、CLCA2、CLCA3、CLCA4、CLCA6基因转录水平均发生上调,与1h组相比,8h组各基因转录水平显著上调。注射LPS后,十二指肠未检测到CLCA5的表达,但空肠、回肠CLCA5的表达均上调。结论 LPS引起的分泌性腹泻与各肠段CLCAs基因的差异表达有关。

猪akirin2基因的组织表达谱及序列分析

克隆猪的akirin2基因,并对该基因在猪的18个组织中的分布进行研究。猪akirin2基因编码区全长为612 bp(Gen Bank登录号KC140110.1),推测的氨基酸序列包含203个氨基酸,为酸性蛋白。利用BLAST工具对克隆到的猪akirin2基因序列与人、大鼠、小鼠、绵羊和牛的序列进行同源性比较。采用软件对氨基酸序列进行分析,用相关序列的比对结果进行系统进化树分析。组织分布结果显示,猪akirin2基因在脑组织中高表达,在淋巴、睾丸中表达量相对较低,在心脏、十二指肠、直肠、皮肤、胸腺中几乎检测不到该基因的表达。序列分析结果显示,猪akirin2基因与绵羊和牛的同源性最高,均为96%,与人、小鼠、大鼠的同源性分别为95%、91%、89%。氨基酸序列分析发现,存在1个10个肽的核定位信号序列19-PASPKRRRCA-28,推测的氨基酸序列的二级结构中含有2个a-螺旋。在重建的系统进化树上,几个不同物种的akirin2蛋白分成3支,结果表明猪akirin2与人、牛和羊的亲缘关系比其与小鼠和大鼠的近,与鸡的亲缘关系最远。

猪硫辛酸合成酶基因的克隆及组织表达

本试验通过电子延伸及RT-PCR技术克隆猪硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,Lias)基因,并进一步研究了该基因在猪体内组织的表达分布。基于电子延伸序列设计1对引物,成功克隆了猪Lias基因(GenBank登录号:JN797612.1),并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了Lias基因的组织表达规律。克隆的猪Lias基因长度为1119 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码372个氨基酸;克隆的猪Lias基因与小鼠、褐鼠、人、牛的核苷酸序列同源性分别为71.5%、69.0%、77.3%、70.4%;推导的cDNA编码区(CDS)的氨基酸序列与小鼠、褐鼠、人、牛的同源性分别为91.5%、79.4%、89.4%、88.2%;构建的系统进化树结果显示,猪与小鼠、褐鼠的亲缘关系最近;组织表达分布结果表明,Lias基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、直肠、回肠、脂肪、皮肤和肌肉中都有表达;Gel-Pro软件分析结果表明,Lias基因在肾脏和脂肪组织中表达丰度最高,其次是直肠和回肠。

合理认识和正确对待转基因

随着越来越多的转基因产品投放到市场,关于转基因安全的问题逐渐为人们所关注。由于人们对生物技术与转基因的了解不一,所以对转基因食品消费和安全的认知也有差异。本文对转基因技术、转基因安全及国家相关法律进行了阐述,以期增强广大群众对转基因的认识,使转基因发挥更大的社会效益。

炎症相关miRNAs在LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎性反应中的表达及miR-223真核表达载体的构建

小分子RNA(miRNA)是近年来发现的一类内源性、非编码单链小RNA,其在乳腺组织免疫防御过程中发挥的调控作用逐渐引起了人们的关注。作者拟用qRT-PCR检测炎症相关miRNAs在LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应中的表达变化;构建3种miR-223真核表达载体并检验重组载体的转染效率。用不同浓度LPS处理小鼠乳腺上皮细胞(EpH4-Ev)48h,qRT-PCR检测miR-223、miR-146a、miR-181a和miR-155的表达变化。以EpH4-Ev细胞基因组DNA为模板,PCR扩增pre-miR-223序列,以质粒Minicircle、pcDNA3.1(+)和转座子piggyBac为母本构建3种miR-223真核表达载体,将其转染EpH4-Ev细胞,通过观察荧光、qRT-PCR检测miR-223的表达,评价重组质粒转染效率。结果:qRT-PCR检测结果表明,LPS诱导EpH4-Ev细胞炎症反应时,4种炎症相关miRNAs的表达均显著(P<0.05或P<0.01)增加,并呈现不同程度的剂量依赖性;重组质粒转染EpH4-Ev细胞后,qRT-PCR检测结果显示,Mini-miR-223质粒转染组的miR-223表达水平无统计学差异(P>0.05);PBmiR-223和pcDNA-miR-223转染EpH4-Ev细胞后,miR-223的表达均极显著(P<0.001)增加。本研究表明炎症相关miRNAs参与LPS诱导小鼠EpH4-Ev细胞的炎性反应过程。成功构建3种miR-223真核表达载体,为后续miRNAs在乳腺炎症反应中的功能研究奠定基础。

猪伪狂犬病毒变异株HN1201 gB蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得用于伪狂犬病毒(PRV)临床检测和实验室研究所需的PRV gB特异性抗体,以PRV变异病毒株PRV HN1201免疫小鼠,取免疫后小鼠脾脏细胞与SP/20细胞融合,制备抗PRV gB蛋白的单克隆抗体。经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接免疫荧光试验(IFA)筛选出1株稳定分泌PRV gB蛋白抗体的单克隆细胞系,经鉴定该细胞系所分泌抗体为IgG1亚型,腹水纯化抗体的IFA效价为2^-11;细胞培养上清和腹水纯化抗体用于Western blot的最佳稀释比分别为1∶50和1∶5000;杂交瘤细胞诱导小鼠腹水的中和效价为1∶25。IPMA、IFA及Western blot试验结果显示,制备的单克隆抗体能特异性识别PRV gB蛋白。

禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备禽腺病毒血清4型(FAdV-4)纤突蛋白(Fiber2)的特异性单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NusA-Fiber2作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得3株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的杂交瘤细胞株2G5、2G8、4C2,取细胞株2G5制备腹水并纯化,利用间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot鉴定该单抗的特异性。用制备的单抗包被酶标板,通过一系列的优化,建立了FAdV-4 Fiber2双抗夹心ELISA检测方法。通过逐步截短分析鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明:成功获取3株单克隆细胞株2G5、2G8、4C2。MAb 2G5可与原核表达纯化的Fiber2蛋白及FAdV-4特异性反应。建立的双抗夹心ELISA检测方法具有很好的特异性、灵敏性和重复性。该MAb识别的表位序列是N端aa1—33。本研究成功制备了具有良好Western blot和IFA反应原性的单克隆抗体,为Fiber2蛋白功能研究和FAdV-4新型表位疫苗商品化研发奠定了基础。

干扰素基因刺激因子基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响

研究干扰素基因刺激因子(STING)基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。用CRISPR/Cas9技术敲除猪肺巨噬细胞系(3D4/21)的STING基因,用T7核酸酶检测靶基因敲除效率,用细胞计数试剂盒检测基因敲除细胞的活力,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒PRV-GFP感染基因敲除细胞,用流式细胞术检测感染细胞的荧光强度,用定量RT-PCR检测PRV的gB、TK基因表达及其感染细胞的IL-1β、IFN-β、ISG15基因转录,用Western blot检测PRV gE蛋白表达水平,用病毒滴定法测定子代病毒滴度。结果显示:设计的3个STING基因外显子2特异sgRNA均能切割3D4/21细胞的靶序列,其中sgRNA3的基因编辑效率最高;对sgRNA1介导STING基因敲除系进行克隆化,获得基因敲除细胞系3株,基因敲除对细胞活力无影响;亲本细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占80.77%,STING基因敲除细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占95.55%;STING基因敲除对PRV基因表达具有促进作用,亲本3D4/21细胞的病毒滴度为106.2 TCID50·0.1 mL^-1,STING基因敲除细胞的病毒滴度为108.3TCID50·0.1 mL^-1,病毒感染细胞的IL-1β、IFN-β和ISG15转录下调明显。STING基因敲除能促进PRV在3D4/21细胞中复制,可能与感染细胞的IL-β、IFN-β和ISG15表达抑制有关。

新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测

目的检测新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,及其免疫活性。方法采用融合表达的方法将HN蛋白基因分别与Grifin、谷胱甘肽S移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Nus A、小泛素样相关修饰物(SUMO)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白G(protein G)、γ-晶状体蛋白(γ-crystallin)、Ars C、Ppi B 10种融合标签基因采用柔性接头进行连接,构建10个重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,将这10个重组质粒分别转入大肠杆菌BL21中,用不同条件进行诱导表达,经SDS-PAGE检测并选出最佳诱导蛋白表达的条件,筛选出能够显著促进HN蛋白可溶性表达的标签,并用Western blotting对所表达蛋白的含量进行定性分析,同时纯化的重组蛋白用Western blotting和间接ELISA验证其免疫原性。结果成功构建了10个不同融合标签的HN融合蛋白表达载体,筛选出融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)能够显著促进HN蛋白可溶性表达,且Western blotting显示所表达重组蛋白的表达量是最多的。经Western blotting和间接ELISA验证重组HN蛋白具有良好的免疫原性。结论融合标签MBP可以显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。

仔猪水通道蛋白基因的克隆及断奶应激对其在胃肠道组织mRNA表达的影响

水通道蛋白（AQP）作为一种膜转运蛋白，对于调控肠道组织的水分子转运具有重要作用。本实验利用同源序列克隆法设计引物，从仔猪（Susscrofa）的消化道组织中克隆AQPs家族基因（AQP2-AQP11）（GenBank登录号分别为EU636238、

抗分泌性腹泻药物的研究进展

病理性腹泻是人和动物常见疾病症状之一,长期以来控制腹泻是医学上一个重点。基于肠病原菌及其产物诱导肠道分泌的机理,许多学者开展了相应的调控研究。肠细胞仍是直接研究和开发新药的主要焦点,随着新靶位ENS和促分泌素等发现。

口蹄疫病毒VP1蛋白可溶性表达标签筛选

为了提高口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,根据A型口蹄疫病毒核酸序列设计并合成了口蹄疫病毒VP1片段,将其克隆到p ET21b(+)载体上,设计1对通用引物扩增10个融合标签Grifin、GST、Nus A、SUMO、Thioredoxin、Protein G、γ-crystallin、Ars C、Ppi B、MBP,并分别将扩增的融合标签与VP1连接构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导其表达。SDS-PAGE结果表明,MBP、Grifin和GST能够促进口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,其中MBP与VP1融合表达蛋白可溶部分占60%;Western blot鉴定分析结果显示,小鼠抗His标签单克隆抗体能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了具有免疫学活性的融合蛋白MBP-VP1。

甘草酸单铵盐对蛋鸡肾功能的影响

为了研究甘草酸单铵盐对蛋鸡肾功能的影响,将320日龄健康海兰褐蛋鸡60只,随机分为5组。分别在饮水中添加质量浓度为0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的甘草酸单铵盐(MAG),自由采食与饮水,连续饲养21 d。试验期末检测各组蛋鸡肾脏指数、血清抗氧化指标、血清尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)和尿酸(UA),并通过HE染色和TUNEL染色观察肾脏组织病理学变化。研究结果表明:与对照组相比,给药组蛋鸡肾脏指数、BUN和丙二醛(MDA)水平差异不显著(P>0.05),超氧化物歧化酶(T-SOD)活性明显升高(P<0.05),CREA和UA浓度明显降低(P<0.05),且25 mg/L组蛋鸡肾脏组织病理学改变明显减轻。