临床生物化学和生物化学检验教学改革初探

临床生物化学及检验是医学检验专业的主干课程之一,也是一门发展非常迅速的重要应用性学科。通过改革实验教学模式和方法,优化重组实验教学内容,增加了综合性、创新设计性实验的比例,改革实验教学考核方式,导入案例教学法。探索以问题和课题为核心的教学模式改革,调动了学生学习的积极性和创造性,使学生得到了创新性科学研究的锻炼,培养了学生独立思维能力和初步从事科研的能力。

APPSWE转基因小鼠发育过程中视皮质神经元caspase-3的表达变化

目的：探讨APPSWE转基因小鼠发育过程中视皮质神经元凋亡规律。方法：取不同发育时间的（PO、P7、P14、P30、P90、P180）APPSWE转基因模型鼠与同时间点野生型小鼠，用Nissl染色法观察视皮质细胞形态，免疫组织化学观察视皮质细胞内caspase-3表达变化。结果：随着小鼠的生长发育，P14以后，模型组视皮质神经元caspase-3阳性细胞密度比对照组高。结论：APPSWE转基因小鼠发育中的视皮质神经细胞过度凋亡可能与阿尔茨海默病的发生、发展具有联系。

医学生物化学和生物化学检验教学改革初探

医学生物化学及检验是医学检验专业的主干课程之一,也是一门发展非常迅速的应用性学科。通过改革实验教学模式和方法,优化重组实验教学内容,增加了综合性、创新设计性实验的比例。同时,导入案例教学法,改革实验教学考核方式,探索以问题和课题为核心的教学模式改革,调动了学生学习的积极性和创造性,学生得到了创新性科学研究的锻炼,培养了学生独立思维能力和初步从事临床检验的能力。

DiI示踪标记固定脑组织内神经元及其突起的方法

目的：对DiI标记固定大脑皮质内神经元及其突起的技术进行改进,使操作更简单、便捷,效果更为高效、理想.方法：将DiI颗粒植入已固定小鼠大脑胼胝体,然后将标记后的脑组织放入4％多聚甲醛固定,于室温下避光孵育1～2周.结果：这种标记方法可以很直观地显示出大脑皮质神经元及其突起的精细结构,其中包括树突棘.结论：DiI示踪标记法可以用于标记固定脑内的神经元及其突起和树突棘,效果令人满意.

小鼠视网膜剥离及铺片改良应用于电生理学的研究

〔目的〕改良小鼠视网膜剥离及铺片方法,优化组织学观察及电生理学研究。〔方法〕选用C57BL/6J小鼠在立体显微镜下进行视网膜剥离铺片,然后用免疫荧光和Dil散射标记对其效果进行评估。〔结果〕改良后的方法能够较好地进行视网膜剥离铺片。用免疫荧光染色和Dil散射标记后,包括血管和神经细胞在内的许多组织学结构都能非常形象地观察到。〔结论〕经过改良的视网膜铺片技术能够应用于组织学观察或电生理学研究。

骨髓间充质干细胞研究进展

干细胞移植是目前治疗器官损伤、神经退行性疾病研究的热点,国内外学者分别对神经干细胞、胚胎干细胞等进行了探索,渴望从中找出细胞移植领域的候选细胞,但是这些细胞大多面临着伦理、来源、免疫排斥等多方面的问题.然而,近年来发现的骨髓间充质干细胞在一定程度上弥补了这一不足.骨髓间充质干细胞凭借其多向分化潜能、强大的自我复制能力和可移植性,成为细胞移植、基因治疗中重要的候选细胞.骨髓间充质干细胞移植为器官损伤、神经退行性疾病的临床治疗带来了新的希望,本文对其生物学特性及临床应用方面做一综述.

海马微环境对细胞分化和极性化的影响

目的观察海马脑片微环境对不同分化程度细胞的极性和分化的影响。方法将小鼠的海马脑片与5种不同分化程度的细胞(肝癌细胞、正常肝脏细胞、PC12细胞、正常神经细胞和骨髓间充质干细胞)进行共同培养,观察细胞的分化和极性产生情况。结果与对照组相比,与海马脑片共培养的细胞数量明显减少。共培养的细胞在海马脑片上的分布有一定的规律,主要集中锥体细胞层和颗粒细胞层,其他地方分布均匀,类似于脑片片层化的构筑。海马微环境下低分化的细胞受海马脑片微环境的影响可以产生极性并分化,高分化的细胞不能产生极性。结论海马微环境对细胞的极性和分化有促进作用,对生长和分裂有抑制作用,细胞的极性变化与自身和所处的微环境有关,特别对低分化的细胞极性和分化的影响较大。

慢性寒冷暴露与线粒体数量改变

目的建立慢性寒冷暴露模型,观察冷应激对线粒体数量、形态学调控蛋白及生物合成的影响并对其机制进行初步探讨。方法选取8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠40只,随机分为对照组和寒冷组,每组各20只。寒冷组于-4~0℃环境中饲养4周建立慢性寒冷暴露模型。采用Mito Tracker在体标记小脑皮质颗粒细胞线粒体的方法统计线粒体的数量,同时应用免疫荧光染色法和Western blotting技术,检测线粒体分裂、融合蛋白及转录辅激活因子过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)的表达情况。结果与对照组相比,寒冷组线粒体数量增多(P<0.01),线粒体分裂、融合蛋白及转录辅激活因子PGC-1α表达均显著增多(P<0.01)。结论慢性寒冷暴露可能通过诱导PGC-1α的高表达增强线粒体生物合成,增加线粒体数量;活化的PGC-1α协同冷应激促进线粒体形态学调控蛋白表达,构建新的分裂和融合的动态平衡,为机体适应低温环境提供高效率的产能机制。

MitoTracker对在体小鼠小脑和体外培养颗粒细胞线粒体的染色方法

目的：采用线粒体红色荧光探针MitoTracker标记小脑颗粒细胞线粒体，并与标记体外培养神经元线粒体进行比较，探讨MitoTracker标记在体脑细胞线粒体的实验方法。方法：在脑立体定位仪下，微量注射MitoTracker线粒体红色荧光探针到小鼠小脑皮质，继续饲养3d后，常规取脑、固定、切片，利用共聚焦显微镜观察线粒体标记情况。结果：共聚焦显微镜下，可观察到在体标记的神经细胞内颗粒样线粒体呈团块状分布，排列较体外培养神经元标记的杆状线粒体紧密。结论：MitoTracker线粒体红色荧光探针可用于标记在体小脑细胞的线粒体。

大鼠肝再生增强因子的基因克隆及序列分析

背景:肝再生增强因子是一种重要的次级肝再生因子,能够特异性地促进肝脏再生。目的:将乳鼠肝脏提取的RNA,利用特异引物克隆到肝再生增强因子基因,对其进行了生物信息学分析。设计、时间及地点:基因分子学体外实验,于2008-03/05在河南大学生命科学学院神经生物学实验室完成。材料:SPF级3日龄Wistar大鼠肝组织。方法:取3日龄Wistar大鼠肝组织,按异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法抽提肝组织总RNA,按分子生物学实验指南的步骤进行反转录-聚合酶链反应方法扩增目的片段,用凝胶回收试剂盒回收纯化目的基因,连接T载体,转入大肠杆菌,提取质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。应用分子生物学软件对测序结果进行分析。主要观察指标:聚合酶链反应扩增条带观察;测序结果分析;丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点的预测;系统进化树分析。结果:聚合酶链反应扩增结果与目的片段位置一致,测序结果表明为肝再生增强因子mRNA,基因全长378bp,在人、牛、小鼠、斑马鱼等物种中高度保守。结论:实验成功克隆了大鼠肝再生增强因子基因。

Reelin与小脑发育——Notch1信号通路的调节作用

目的探讨Reelin在小脑放射状胶质细胞、神经干细胞和普肯耶细胞迁移和分布中的作用,并探讨Notch信号通路在其中的作用。方法取WT小鼠和reeler小鼠胚胎9d至生后60d的脑部共148例,运用免疫荧光技术检测两组小鼠小脑发育中放射状胶质细胞、神经干细胞、普肯耶细胞及激活型Notch1受体的表达。结果Reeler小鼠小脑发育中放射状胶质细胞极性紊乱导致迁移阻滞于内颗粒层,过早分化,分子层中数量减少(P<0.01);Sox2阳性的干细胞启动迁移较慢,随后未得到适当的终止信号越过普肯耶细胞层进入外颗粒层,野生型小鼠该细胞并不迁移进入外颗粒层;普肯耶细胞多数不能迁移至分子层大量阻滞于内颗粒层中形成细胞团;激活型的Notch1受体在reeler小鼠小脑中表达减少。结论 Reelin在小脑神经干细胞、胶质细胞、普肯耶细胞发育和片层化分布中有重要作用,并且Notch1信号通路参与Reelin介导的小脑发育。

Reeler小鼠皮质片层化及细胞极性化

目的探讨Reelin在皮质片层化形成及细胞分化、极性化中的作用及相关机制。方法取reeler小鼠和野生型(WT)小鼠受孕17 d(E17)至出生21d(P21)各年龄点脑部共96例。免疫荧光标记技术与5’-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)法检测两组小鼠大脑发育中放射状胶质细胞、增殖的神经干细胞及极性蛋白的表达,并使用Nissl染色技术及Di I示踪技术分别对新皮质分子层发育、海马CA1区锥体细胞极性方位以及皮质锥体细胞极性程度进行统计。结果 Reeler小鼠大脑发育中齿状回内放射状胶质细胞数量减少,极性紊乱,Brd U阳性细胞散在分布,数量减少;由于极性细胞未得到适当的终止信号越过皮质Ⅱ层进入分子层,皮质片层化紊乱;大脑皮质及海马锥体细胞极性发生改变。结论 Reelin在神经细胞迁移、神经元增殖和皮质片层化的过程中发挥重要作用,尤其对锥体细胞极性起着至关重要的影响。

Reelin在阿尔茨海默病小鼠发病中的作用

目的探讨阿尔茨海默病(AD)小鼠病理改变、Reelin和Notch1的表达变化及DNA甲基化状态的改变,为深入了解阿尔茨海默病的发病机制提供理论依据。方法以淀粉样蛋白前体(APP)/早老素-1(PS1)双转基因小鼠为AD模型、同窝野生型小鼠为对照组,两组小鼠共计184只,利用高尔基染色、透射电子显微镜、免疫荧光染色、免疫印迹等技术检测AD模型鼠病理改变、Reelin和Notch1的表达变化及DNA甲基化状态的改变。结果AD小鼠在约6个月时开始出现淀粉样斑沉积、神经元纤维出现缠结等病理改变;AD小鼠发病后,星形胶质细胞和小胶质细胞在淀粉样斑周围聚集增多,随病情加重逐渐增加;Reelin在淀粉样斑周围聚积形成斑块,随病情加重逐渐增多;全长Notch1受体和其活性Notch细胞内片段(NICD)在AD鼠脑部表达减少;AD小鼠脑部甲基化状态减弱,淀粉样斑中有DNA片段,但甲基化状态消失,DNA甲基转移酶1(Dnmt1)和Dnmt3a在AD小鼠中表达减少。结论 AD小鼠脑内淀粉样斑沉积,促使胶质细胞聚集、Reelin聚积形成斑块、Notch1受体表达下降及甲基化状态减弱,进一步加剧AD神经功能紊乱。

Tbr1影响大脑皮质发育及细胞分化与迁移

目的探究Tbr1基因在大脑新皮质与海马发育过程中的功能。方法分别取胚胎16.5d、18.5d,出生后0d、3d、7d、14d昆明小鼠的脑组织,每个年龄点取材8~10(共52)只,常规固定脱水后石蜡切片,用免疫荧光检测小鼠大脑皮质、海马及齿状回神经细胞迁移与片层化发育过程中Tbr1的表达与分布情况。结果 1.在大脑皮质,Tbr1最早在皮质板广泛表达,随日龄的增加其表达逐渐向皮质板下层移动且最终定位于皮质的第Ⅵ层;2.相似地,齿状回处Tbr1在颗粒细胞层表达,P7之后其表达定位于颗粒细胞下层;3.根据其表达位置及组织发生规律,推测Tbr1阳性细胞即是皮质板内迁移中的新生神经元。结论 Tbr1是影响小鼠大脑皮质发育及神经细胞迁移与分化的关键分子。作为新生神经元的标记物,Tbr1参与细胞分化与迁移以及大脑皮质片层化的形成过程。

骨髓间充质干细胞的组织亲和性与脑片移植

目的检测骨髓间充质干细胞的组织亲和性、时间亲和性以及移植治疗神经元退行性疾病的可行性。方法应用组织细胞共培养和免疫细胞化学的方法观察骨髓间充质干细胞在不同组织的微环境下的黏附和向神经细胞的分化情况。结果与肝片、肺片相比,骨髓间充质干细胞在海马脑片上的黏附力最强;骨髓间充质干细胞在生后7d(P7)小鼠脑片上的黏附力最强,并随着年龄的增长呈逐渐递减的趋势;骨髓间充质干细胞在正常野生型小鼠和阿尔茨海默病小鼠脑片上都能向神经细胞分化,并且两者无显著差异。结论骨髓间充质干细胞更适宜用于脑部疾病的治疗,并且年龄越小移植效果越好。

视网膜血管老化与动脉粥样硬化形成的相关性

目的:探讨老年血管老化与动脉粥样硬化形成的相关机制,为老年急性致盲性疾病及动脉粥样硬化症的发生提供实验依据.方法:利用免疫组织化学方法和明胶墨汁灌流,显示成年和老年小鼠视网膜血管、小胶质细胞及白介素-1β(IL-1β)和动脉粥样硬化标志物单核细胞趋化因子1(MCP-1)阳性细胞发育和老化状况.结果:与成年小鼠相比,视网膜老化后血管体密度明显下降;小胶质细胞数量增加,体积变小,细胞表面突起的数量也明显减少;MCP-1在发生动脉粥样硬化组织的炎性细胞聚集处高度表达,在老化的视网膜中,MCP-1阳性细胞荧光强度增强,提示小鼠视网膜发生了动脉粥样硬化.老年视网膜IL-1β阳性细胞体积变大,数量增加,伴随大量星形胶质细胞的转化激活.结论:视网膜发生老化时,血管体密度的下降、小胶质细胞的激活和炎症因子的分泌促进了视网膜血管老化的发生和动脉粥样硬化的形成.

Reelin基因缺失对小鼠小脑浦肯野细胞迁移与极化的影响

利用免疫荧光双标、尼氏染色技术对不同发育阶段Reelin基因缺失的reeler小鼠与野生型小鼠小脑浦肯野细胞的发生及迁移进行形态学观察,同时比较和测量其极性改变的角度.结果显示,reeler小鼠小脑皮质在发育过程中片层化发生紊乱,浦肯野细胞未按正确位置迁移,其胞体直径和极性化角度改变显著,与野生型小鼠比较,差异具有统计学意义(P<0.01).以上结果说明,Reelin基因缺失使小脑浦肯野细胞极性改变,迁移受阻,提示Reelin蛋白在小脑皮质片层化形成的过程中发挥了至关重要的作用.