五种烟草根茎病害病原菌多重PCR检测方法的建立与应用

为了快速准确鉴别烟草根腐病菌(Fusarium oxysporum)、黑胫病菌(Phytophthora nicotianae)、立枯病菌(Rhizoctonia solani)、根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)和鸢尾丝囊霉菌(Aphanomyces iridis)等5种烟草根茎病害病原菌,利用RAPD分子标记等方法筛选和设计特异性扩增引物,优化多重PCR扩增体系中各引物添加量、退火温度、循环数等条件,建立多重PCR检测体系,并对其检测的可行性进行验证。本研究筛选并设计出F.oxysporum、P.nicotianae、R.solani、T.basicola和A.iridis的特异性引物对LD141 F/R、YM1002 F/R、LK111 F/R、GHFT F/R、AiT7 F/R,PCR反应体系中最佳引物组合浓度分别为1.0、1.0、0.2、0.5、0.5μmol/L,最适退火温度为54℃,最佳循环数为28,可同时扩增出大小分别为370、240、536、783、138 bp的特异性片段,能同时检出5种病原菌DNA的最低限值为0.5 ng/μL,可实现对烟草育苗基质和烟株中5种病原菌的快速检测,对烟草苗期根茎病害的早期预防具有重要意义。

烟草花叶病毒实时荧光定量PCR检测体系的构建

[目的]防止隐症携带烟草花叶病毒(TMV)的烟苗移栽到大田造成产量损失。[方法]根据TMV的外壳蛋白(coat protein,CP)基因保守序列设计引物及探针,通过绘制标准曲线、重复性、特异性及灵敏性分析,建立了一种TMV的TaqMan-qPCR检测方法。[结果]该方法特异性好,与其他常见的烟草病毒无交叉反应;灵敏度高,检测下限可达到4.53×10^(1) copies/μL,比常规RT-PCR检测灵敏度提高了10倍;建立的标准曲线斜率为-3.299,决定系数(R^(2))为0.9933,扩增效率为100.97%,且循环阈值(Ct)与质粒标准品浓度之间线性关系良好,重复性试验结果可靠。[结论]利用建立的TaqMan-qPCR检测方法与常规RT-PCR检测方法同时检测烟苗样品,检测结果一致,进一步验证了荧光定量PCR方法的可靠性。

河南烟草病毒病田间发生动态及种类监测分析

烟草病毒病是影响烟草生长的一种重要病害,其发生具有周期性、区域性等特点。为明确河南烟区近年来病毒病田间发生动态和主要病毒种类变化,采用系统调查方法调查豫南、豫中、豫西烟区病毒病田间发生动态,并利用酶联免疫吸附法检测采自豫南、豫中、豫西烟区的病毒病样本。结果显示,烟草病毒病的田间发生动态曲线呈S形,初发期是在烟草移栽后的25~30 d,60~70 d后达到高峰期,烟株成熟后进入稳定期。研究结果还显示,2017—2021年河南烟区主要病毒种类是烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)、烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)。

烟草祖先种及重要野生种PDR1基因的生物信息学分析

植物的多向耐药性(Pleiotropic drug resistance,PDR)转运蛋白隶属于ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白家族的G亚家族。该类蛋白参与植物多种初生、次生代谢物的跨膜运输,在植物的生长发育、响应逆境胁迫、解毒过程中起着重要作用。近年的研究还表明,该蛋白与多种植物对真菌病原的抗性有关。本文以烟草祖先种和重要野生种为研究对象,以拟南芥PDR12蛋白、烟草的PDR1基因为探针,通过搜索同源序列,从数据库中提取烟草及祖先种、重要野生种中的PDR基因、蛋白序列,并通过生物信息学分析手段对其编码蛋白的理化特性、氨基酸序列特征、蛋白结构、功能、启动子序列及表达调控特征进行了分析,并以本氏烟(Nicotiana benthamiana)NbPDR1为代表,预测了该基因启动子的顺式作用元件,以普通烟草(Nicotiana tabacum)NtPDR1基因为例,预测了其基因编辑位点。结果表明,这些PDR基因相似性高,均编码跨膜蛋白,具有典型的跨膜结构域和核酸结合结构域。该基因启动子区有多个与病原真菌诱导、干旱等逆境胁迫响应相关的元件,暗示该基因可能是抗真菌病害、响应逆境胁迫的广谱抗性基因。最后,本文预测的基因编辑位点,为烟草PDR基因的功能研究、基因编辑及抗病育种提供理论基础。

河南省烟区有翅蚜发生动态分析

为明确近年来河南省烟区有翅蚜的发生动态,采用黄皿诱蚜的方法调查分析了2016—2019年豫中许昌市襄城县、豫西三门峡市渑池县、豫南信阳市罗山县、豫东周口市鹿邑县烟田有翅蚜的发生量与发生动态。结果表明,襄城县烟区有翅蚜发生量2019年最多,为474.2头/皿,发生动态曲线为双峰曲线,4月中旬出现第1次小高峰,第2次高峰期出现在4月下旬至5月初,此时发生量远大于第1次小高峰;鹿邑县烟区有翅蚜年发生量2017年居多,为621.0头/皿,发生动态曲线除2019年外也呈双峰曲线,不同于襄城县的是,首次高峰期出现于4月中旬至5月下旬,其发生量大于5月下旬至6月初小幅度回升出现的小高峰;渑池县烟区2016年有翅蚜发生总量最多,高达656.6头/皿,迁飞动态高峰期出现在5月底6月初,高峰期明显较晚;罗山县烟区有翅蚜发生量每次调查均在8头/皿左右波动且动态曲线无明显规律可循。由此可知,河南省不同烟区不同年份有翅蚜的再次调查发生动态存在较大差异。

不同基因型烤烟对镰刀菌根腐病的抗性鉴定与评价

为明确不同基因型烤烟对烟草镰刀菌根腐病的抗性,利用10个烟草品种(系),采用粗毒素幼芽接种、带菌菌谷接种、孢子悬浮液培养等方法进行抗性鉴定。结果表明,供试品种对尖孢镰刀菌抗性表现出显著差异;对尖孢镰刀菌表现出抗的品种(系)有4个,分别是‘Y2001’、‘Y2002’、‘长脖黄’、‘664-01’;对尖孢镰刀菌表现出感的品种(系)有6个,分别是‘7710’‘、7713’‘、Y2007’‘、Y2008’‘、中烟100’、‘小黄金1025’。3种接种方法鉴定结果基本一致,共筛选出4个抗性品种(系)。

烤烟新品种渠首1号在南阳烟区的适应性评价

为了探讨烤烟新品种渠首1号在南阳烟区的生态适应性,本研究采用大区对比示范试验方法,以当地主栽品种云烟87作对照,对其农艺性状、抗病性、经济性状、原烟外观质量、物理特性及化学成分等进行分析研究。结果表明,渠首1号综合农艺性状整体优于对照品种云烟87,田间综合抗病抗逆性较强、成熟特征较好,平原区初烤烟叶产值明显优于对照品种,上等烟比例较高。由此说明,渠首1号在南阳烟区尤其是南阳平原区适应性较好,种植效益也较高,具有大面积推广种植的潜力。

烤烟新品系Y2001团棵期生理特性和产量产值对氮素的响应

为揭示烤烟新品系Y2001低氮条件下生长势强的内在机理,本研究采用大田小区试验法,以中烟100(Nicotiana tabacum cv.Zhongyan 100)为对照、烤烟品系Y2001为研究对象,测定不施氮、30 kg/hm^(2)(低氮)、60 kg/hm^(2)(中氮)和90 kg/hm^(2)(高氮)4个不同施氮水平下,两品种(系)烤烟团棵期生理和生长发育特性及氮素效应指标。结果表明,(1)与中烟100相比,Y2001叶片氮含量和干物质积累量均在低氮条件下增幅较大、中高氮条件下增幅较小,其氮素农学效率和氮肥表观回收效率表现为低氮处理显著高于中高氮处理,其氮素干物质生产效率则相反;氮肥梯度上,Y2001茎和根的氮素农学效率和干物质生产效率显著低于中烟100;Y2001各处理叶片氮素生产力均较高、根茎较低。(2)氮肥梯度上,Y2001叶片的叶绿素指数(Chl)相对稳定无显著变化、类黄酮指数(Flav)逐渐减小、氮平衡指数(NBI)逐渐增大,中烟100叶片的Flav逐渐减小、Chl和NBI逐渐增大;与中烟100相比,Y2001叶片的Chl无氮处理较高,各处理NBI均较高、Flav较低。(3)氮肥梯度上,Y2001根茎叶中氮磷钾积累量的增幅接近,中烟100钾的增幅大于氮和磷;与中烟100相比,Y2001根茎叶中氮和钾积累量表现为低氮处理较高、中高氮处理较低。(4)从产量和产值看,Y2001和中烟100最佳施氮量分别为30 kg/hm^(2)和60 kg/hm^(2)。综上,与中烟100相比,Y2001低氮时较强的养分吸收能力、较高的叶片氮素生产能力和干物质分配比例可能是其叶片生产能力较强的重要原因;而相对稳定的叶片氮含量和Chl、相对平衡的氮磷钾吸收能力可能是其叶片生产受土壤养分状况影响较小的重要原因;Y2001替代中烟100可在氮肥减施30 kg/hm^(2)的同时产值增加6600元/hm^(2)。

吡虫啉和啶虫脒对东亚小花蝽捕食行为和能力的影响

为明确吡虫啉和啶虫脒对天敌东亚小花蝽捕食行为和能力的影响,通过玻璃管药膜法用田间推荐使用剂量处理东亚小花蝽雌成虫,分析了这两种安全性较高的杀虫剂对东亚小花蝽雌成虫捕食行为、捕食量和捕食功能反应方程参数的影响。结果表明,经吡虫啉和啶虫脒处理后,东亚小花蝽雌成虫捕食行为中的搜寻、行走和取食时间分别显著减少了100.0 s和332.5 s、775.0 s和500.0 s、1117.5 s和1145.0 s;对棉铃虫卵的日捕食量分别为(4.89±1.36)和(3.56±0.73)粒,分别显著减少了1.55和2.88粒。各处理组对棉铃虫卵的捕食功能反应均符合HollingⅡ模型,但模型的各项参数均发生了变化,吡虫啉和啶虫脒处理后的捕食效能(分别为10.7363和7.0280)与最大寻找效应(分别为0.6139和0.4021)均显著低于对照(26.1909和0.7929)。因此,在田间推荐使用剂量下,吡虫啉和啶虫脒均可干扰东亚小花蝽捕食行为,减少其捕食量,并显著降低东亚小花蝽雌成虫捕食效能和寻找效应,对东亚小花蝽有显著的负面影响,这为协调天敌与杀虫剂科学使用、促进烟田害虫的可持续治理提供理论依据。

烤烟新品种渠首1号对低氮胁迫的响应

烤烟新品种渠首1号是云烟87的自然变异株,以云烟87为对照,采用霍格兰(Hoagland)营养液培养的方法,设置正常供氮和低氮2种条件处理水平,通过试验分析低氮胁迫对渠首1号和对照品种云烟87的影响。研究发现,低氮胁迫下渠首1号的农艺性状及生物量积累均明显高于对照品种云烟87;光合参数稳定性优于对照品种云烟87,受胁迫较云烟87轻;硝酸还原酶(NR)活性强于对照品种云烟87;根系形态指标优于对照品种云烟87,根系活力受胁迫程度较云烟87弱。即渠首1号比云烟87具有更强的耐低氮、耐瘠薄潜力,在其生产中可以减少氮肥用量,为渠首1号种植栽培技术和推广适宜区域提供一定的理论依据。

多粘类芽胞杆菌LB−9的诱变及抑菌防病效果研究

为获得对烟草疫霉菌生防效果更佳的拮抗菌株,对多粘类芽胞杆菌LB−9进行基因诱变。利用原生质体电转化法,构建了菌株LB−9的Tn−5转座插入突变体库,获得约2000个转化子,通过平板对峙法筛选出对烟草疫霉菌拮抗能力增强且效果稳定的突变菌株3个,其中编号为A13的突变菌株对烟草疫霉菌的抑制效果达到80%以上,与原始菌株LB−9的抑菌率相比提高了20%以上。采用室内盆栽接种法研究了正突变菌株A13对烟草黑胫病的防控效果,并利用实时荧光定量PCR法初步分析了其诱导烟株体内抗病相关基因的表达。结果表明,正突变菌株A13处理烟株7 d后,对烟草黑胫病的防效高于原始菌株LB−9,防效可达80%以上,同时可诱导烟株体内不同信号通路中抗性相关基因的上调表达。本研究为多粘类芽胞杆菌插入诱变育种方法研究提供了理论支撑,对烟草黑胫病的生物防治具有重要意义。

不同药剂对麦蚜天敌昆虫烟蚜茧蜂的影响

为明确生产上常用化学药剂对麦蚜天敌昆虫烟蚜茧蜂的影响以及烟蚜茧蜂的适宜释放时期,测试了45%戊唑醇·咪鲜胺、30%多酮、430 g/L戊唑醇3种杀菌剂和25%吡蚜酮、7.5%氯氟·吡虫啉、20%联苯·三唑磷3种杀虫剂共6种药剂对烟蚜茧蜂的毒性作用。结果表明,3种杀虫剂和3种杀菌剂在施药初期均对烟蚜茧蜂有影响,且杀虫剂对烟蚜茧蜂的毒性强于杀菌剂。6种药剂对烟蚜茧蜂成蜂的触杀作用强于胃毒作用。3种杀虫剂中,7.5%氯氟·吡虫啉的毒性最高;3种杀菌剂中,430 g/L戊唑醇的毒性最高。大田测试结果显示,供试杀虫剂中25%吡蚜酮对烟蚜茧蜂的影响最大,供试杀菌剂中45%戊唑醇·咪鲜胺对烟蚜茧蜂的影响最大。利用烟蚜茧蜂防治麦蚜至少应在化学防治3 d以后进行,田间需要进行化学防治时,应优先考虑对烟蚜茧蜂影响较小的多酮、联苯·三唑磷等药剂。

5种常用农药对东亚小花蝽生长的影响

[目的]了解农药对东亚小花蝽生长的影响。[方法]采用浸渍法,用5种常用农药分别处理东亚小花蝽卵。[结果]2%苦参碱水剂、430 g/L戊唑醇悬浮剂和30%噁霉灵水剂处理后的东亚小花蝽的卵,可以正常孵化、生长;10%虫螨腈悬浮剂处理后的东亚小花蝽的卵,虽然可以正常孵化,但孵化后48 h若虫存活率显著降低(P<0.05);20%呋虫胺可溶粒剂处理后的东亚小花蝽的卵,孵化率显著低于空白对照和其他处理(P<0.05),卵孵化后48 h若虫存活率也显著降低(P<0.05)。[结论]田间释放东亚小花蝽期间,要严格控制虫螨腈和呋虫胺的喷施,以免对其生长造成影响。

吡虫啉对烟田东亚小花蝽的安全性评价

为了评估吡虫啉对烟田东亚小花蝽(Orius sauteri)的安全性,采用药膜法测定了吡虫啉对东亚小花蝽成虫和若虫的急性接触毒性,并通过计算农田内危险商值(HQ),评价了烟田喷施吡虫啉对东亚小花蝽的安全性。结果表明,吡虫啉对东亚小花蝽一龄至五龄若虫和雌雄成虫的致死中浓度分别为0.5877、1.7421、2.4335、4.4011、4.5278、6.0872、2.9424 mg(a.i.)/L。吡虫啉在烟田最大推荐剂量[45 g(a.i.)/hm^(2)]下喷施1次,对东亚小花蝽成虫和三龄至五龄若虫的HQ<5,风险可以接受;对东亚小花蝽一龄和二龄若虫的HQ>5,风险不可以接受。吡虫啉在最大推荐剂量[45 g(a.i.)/hm^(2)]下喷施2次,对东亚小花蝽成虫和四龄若虫、五龄若虫的HQ<5,风险可以接受;对东亚小花蝽一龄至三龄若虫的HQ>5,风险不可以接受。吡虫啉最大推荐剂量对东亚小花蝽卵孵化的抑制率为36.42%,风险可以接受。因此,吡虫啉和东亚小花蝽联合使用控制害虫时要避开东亚小花蝽低龄若虫(三龄以前)高峰期喷施。

五种杀虫剂蘸根处理对烟蚜的防治效果

为了寻找投入低廉、简单高效的施药方式,采用盆栽试验和大田试验研究了烟苗移栽时用吡虫啉等农药蘸根处理对烟蚜[Myzus persicae(Sulzer)]的防治效果及对烟株生长发育的影响。结果表明,盆栽移栽时用吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺、呋虫胺、吡蚜酮蘸根处理,药后50 d内对烟蚜的防治效果均在97.84%以上;大田试验移栽时用吡虫啉等农药蘸根处理,持效期可达50 d,50 d内防效为20.41%~100.00%;移栽时用吡虫啉等农药蘸根处理,对大田烟草生长发育没有影响。5种杀虫剂可以通过蘸根的方式在烟草种植中使用。

生防细菌PA2101和PG3402抑菌和促生特性的研究

以本实验室分离的在烟草生产上具有较大生防潜力的铜绿假单胞杆菌PA2101和格拉纳达假单胞杆菌PG3402为对象,测定了这2株细菌的抑菌活性及促生特性。试验结果表明,菌株PA2101和PG3402对烟草根腐病、烟草赤星病、小麦纹枯病、芝麻茎点枯病和地黄轮纹病等多种作物常见病害的病原菌具有较强的拮抗作用;2株菌株的无菌发酵滤液能使烟草疫霉和根串珠霉菌丝生长畸形、抑制根串珠霉分生孢子的萌发。菌株PA2101和PG3402产生对2种病原菌有抑制作用的挥发性物质。抑菌特性检测结果表明,菌株PA2101和PG3402均能产生蛋白酶、纤维素酶和β-1,3-葡聚糖酶等胞外酶,PA2101还能分泌几丁质酶。另外,2株菌株能合成抑菌活性物质氢氰酸(HCN)。抗生素合成基因检测结果发现,菌株PA2101和PG3402均包含吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylicacid,PCA)合成基因,PG3402还含有2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinal,DAPG)合成基因。促生物质的检测结果表明,菌株PA2101和PG3402均可产生嗜铁素和生长素(IAA),且具备溶磷特性。综上所述,菌株PA2101和PG3402抑菌谱较广,产生多种抑菌和促生物质,含有合成PCA和DAPG的基因,可用于烟草病害的防控。

基于全基因组测序的贝莱斯芽胞杆菌Ba-0321抑菌机制分析及相关功能验证

贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis Ba-0321是从健康烟株根际土壤中分离获得的一株具有较强抑菌活性的根际促生细菌,具有较好的生防潜力和应用前景。本研究采用菌丝生长速率法测定菌株Ba-0321无菌滤液对烟草尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum和疫霉菌Phytophthoranicotianae的抑制效果,采用二代illumina与三代Nanopore相结合的测序技术,对菌株Ba-0321进行全基因组测序,并对测序数据进行基因组组装、基因功能注释及次级代谢产物合成基因簇预测等。结果表明,菌株Ba-0321无菌滤液对尖孢镰刀菌和疫霉菌均具有抑制效果,其中含有10%无菌滤液的培养基对两种病原菌菌丝生长的抑制率较高,分别达57.38%和34.30%。全基因组测序结果表明,菌株Ba-0321基因组大小为4099109 bp,共有编码基因3897个,基因组测序数据提交至NCBI获得GenBank登录号为CP101904。在GO、COG和KEGG Pathway数据库中有大量编码酶类、萜类化合物、聚酮化合物代谢途径和参与防御机制相关基因被注释。利用anti-SMASH预测到13个次级代谢产物合成基因簇,编码Surfactin、Fengycin、difficidin、Bacillaene、Bacillibactin、Macrolactin H、Bacilysin等多种抑菌活性物质。通过PCR扩增和序列测定分析,证实了Ba-0321菌株基因组中确实存在抑菌物质合成基因簇及防御机制相关基因。酶活测定结果表明,该菌株具有蛋白酶、几丁质酶和纤维素酶等抗性酶活性。本研究在基因组层面上解析了菌株Ba-0321的抑菌机制,为挖掘抑菌相关基因资源提供了分子基础,对该菌株的后续相关研究及应用具有重要意义。

呋虫胺对东亚小花蝽的安全性评价

【目的】探明呋虫胺对东亚小花蝽的安全性,为其生产应用提供依据。【方法】采用芸豆浸渍法探究呋虫胺对东亚小花蝽各龄若虫与成虫的毒力,以及取食量、产卵量和卵孵化的影响,评价呋虫胺对东亚小花蝽的安全性。【结果】呋虫胺对东亚小花蝽1龄、2龄、3龄、4龄和5龄若虫的LC_(50)分别为14.11 mg/L、40.80 mg/L、43.11 mg/L、41.28 mg/L和69.20 mg/L,对雄成虫和雌成虫的LC_(50)分别为45.75 mg/L和87.37 mg/L,即呋虫胺对东亚小花蝽1龄若虫毒力最强,对5龄若虫和雌成虫的毒力较弱。呋虫胺30.00 g/hm^(2)对东亚小花蝽的取食量和产卵量的相对抑制率分别为83.89%和84.29%(均>50.00%),其对东亚小花蝽取食量和产卵量的风险不可接受;呋虫胺60.00 g/hm^(2)对卵孵化的相对抑制率为33.38%(<50.00%),其对东亚小花蝽卵孵化的风险可接受。呋虫胺对东亚小花蝽1龄、2龄、3龄、4龄和5龄若虫的安全系数分别为0.07~0.18、0.20~0.51、0.22~0.54、0.21~0.52和0.35~0.86,除1龄若虫的风险评价为高风险外,2~5龄若虫均为中高风险;雌成虫和雄成虫的安全系数分别为0.44~1.09和0.23~0.57,风险评价为中高风险。【结论】呋虫胺推荐用量对东亚小花蝽若虫和成虫均存在中高风险,减半使用推荐剂量对东亚小花蝽的取食量和产卵量均产生抑制作用,采用东亚小花蝽防治害虫时不宜使用呋虫胺。

啶虫脒对东亚小花蝽的安全性分析

为了明确杀虫剂啶虫脒对捕食性天敌东亚小花蝽的安全性,采用药膜法测定了啶虫脒对东亚小花蝽若虫和成虫的毒力,并通过农田内危险商值评价了啶虫脒对东亚小花蝽的安全性。结果表明,啶虫脒对东亚小花蝽1龄、3龄、5龄若虫和成虫的LC_(50)分别为0.128 7 mg a.i./L、1.352 4 mg a.i./L、2.012 6 mg a.i./L和2.0301 mg a.i./L;在推荐剂量下,田间喷施2次啶虫脒对东亚小花蝽是不安全的,风险不可以接受,田间喷施1次啶虫脒对东亚小花蝽1龄若虫是不安全的,对3龄、5龄和成虫是安全的,风险可以接受。因此,建议在释放过东亚小花蝽的田块使用啶虫脒要谨慎。

不同饲料对东亚小花蝽生长发育及繁殖力的影响

【目的】探明适宜东亚小花蝽(Orius sauteri)规模化生产的饲料种类,为其规模化饲养提供理论参考。【方法】采用室内人工饲养的方法,研究评价若虫阶段饲喂不同饲料(清水、粘虫卵、粘虫卵+芸豆角、粘虫卵+芸豆角+10%蜂蜜水、芸豆角、10%蜂蜜水、10%蜂蜜水+芸豆角)对东亚小花蝽生长发育和繁殖力的影响。【结果】东亚小花蝽取食粘虫卵、粘虫卵+芸豆角和粘虫卵+芸豆角+10%蜂蜜水均可以完成正常的世代发育,其成虫获得率分别为58.33%、84.31%和86.27%,单雌产卵量分别为73.65粒、102.94粒和107.87粒,雌虫平均寿命分别为19.76 d、28.95 d和27.16 d;东亚小花蝽若虫取食清水、芸豆角、10%蜂蜜水及芸豆角+10%蜂蜜水均不能发育至成虫。【结论】粘虫卵+芸豆角+10%蜂蜜水可以显著提高东亚小花蝽成虫获得率和单雌产卵量,是适宜东亚小花蝽规模化繁育的饲料组合。