内蒙古牛呼吸道合胞体病毒的分离鉴定及其全基因组分析

为确定引起内蒙古地区3月龄~6月龄荷斯坦犊牛暴发呼吸系统疾病的病原,并分析其基因组序列,本研究对病死犊牛剖检并观察其各脏器的剖检病变,制备各组织病理切片,观察其组织病变。结果可见犊牛肺脏呈深红色有光泽的肌肉样实变,心脏肥大,肝脏表面散在细小的结节状灰白色病灶,肾脏表面散在细小深红色出血点;组织病理学观察可见典型间质性肺炎,多数各级细支气管腔和肺泡腔内巨噬细胞和淋巴细胞大量增生和浸润,偶见合胞体细胞,在各级细支气管部分黏膜上皮细胞浆内有大小不等的圆形红染的病毒包涵体;轻度纤维化和小坏死灶的变质性肝炎,急性炎性脾肿,多发性小出血灶的慢性硬化性肾小球肾炎。进一步进行RT-PCR检测,结果显示,扩增获得约600 bp的目的条带,测序后与GenBank中相关基因序列比对,结果显示目的基因与牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)美国分离株USII/S1(KU159366)的同源性最高(98.42%),表明该地区某牧场犊牛感染了BRSV。将该病例肺组织研磨上清液接种牛肾细胞(MDBK)盲传3代出现典型的细胞病变,经RT-PCR检测确认为BRSV,进一步表明分离到1株BRSV,命名为IM BRSV-39。分段扩增IM BRSV-39株的全基因组序列,经测序后拼接获得长度为15130 bp的BRSV全基因组序列。采用MegAlign软件分析IM BRSV-39株的全基因组序列、G基因序列和F基因序列的同源性及突变位点;采用MEGA 11软件构建分离株全基因组进化树分析其遗传进化关系。结果显示,IM BRSV-39株的全基因组序列、G基因和F基因序列均与BRSVⅢ亚型分离株相应基因序列的同源性最高、且位于同一进化分支,证实IM BRSV-39株属于BRSVⅢ亚型;突变位点分析结果显示:与BRSVⅢ亚型参考株相比,IM BRSV-39株G基因序列存在7个突变位点,F基因序列存在12个突变位点;G蛋白氨基酸序列存在4个突变位点,其中L13H处在G蛋白的胞质结构域(aa1~aa37);Y^(127)H、I^(139)T、P^(177)L、A^(186)T处在G蛋白的胞外结构域(aa66~aa257);F蛋白氨基酸序列存在5个氨基酸突变位点,其中M^(4)T、M^(7)T、S^(14)C处在F蛋白氨基末端信号肽区(aa1~aa26)。本研究检测并分离到1株BSRV,揭示了该病毒基因组的遗传进化特征,为国内BRSV的深入研究奠定了基础。

内蒙古地区神经致病型马疱疹病毒1型的分离与鉴定

为调查内蒙古四子王旗某马场马流产是否由马疱疹病毒1型(EHV-1)感染导致,本研究采集该场马流产胎儿肝、脾等组织,将组织研磨上清液接种MDBK细胞,盲传5代,待出现细胞病变时收集细胞及培养上清,通过gB基因的PCR及透射电镜对分离病毒进行鉴定,采用2代测序技术对分离病毒全基因组测序,并进行分离病毒gB基因的同源性及遗传进化分析。采用SnapGene6.0.2软件分析分离病毒ORF30基因及其编码氨基酸序列。结果显示,组织上清液接种MDBK细胞并盲传5代后,细胞出现典型的圆缩、融合、脱落和聚堆成葡萄串状等细胞病变特征;EHV-1 gB基因的PCR检测结果呈阳性;电镜观察可见疱疹病毒典型的形态特征,表明分离到1株EHV-1,命名为EHV-1-NM2021。同源性分析结果显示:分离株EHV-1-NM2021 gB基因序列与国内外EHV-1参考株gB基因序列的同源性为97.7%~100%;构建gB基因的系统发育进化树,结果显示该基因与EHV-1德国株(RacL11)、澳大利亚株(438-77)处于同一进化分支,亲缘关系较近。此外,ORF30基因序列及氨基酸序列比对结果显示,EHV-1-NM2021 ORF30基因nt2254为鸟嘌呤(G),aa752为天冬氨酸(D),该分离株为神经致病型病毒。本研究首次在内蒙古鉴定并分离到神经致病型EHV-1,丰富了国内EHV-1的流行病学数据库,为EHV-1感染所导致马流产的防控奠定了研究基础。

猫传染性腹膜炎病毒的检测及ORF 7 ab、N和S基因遗传进化分析

采用剖检、组织病理学和免疫组织化学的方法检测并确诊了2例猫传染性腹膜炎(FIP)病例,并通过RT-PCR扩增2例组织样品中猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的ORF 7 ab、N和S基因,测序后进行基因遗传进化分析,阐明病毒的遗传进化特征。结果显示,2个病例均表现典型的混合型FIP的大体病变,腹腔积满浆液纤维素性渗出物,在腹腔浆膜面散在或弥漫分布细小的灰白色结节。组织病理学显示腹膜表面上附着大小不等的炎性细胞浸润灶,以及坏死性肠炎、间质性胰腺炎和间质性肺炎。免疫组织化学染色结果显示,FPIV特异性的强阳性信号见于炎性细胞浸润灶、脾脏和胰腺内。基因同源性和遗传进化分析结果显示,2例基因均属于FCoVⅠ型。IMAU No.11685与浙江杭州ZJU1709毒株(MT239440)同源性最高,亲缘关系最近;IMAU No.11824与湖北武汉QS毒株(MW030108)同源性最高,亲缘关系最近。说明2例FIPV与国内流行毒株起源于共同祖先,其中ORF 7 ab、N基因相对保守,变异不明显,S基因发生一定的变异。研究结果可为我国FIP的分子流行病学研究和防控提供参考。

捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株与耐药虫株差异miRNA的转录组学分析

为探究捻转血矛线虫的伊维菌素(IVM)敏感虫株与耐药虫株显著差异的microRNA(miRNA)转录谱,发掘其耐药相关的miRNA,本实验采用Illumina Hiseq2000平台分别对捻转血矛线虫IVM敏感虫株与耐药虫株测序,构建cDNA文库,通过质控后采用生物信息学软件筛选捻转血矛线虫IVM敏感与耐药虫株的差异mi RNA。结果显示,捻转血矛线虫的IVM敏感与耐药虫株筛选出转录显著差异的miRNA共375个,其中253个转录上调,122个转录下调。利用RNAhybrid(V6.01)、Miranda(V3.3a)、TargetScan(V7.0)软件对筛选到的mi RNA靶基因进行预测,并取交集作为mi RNA靶基因预测结果,将筛选出显著差异的靶基因通过perl脚本与显著差异的miRNA进行关联分析,结果显示共关联到2106对miRNA-mRNA为负调控关系,其中涉及到477个差异的m RNA和603个差异的miRNA。对显著差异的miRNA靶基因进行GO富集分析,结果显示其中有492个GO terms,包括生物过程(BP)322个、细胞组分(CC)47个、分子功能(MF)123个。按照q值由小到大的顺序排列,被显著富集的有肌细胞发育分化及内肽酶活性等功能;按照富集基因数目由多到少排列,被显著富集的为有机物代谢、细胞代谢等功能。对显著差异的miRNA靶基因进行KEGG信号通路富集分析,按照q值由小到大的顺序排列,被显著富集到的有抗原处理与递呈等信号通路,其中显著差异靶基因也被富集到药物代谢-其他酶等与药物代谢相关的信号通路,以及一些在捻转血矛线虫耐IVM中起重要作用的通路,如:药物代谢细胞色素P450、细胞色素P450对外源药物代谢通路、ABC转运蛋白等。随机从差异miRNA中选10个进行RT-q PCR的验证,结果显示,相对转录水平结果与测序结果一致。本研究上述结果首次证实,捻转血矛线虫对IVM耐药性的产生与其代谢过程、肌细胞的分化发育过程及免疫过程中的某个或多个环节有一定的联系,本研究为进一步探究捻转血矛线虫耐药机制提供了科学依据。

捻转血矛线虫耐药虫株与敏感虫株circRNAs差异表达分析

为分析捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株与耐药虫株之间差异表达的circRNAs在调控耐药性中的作用,本研究以捻转血矛线虫敏感虫株和耐药虫株为研究对象,采用Illumina Hiseq 2000平台进行高通量测序及cDNA文库的构建,利用相关生物信息学软件对测得的circRNAs进行差异性分析,同时对来源基因进行GO和KEGG pathway功能富集。运用TargetScan和Miranda软件预测关键circRNAs靶向的miRNAs,探究circRNAs-miRNAs的作用。随后又随机选取5个显著差异的circRNAs,进行RT-qPCR检测并与转录组测序结果进行一致性评定。结果显示:1)敏感虫株与耐药虫株共筛选出677个差异表达的circRNAs,其中47个显著差异,23个显著上调,24个显著下调。2)所有差异circRNAs的来源基因GO富集分析显示,共富集到生物过程336个、细胞组分59个和分子功能110个,主要与代谢过程、细胞膜结构和催化活性等相关,KEGG富集分析显示,富集到257条通路,主要与代谢(脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢和丙酸代谢)、胰高血糖素信号通路和AMPK信号通路等相关。3)circRNAs-miRNAs调控网络分析显示,627个差异circRNAs靶向结合187个miRNAs,组成了10602组调控关系。综上,本研究成功筛选了捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株和耐药虫株间差异表达的circRNAs,对所有差异circRNAs的来源基因进行功能注释和富集分析,并构建了部分显著差异circRNAs-miRNAs调控网络。本研究结果为捻转血矛线虫耐药性产生的分子机制研究提供了新思路。