一株耐高乙醇和低pH己酸产生菌Lysinibacillus fusiformis-pBE_3-ep-SigB的构建

以Lysinibacillus fusiformis为出发菌,分别转染Sig A和Sig B突变基因,获得耐高乙醇和低p H胁迫的优良己酸产生菌。以p ET32a(+)-Sig A/Sig B为模板,采用均匀试验优化Sig A/Sig B易错聚合酶链式反应(ep PCR)扩增体系中的Mn^(2+)和Mg^(2+)浓度,通过ep PCR获得ep-Sig A/Sig B突变基因,与载体p BE_3-MCS连接后,构建L.fusiformis-p BE_3-ep-Sig A/Sig B突变菌体库,将两种菌体库在p H值2~5和乙醇含量2%~12%条件下进行筛选。结果表明,L.fusiformis-p BE_3-ep-Sig B重组菌株耐受最高乙醇含量为8%左右,最低耐受p H值为2.5左右;当乙醇含量为8%、p H值为3.5时,L.fusiformis-p BE_3-ep-Sig B重组菌株的己酸产量达到(254.35±39.74)mg/100 m L,显著高于工程菌株L.fusiformis-p BE_3-ep-Sig A的己酸产量(P<0.01),且为出发菌L.fusiformis己酸产量(93.62±10.33)mg/100 m L的271.68%,表明L.fusiformis-p BE_3-ep-Sig B重组菌株具有较强的抗高乙醇浓度和低p H值胁迫产己酸的能力。

产己酸菌Lysinibacillus fusiformis SigA基因的克隆、表达及生物信息学分析

通过克隆产己酸菌Lysinibacillus fusiformis SigA全长基因,并对其进行表达和生物信息学分析。结果表明,SigA基因开放阅读框(ORF)有1 128个碱基,编码327个氨基酸,其分子质量为45.275 kDa;生物信息学预测表明,L.fusiformis与Lysinibacillus sphaericus具有较近的亲缘关系,二者序列相似度达97%;该蛋白为亲水性可溶性蛋白,与Bacillus sp.B14905相似度达100%,其二级结构主要由α-螺旋和loop环状构成,α-螺旋和loop环状分别占其二级结构的60.15%和37.79%;预测并优化的三级结构由14个α-螺旋和15个loop构成。

高效发酵人工窖泥的制备及应用研究

采用平板计数、窖泥理化分析法、微生物菌落结构分析法、感官评价及色谱分析法等工具,对8个候选窖泥配方的微生物组成、理化性质及感官特征进行了比较分析,结果表明,8个人工窖泥方案进行中,8号窖泥配方(X8)具有较好的各项指标,为最优窖泥配方;进一步采用X8窖泥配方制备窖泥,进行夹泥发酵工艺生产试验,以检测其发酵功能,结果表明,试验组与对照组间乙酸乙酯(Sig=0.111>0.05)差异不显著,乳酸乙酯(0.05>Sig=0.022>0.01)在试验组与对照组间差异显著,己酸乙酯(Sig=0.001<0.01)、丁酸乙酯(Sig=0.002<0.01)、总酯(Sig=0.001<0.01)、总酸(Sig=0.009<0.01)差异极显著。