微生物菌群培养组学在动物医学中的应用

实验室条件下可培养的微生物约占自然界中微生物总数的1%,这限制了人们对99%未知微生物的认识和利用,而研究表明,那些“不可培养的微生物”是可以被开发和利用的,未能被纯培养的微生物才是未知微生物的主体。微生物培养组学探索利用多种培养条件和长时间的培养,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)和16S核糖体RNA(rRNA)测序可以大规模鉴定各种微生物,同时利用全基因组测序和宏基因组测序手段对未知微生物进行深入分析。本文综述了国内外近年来微生物菌群培养组学在反刍动物胃肠道、禽类盲肠及家畜鼻腔微生物菌群研究中的最新进展,探讨将动物体内菌群培养组学方法应用于动物疾病防治领域的可行性。作为一个新兴的研究方法,尽管该培养组学还存在一些不够成熟的方面,但它的发展前景十分广阔,微生物菌群培养组学方法和其他研究方法的互补已经逐渐成为发展兽医微生物学新的突破口。

置换弱毒C株非编码区的嵌合猪瘟病毒对猪的致病性研究

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性传染病。研究表明,CSFV的非编码区(UTR)与病毒复制和毒力相关。为了分析置换CSFV弱毒疫苗C株UTR的嵌合毒株对病毒复制和猪致病性的影响,以构建的C株和QZ14(CSFV 2.1 d型毒株)感染性克隆质粒pA-C和pA-QZ14为基础,扩增pA-C的UTR区和pA-QZ14除UTR以外的基因组序列,利用同源重组技术构建重组质粒pA-QZ14-CUTR;将体外转录的病毒基因组RNA转染PK-15细胞,连续传代以拯救嵌合病毒株QZ14-CUTR;将其接种PK-15细胞,通过免疫荧光和测序鉴定以确定拯救是否成功;RT-qPCR和毒价滴定法测定病毒生长趋势,分析其细胞适应性;将嵌合病毒以1×10^(5)TCID 50剂量肌肉接种试验猪以观察其致病性。结果表明,QZ14-CUTR拯救成功,基因组中稳定携带C株UTR序列;生长曲线显示,QZ14-CUTR病毒基因组拷贝数和滴度均低于亲本毒株QZ14;相较于QZ14株,QZ14-CUTR仅引起猪轻微的临床症状,不显著影响猪白细胞和淋巴细胞数;病理变化程度、排毒阳性率和组织中的病毒核酸阳性率均低于QZ14株;QZ14-CUTR能诱导特异性CSFV E2抗体,且抗体水平持续上升。综上所述,CSFV流行毒株QZ14的UTR被弱毒C株UTR置换后,其在PK-15细胞中的复制能力有所下降,对猪的致病力降低。

鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原性的研究

鸡白细胞介素 2 (IL 2 )基因是新近被确定的非哺乳类IL 2基因。将鸡白细胞介素 2 (IL 2 )基因和传染性法氏囊病病毒 (IBDV)多聚蛋白基因 (VP2 VP4 VP3 )分别插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游 ,制备DNA疫苗 ,免疫 14日龄SPF鸡 ,14d后二免 ,二免后 3d攻击标准强毒株。结果表明共注射鸡IL 2质粒能明显增强DNA疫苗对强毒攻击 ,保护率达 80 % ;能增强DNA疫苗诱导的中和抗体效价 (P <0 0 5 ) ;能显著促进鸡胸腺、脾脏和外周血液T淋巴细胞及法氏囊B淋巴细胞增殖反应 (P <0 0 5 )。这些结果提示鸡IL 2能明显增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫原性 ,是一种优良的禽类DNA疫苗佐剂。

免疫刺激复合物(ISCOM)介导的传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫的研究

将传染性法氏囊病病毒 (IBDV)ZJ2 0 0 0株的多聚蛋白 (VP2 /VP4/VP3)基因插入 pCI质粒的CMV启动子下游 ,构建了真核表达质粒pCI VP2 /VP4/VP3,在Lipofectin介导下转染Vero细胞进行了多聚蛋白的瞬时表达。以免疫刺激复合物 (ISCOM)为佐剂制备DNA疫苗 ,进行不同免疫剂量间、不同免疫途径间、一次免疫和二次免疫间的效果对比试验。结果表明 :以肌内和皮内联合免疫法效果最好 ,而口服和点眼等途径未能诱导足够的免疫反应 ;大于 2 0 0 μg的剂量DNA疫苗才能产生良好的免疫力 ;二次免疫的效果明显优于一次免疫。与常规的弱毒疫苗B87和D78相比 ,DNA疫苗产生中和抗体的潜伏期长、效价相对较低 ,对强毒攻击的保护率相当。本试验还证实 ,免疫刺激复合物具有明显提高DNA疫苗免疫效果的作用。DNA疫苗能诱导产生保护性反应 ,为今后IBD疫苗的研究开创了一条新的途径。

猪Ⅱ型圆环病毒浙江株的分离及全基因组结构分析

用PCR方法对从浙江省猪场收集的、以淋巴结肿大和生长迟缓为特征的患猪腹股沟淋巴结进行PCV2检测。将检测为阳性的病料研磨、离心、过滤除菌后 ,接种PCV freePK 1 5细胞进行病毒分离 ,分离获得 3株病毒 ,命名为HZ0 2 0 1、HZ0 2 0 2、NB0 30 1。PK 1 5细胞增殖所得病毒离心纯化后 ,在电镜下可观察到直径约为 1 7～ 2 0nm ,呈二十面体对称的病毒粒子。以组织和病毒的细胞DNA为模板进行PCV2的全基因扩增 ,测序结果显示 ,3株病毒分离物全基因序列均由 1 76 7bp组成 ,直接来自病料与细胞分离毒株的核苷酸同源性为 1 0 0 %。基因组内含有 1 1个ORF。通过比较发现 ,分离毒株与PCV2参考株的同源性介于 94 2 %～ 99 7%之间 ;与PCV1参考株的同源性为77 2 %～ 77 9%。

秀丽隐杆线虫培养特性与保存方法研究

秀丽隐杆线虫作为一种模式线虫,已广泛应用于寄生性线虫基因功能的研究以及寄生性线虫疫苗候选抗原基因的表达。通过对秀丽隐杆线虫形态、培养条件以及保存方面的研究,发现秀丽隐杆线虫在16℃NGM培养基中生长良好,将其放入30%甘油溶液中,在-80℃冰箱中可以保存较长的时间。

罗氏沼虾诺达病毒TAS-ELISA检测法的建立及应用研究

罗氏沼虾肌肉白浊病(Whitish muscle diseases ofMacrobrachium rosenbergii)是近年来流行于罗氏沼虾苗种阶段的严重疾病,该病病原已确定为罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergiiNodavirus,MrNV).作者在病毒超离提纯的基础上,制备了罗氏沼虾诺达病毒兔抗血清,并应用抗罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体2B5,建立了三抗体夹心酶联免疫检测方法(TAS-ELISA).TAS-ELISA最适反应条件为:兔抗体以1μg/mL包板,小鼠单抗2B5的工作浓度为1∶50000,该法检测MrNV的灵敏度达0.98 ng,对WSSV、TSV及其他细菌感染死亡的罗氏沼虾苗没有非特异性反应.通过对2000—2002年病虾及疑似病虾的病毒检测,表明TAS-ELISA法比间接ELISA法和核酸电泳法有更高的阳性检出率和符合率;此外还摸索了降低孵育温度和缩短孵育时间对病毒检测的影响,表明各步孵育温度和时间分别为25℃和20 min对于白浊症状的病苗检测无明显影响,使得本法更加适合于生产实践.

鸡白细胞介素2口服免疫佐剂增强传染性法氏囊病病毒DNA疫苗免疫效果的研究

将含萧山鸡白细胞介素2基因的真核表达质粒pCI-IL-2的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111(ZJ111/pCI-IL-2)口服接种小鼠和雏鸡,并与传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗联合免疫雏鸡观察其免疫效力.结果表明:利用减毒沙门氏菌作为载体的鸡白细胞介素2口服免疫增强剂具有相对的安全性.重组ZJ111/pCI-IL-2菌能明显增强IBDV DNA疫苗对强毒株攻击保护率;增强IBDV DNA疫苗诱导的抗体的效价(P<0.05);增强IBDV DNA疫苗所诱导的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖反应(P<0.05).上述结果初步表明以减毒沙门氏菌为载体的白细胞介素2免疫增强剂具有良好的安全性和免疫增强作用,为研制低成本、实用化的禽类口服免疫增强剂奠定了基础.

人类及动物RNA病毒的反向遗传系统

反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作 ,为RNA病毒的分子生物学研究提供了一种强大的工具。在过去 2 0年 ,特别是自 90年代中期第一例负链RNA病毒感染性克隆构建成功以来 ,动物RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展 ,这很大程度上归功于各种动物RNA病毒反向遗传系统的建立。这里系统总结了人类及动物非反转录RNA病毒中各类代表性成员在建立反向遗传系统时的方案设计、遇到的困难及研究者如何克服这些困难。分类讨论到的代表性病毒种属有脊髓灰质炎病毒、冠状病毒 (包括SARS病毒 )、黄病毒、野田村病毒、流感病毒、传染性法氏囊病病毒以及呼肠孤病毒等。

传染性法氏囊病病毒DNA疫苗的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒弱毒株 (IBDV JD1)和强毒株 (IBDV ZJ2 0 0 0 )的基因组A节段全长cDNA、多聚蛋白 (VP2 /VP4/VP3)和主要宿主保护性抗原 (VP2 )基因 ,分别克隆入两种真核表达载体pCI和 pcDNA3,构建成 12种真核表达质粒。将制备的DNA疫苗以 2 0 0 μg的剂量经腿肌和皮下结合途径首免 14日龄SPF鸡 ,2 8日龄以相同的剂量二免 ,二免后 14d攻击IBDV标准强毒BC6 / 85株。结果表明 ,含A节段或多聚蛋白基因的表达载体均能诱导较高水平的中和抗体并能提供对强毒的免疫保护 ,多聚蛋白基因构建成的DNA疫苗与弱毒苗B87的免疫效果相当 ;编码VP2基因的DNA疫苗仅能诱导很低水平的中和抗体 ,几乎不能提供免疫保护 ;以 pCI为表达载体的免疫效果优于pcDNA3;源于ZJ2 0 0 0株基因构建成的DNA疫苗诱导的免疫反应优于JD1株 ,提示DNA疫苗的免疫效果与VP2蛋白的构象、表达载体的调控元件和毒株差异等因素有关。

猪链球菌2型溶血素基因PCR快速检测方法研究

根据猪链球菌2型的溶血素(haemolysin)的基因序列设计一对引物,成功地扩增了溶血素基因,并建立了检测溶血素的PCR方法.用EcoR 限制性内切酶进行酶切,获得了与预期大小一致的869bp和633bp的两个片段.同时另设计一对内引物,进行巢式PCR,亦能扩增出预期片段.PCR检测的敏感程度可达100个细菌;对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌和猪放线杆菌等的PCR检测结果均呈阴性.表明建立的猪链球菌2型溶血素PCR检测方法,其特异性和敏感性均很高,可作为猪链球菌病快速诊断的方法.

ChIL-2对H_5亚型AIV疫苗免疫增强作用研究

鸡白细胞介素2真核表达质粒pCI-IL-2及原核表达重组鸡白细胞介素2(rChIL-2)分别与H5亚型禽流感油乳剂灭活苗联合使用,25日龄首免,40日龄时加强免疫.MTT法检测各组鸡外周血淋巴T细胞增殖,HI试验监测H5亚型禽流感抗体水平的消长规律,结果表明:pCI-IL-2及rChIL-2均能显著增强AIV疫苗的免疫效果(P<0.05),pCI-IL-2和rChIL-2两组间差异不显著(P>0.05);证实鸡白细胞介素2对H5亚型禽流感疫苗有免疫增强作用.rChIL-2协同免疫组MTT及HI试验均在第四周达到峰值,pCI-IL-2协同免役组峰值出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值.提示IL-2蛋白的作用更迅速,IL-2质粒作用更持久.

传染性法氏囊病病毒浙江分离株(ZJ2000)基因组A节段全长cDNA的克隆和序列分析

以传染性法氏囊病病毒 (IBDV )浙江分离株 (ZJ2 0 0 0 )基因组 RNA为模板 ,采用 L ong- accurate RT- PCR(L A-PCR)一步法扩增并克隆了 IBDV ZJ2 0 0 0株基因组 A节段全长 c DNA。序列测定结果表明 ,克隆的 A节段全长共32 5 9个核苷酸 ,包括 5′、3′端的非编码区 (NCRs)和 2个部分重叠的开放阅读框 (ORF1和 ORF2 ) ,与参比的血清 型毒株核苷酸序列的同源性高达 95 .2 %～ 99.2 %。二级结构预测表明 ,在 5′- NCRs和 3′- NCRs存在 1个大型的茎环发夹结构。 ORF2编码 14 5个氨基酸的 VP5 ,与参比毒株的同源性高达 98.6 %～ 10 0 %。 ORF1编码 10 12个氨基酸的VP2 / VP4 / VP3,在氨基酸水平上 VP2、VP3、VP4与参比毒株的同源性分别达 94 .9%～ 98.8%、96 .1%～ 98.5 %、97.1%～ 99.2 %。ZJ2 0 0 0共有 14～ 38个氨基酸的替代 ,其中特有氨基酸 6个 ,变异大多数集中在 VP2高变区 ,突变率达 2 .9%～ 11%。第 2个小亲水区内 2 80位氨基酸由 S替代了 N、2 90位 M替代了 L。这 2个突变可能与 IBDV的抗原性有关。VP2 - VP4剪切位点附近 5 11和 5 4 0位氨基酸的变异可能使 ZJ2 0 0 0株的毒力增强。分子系统进化树分析表明 ,ZJ2 0 0 0与欧洲 Cu- 1株、P2株、CEF94株和中国 Harbin株的关系最近 ,而与欧洲、香港、?

传染性法氏囊病病毒VP2/4/3-ChIL-2融合基因DNA疫苗免疫原性研究

应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension,SOE),经3次PCR将传染性法氏囊病病毒(infectiousbursal disease virus,IBDV)多聚蛋白(VP2/4/3)基因和鸡白细胞介素2(Chicken IL-2,ChIL-2)基因进行融合,定向插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2和pCI-IL-2-VP2/4/3。将其制备成DNA疫苗,肌肉注射14日龄非免疫鸡,2周后加强免疫,定期测定鸡抗IBDV血清ELISA抗体效价及病毒中和抗体效价。加强免疫后3周用IBDV标准强毒株攻击,连续观察3天后全部扑杀,计算保护率及囊体比,并进行组织病理学检查。结果表明:1)融合基因重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3免疫后能明显增强IBDVDNA疫苗对强毒的攻击保护(保护率分别为83.3%、91.6%),显著高于pCI-VP2/4/3单独免疫对照组(58.3%);2)诱导产生的抗IBDV血清ELISA抗体效价明显增高(P<0.05),同时能提高DNA疫苗诱导产生的中和抗体效价(P<0.05);3)能显著促进鸡外周血液T淋巴细胞增殖反应。上述结果提示:IBDV VP2/4/3与ChIL-2基因融合后发挥了相互协同作用,ChIL-2产生了分子免疫佐剂效应;融合基因DNA疫苗能增强IBDV DNA疫苗的免疫原性,促进了机体特异性免疫应答。

鸡白细胞介素2真核表达质粒的构建、表达及对AIV疫苗免疫增强作用研究

将鸡白细胞介素2(ChIL-2)基因亚克隆入pCI载体中,pEGFP-N1载体中的EGFP基因酶切后连入质粒pCI-ChIL-2中,构建真核表达质粒pCI-ChIL-2-EGFP,该载体表达ChIL-2-EGFP融合蛋白。重组质粒在脂质体作用下转染Vero细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)和外周血淋巴细胞(PBLC),荧光显微镜观察到融合蛋白在体外能稳定表达。HI试验显示,pCI-ChIL-2-EGFP与AIV疫苗共注射可明显提高AIV疫苗的免疫原性。

猪瘟弱毒标记疫苗候选株RecC-M1垂直传播可能性评价

为探究猪瘟病毒(CSFV)弱毒标记疫苗候选株RecC-M1在猪群中的垂直传播能力,采用二次免疫方案,以5.0×10^(3.5)TCID_(50)的RecC-M1经颈部肌肉注射接种12头后备母猪,另从试验猪场随机挑选20头按常规免疫程序以750 RID剂量给后备母猪接种猪瘟弱毒C株疫苗作为对照。接种后观察试验母猪临床症状并记录其产仔情况;首免后3、5、7、14 d采集母猪鼻拭子和肛拭子样品,并于母猪妊娠中期和分娩当日进行尾静脉采血,qPCR检测各组猪的病毒血症及排毒情况,ELISA检测猪血清中分别针对BVDV1和CSFV相应抗原的抗体水平;所有接种RecC-M1的母猪在生产当天留取2头新生仔猪(共24头)并在其吮吸初乳前安乐死后剖检,观察主要脏器大体病变情况,采集扁桃体、淋巴结、脾脏和膀胱组织用于组织病理学观察,血液样品用于猪瘟病毒抗体和核酸检测。结果表明,所有母猪免疫后均未出现临床症状,接种后2周内的拭子样品中未检测到病毒核酸,妊娠中期和分娩时血清中的RecC-M1 E2和BVDV1-E rns特异性抗体均维持在较高水平,RecC-M1接种母猪的胎均仔数、死胎数和弱仔数与对照组无显著差异。对RecC-M1接种母猪所产24头新生仔猪的剖检发现,扁桃体、淋巴结、脾脏、肾脏和膀胱均未见出血、肿大等病变;组织学结果显示,扁桃体、淋巴结、脾脏和肾脏的组织结构正常,均未见有出血性变化;仔猪血样和组织样品均无病毒核酸检出,亦未见抗体阳性。结果表明,CSFV弱毒标记疫苗候选株RecC-M1对母猪及仔猪都是安全的,不发生病毒的垂直传播,为该疫苗后选株的产业化开发奠定了基础。

鸡IL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫增强作用研究

为进一步评价鸡IL-18的免疫增强作用,用鸡白细胞介素18(IL-18)的真核表达质粒(pCI-IL-18)与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫SPF鸡,14日龄时首免,2周后二免,二免后5周用IBDV标准强毒株BC6/85攻击.研究发现,鸡IL-18能显著促进T、B淋巴细胞的增殖反应,增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的中和抗体水平及其对强毒攻击的保护力.结果提示,鸡IL-18(200μg)对IBDV多聚蛋白DNA疫苗具有显著的免疫增强作用(P<0.05).

鸡白细胞介素-2研究进展

白细胞介素 - 2 ( interleukin- 2 ,IL- 2 )主要是由激活的 T淋巴细胞产生的一类重要的细胞因子 ,具有激活淋巴因子活化的杀伤细胞 ( L AK)和自然杀伤细胞 ,刺激 T辅助细胞和自然杀伤细胞产生细胞因子和促进细胞因子的繁殖以及刺激 γδT细胞在体外生长等功能 ,因此它是免疫学研究的热点。近年来鸡 IL- 2基因克隆成功 ,使鸡 IL- 2的研究及应用得到一定的发展 ,同时也使鸡 IL- 2作为免疫佐剂和构建新型的基因工程疫苗呈现出一定的应用前景 ,本文主要对鸡 IL - 2研究取得的进展作一综述。

猪附红细胞体快速诊断方法的研究

根据GenBank上已报道的猪附红细胞体16S rRNA的序列设计一对特异性引物,进行PCR扩增并将产物克隆到T-vector后测序.结果表明扩增到的目的基因片段为404 bp,与GenBank上Mycoplasma suis序列同源性为97%.试验建立的PCR诊断方法特异性强,与健康猪血液、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、弓形虫、猪圆环病毒DNA无交叉反应,能检测出的最低DNA浓度是8.6 fg?μL-1.该方法具有快速、准确、敏感等特点,为浙江地区猪附红细胞体病的诊断及分子流行病学的调查提供了新的手段.

浙江省舟山地区水产品及其养殖环境中霍乱弧菌污染状况调查

为了解浙江省舟山地区水产养殖环境及水产品中霍乱弧菌的污染状况,于2007年与2009年采集水样、泥样及多种水产品等176份样品。用TCBS选择性培养基从样品中分离弧菌,并应用基于编码胶原酶的霍乱弧菌看家基因(vcc)的特异性PCR方法检测霍乱弧菌。霍乱弧菌的总检出率为5.1%(9/176),其中2007年的检出率(5.5%)稍高于2009年(4.5%)。9株霍乱弧菌分离株中,5株来自环境,4株来自水产品。虾类产品中检出3株,而检出这3株霍乱弧菌的虾类产品均为南美白对虾。由此可见,水产品及其养殖加工环境存在安全隐患。