基于PCR-序列分析法检测浙江省汉族人群HLA-E基因多态性

目的建立并使用PCR-序列分析法分析浙江省汉族人群人类白细胞抗原-E(HLA-E)基因的多态性。方法随机选取2024年2至4月浙江省血液中心获捐的150例血小板献血者的外周血样本,抽提标本基因组DNA并采用PCR法扩增HLA-E基因全长序列,利用Sanger测序分析HLA-E基因的第2~4号外显子序列,采用Assign SBT v4.7.1专业软件确定HLA-E基因型。结果150例浙江省汉族人群外周血标本共检出4种HLA-E基因型,HLA-E*01:01,01:01、HLA-E*01:01,01:03、HLA-E*01:03,01:03、HLA-E*01:03,01:12基因型的频率分别为14.00%、51.33%、32.67%、2.00%;等位基因HLA-E*01:01、HLA-E*01:03、HLA-E*01:12的频率分别为39.67%、59.33%、1.00%。结论PCR-序列分析法以Sanger测序为基础,可实现HLA-E基因分型。浙江省汉族人群HLA-E基因高度保守,多态性较低,仅检出3种HLA-E等位基因。

浙江汉族RhDEL表型的分子机理研究

为了研究浙江汉族RhDEL表型的分子机理,用吸收放散的血清学方法鉴定RhDEL表型,然后用RHD基因特异的聚合酶链反应-序列特异性(PCR-SSP,polymerase chain reaction-sequence specific prime)和序列分析方法鉴定DEL表型RHD基因的10个外显子和外显子-内含子连接区域可能的变异。结果表明:在122例浙江汉族Rh阴性血型中共检测到35例DEL表型个体,其中RhCCdee、RhCcdee和RhCcdEe表型分别有6例(17.14%)、28例(80.00%)和1例(2.86%)。序列分析发现,RhDEL表型个体的第9外显子都有1227G>A突变。D杂合性试验发现,有29例(RhCcdee,28例;RhCcdEe,1例)存在RHD基因的缺失,有6例(RhCCdee)不存在RHD基因的缺失。结论:RHD1227A是浙江汉族RhDEL表型个体的重要遗传标记。

中国浙江人群中Lewis血型相关的FUT3基因多态性初步研究

为研究中国浙江人群中Lewis血型相关的FUT3基因多态性,以血清学方法鉴定183例随机样本的Lewis表型,将其中39例Le(a-b-)以及选取的Le(a+b-)、Le(a-b+)和Le(a+b+)各3例进行FUT3基因全编码区序列分析,并对各种可能的复合杂合基因型进行单倍体序列分析。结果显示,真正的Lewis阴性表型在中国浙江人群中比例约为10.4%,在48例直接测序样本中发现59T>G、202T>C、314C>T、508G>A和1067T>A等5个变异位点;单倍体分析显示,除功能性的Le等位基因外,发现5种非功能性的le等位基因,分别为le59(59T>G);le1067(1067T>A);le59,1067(59T>G和1067T>A);le59,508(59T>G和508G>A)和le202,314(202T>C和314C>T)。结论:在浙江人群中,FUT3非功能性等位基因具有较为广泛的遗传多态性。

血清学和分子生物学鉴定Lewis血型抗体引起的输血反应

为了分析1例溶血性输血反应产生的原因,用谱细胞和Le(a-b-)表型细胞鉴定患者血清中的抗体,用抗Lea和抗Leb血型试剂鉴定患者红细胞表型,用PCR测序方法分析LE基因(FUT3基因)全编码区序列。结果表明:患者血清中有抗Lea和抗Leb抗体,血型表型为Le(a-b-),LE基因型为无效等位基因纯合子(le59,508)。结论:抗Leb抗体可引起溶血性输血反应,患者FUT3基因突变导致Le(a-b-)表型。

2例类孟买表型的分子机理研究

本研究探讨2例类孟买血型表型的分子机理。先证者样本通过血清学方法鉴定为类孟买血型,采用PCR扩增先证者的FUT1和FUT2基因编码区序列,并对PCR产物进行直接测序分析。同时FUT1基因PCR产物经TOPOTA转染克隆到质粒上分离后,对其进行测序分析,以证实突变在染色体上的位置。结果表明:直接测序发现2例先证者FUT1基因第547-552位AG两碱基缺失杂合(CAGAGAG→CAGAG)和第658位C→T杂合。克隆后证实一条染色体上FUT1基因第547-552位中的两碱基AG缺失,可导致阅读框架发生移码,提前形成终止密码;另一条染色体上FUT1基因第658位C→T错义突变,导致第220位精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys)。2例先证者FUT2基因均为357C→T同义突变。结论:2例先证者FUT1基因突变为不同染色体的复合性突变,均为h1h3。

ABO血型新等位基因O61的分子生物学研究

本研究探讨ABO新等位基因O61的分子机制。利用单克隆抗体检测标本红细胞ABO血型抗原,标准A、B、O红细胞检测标本血清中的ABO抗体。采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增ABO基因的第5至7外显子序列,PCR产物经双酶切后直接测序分析6和7外显子。1例B表型标本采用基因组单链抽提技术分离杂合基因型标本的2条单体型,对分离的单体型扩增后进行ABO基因测序分析。结果表明,在417例标本中发现3个标本743位碱基发生突变,其中2例表型为O型,1例为B型。2例O型直接测序分析显示,6和7外显子有261G缺失及743G/C杂合。1例B型直接测序结果为261G/缺失及297A/G、526C/G、743G/C、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A杂合。采用基因组单链抽提技术将B型标本的两条单体型进行分离,对分离的单体型扩增后进行ABO基因测序分析,结果显示,2条链分别为B101和突变的O型。将突变的新O型基因提交血型抗原基因突变数据库,被正式命名为O61。结论:ABO基因7号外显子743G>C为1个新的突变点,发现1个ABO新等位基因O61。

AT基因13387-9delG突变引起遗传性抗凝血酶缺陷症的分子病理机制研究

目的 研究AT基因 13387 9delG突变引起AT缺陷症的分子病理机制。方法 用大引物法构建 13387 9delG突变体AT重组表达质粒 (ATM) ,并将其和正常AT重组表达质粒 (ATN)分别用Superfect 试剂转染COS7细胞或CHO细胞 ,进行体外表达试验、脉冲追踪试验以及细胞免疫荧光染色。结果 ATM转染的COS7细胞培养上清液中检测不到AT抗原 ,而在细胞裂解液中 ,其AT抗原仅为转染ATN的 2 7 13%。脉冲追踪试验发现 ,在ATM转染的COS7细胞培养上清液中 ,检测不到3 5S标记的AT蛋白 ,在chase 0min时 ,ATM细胞内3 5S标记的AT蛋白只有ATN的 2 7 8% ;在chase 180min时 ,ATM细胞内3 5S标记的AT蛋白为 0min时的 5 0 %左右。细胞免疫荧光试验的结果表明 ,ATM转染的CHO细胞内荧光强度明显低于ATN转染的CHO细胞。结论 编码的突变AT蛋白分泌障碍和细胞内快速降解 ,是AT基因 13387

α-1,2岩藻糖基转移酶基因35C>T和682A>G突变点体外表达的研究

本研究探讨35C>T和682A>G突变点对α-1,2岩藻糖基转移酶(FUT1)表达活性的影响。PCR扩增FUT1全长编码序列DNA片段,通过TOPOTA技术连接至表达载体pcDNA3.1/V5-His,获取目的重组质粒。采用脂质体转染方法将重组质粒转染COS-7细胞,经G418筛选培养后,利用流式细胞术分析细胞表面H抗原,实时荧光PCR检测fut1 mRNA表达情况。结果表明:成功获取了35T、682G+35T和682A+35C重组质粒。转染2天后H抗原在COS-7细胞膜上表达,第4天达最高峰。与野生型(682A+35C)转染的细胞相比,第4天重组质粒(682G+35T)转染细胞H抗原的表达量仅为野生型的13.3%,而重组质粒35T转染细胞为野生型的52.7%。转染后fut1mRNA水平随着时间延长而逐渐递减,在第1天重组质粒(682G+35T)转染细胞fut1 mRNA水平仅为野生型(682A+35C)的14%。结论:682A>G突变明显降低α-1,2岩藻糖基转移酶活性,而35C>T引起H抗原的表达部分下降。

大容量人血小板冻干保存的初步研究

目的为使血小板冷冻干燥保存技术用于军队临床战创伤救治,在小容量冻干保存的基础上研究大容量人血小板的冷冻干燥技术。方法采用特制血盒作为冻干容器,以20%(w/v)海藻糖和1%(w/v)牛血清白蛋白作为冻干保护剂。冻干样品复水后测量血小板的数值恢复率和体积分布参数,应用流式细胞仪检测血小板的凋亡率和活化率,采用二磷酸腺苷和肾上腺素检测血小板的聚集功能。结果大容量血小板冻干复水后的数值恢复率为(66.3±2.1)%,平均血小板体积较新鲜血小板有明显增加,冻干血小板的细胞凋亡率达20%左右;冻干和复水过程还造成小部分血小板被激活,其最大聚集率为新鲜血小板的50%左右。结论大容量血小板冻干复水后的恢复率较低,形态结构、活性和功能指标均低于新鲜血小板,但基本可以满足血小板临床止血功能标准。

113例呼吸系统疾病患者红细胞血型不规则抗体的回顾研究

目的研究呼吸系统疾病患者红细胞血型不规则抗体的特点。方法回顾性分析2012年11月至2021年6月间收集的113例呼吸系统疾病患者红细胞血型不规则抗体鉴定结果。结果本研究呼吸系统疾病患者以肺炎类和肺部肿瘤类多见。113例患者中有86例患者检出15种红细胞血型不规则抗体,占比前三位的分别是抗-M(25.58%)、冷凝集素(25.58%)、抗-E(15.12%)。肺炎和肺部肿瘤患者抗-M比例分别为12.82%和44.44%,差异有统计学意义(χ^(2)=5.32,P<0.05);抗-E比例分别为17.95%和22.22%,差异无统计学意义(χ^(2)=0.00,P>0.05);冷凝集素比例分别为33.33%和5.56%,差异无统计学意义(χ^(2)=3.74,P>0.05)。结论肺部疾病患者红细胞血型不规则抗体以抗-M、冷凝集素和抗-E多见。

中国人Rh部分D表型的分子机理研究

为了研究部分D表型的分子机理,用间接抗人球蛋白方法(IAT)筛选弱表达的D变异体,PCR-SSP(poly-merasechainreaction-sequencesepecificprimer)方法扩增RHD基因特异的外显子及其侧翼序列,用PCR产物直接序列分析测定核苷酸的变异。结果表明:从22例弱D中检测到10例部分D表型,其中DVa(Kou.)、DVa(Hus.)和DVa-like(YH.)各1例,DVItypeⅢ表型7例。结论:10例部分D表型的分子机理得到明确,其中DVa(Kou.)、DVa-like(YH.)表型为国内首次报道。

浙江汉族DEL表型基因分型方法的建立

为了快速鉴定DEL表型,建立浙江汉族DEL表型的基因分型方法,根据RHD1227A等位基因序列设计等位基因特异性-聚合酶链反应(allele specific-polymerase chain reaction,AS-PCR),用于DEL表型的基因分型。用已知RHD1227A多态性的样本和已知DEL表型的样本评价基因分型方法的灵敏度和特异性。结果表明:在50例RHD1227A阳性和50例RHD1227A阴性的Rh阴性样本中基因分型方法的灵敏度和特异性都是100%;在33例DEL阳性样本和89例DEL阴性的样本中,基因分型方法的灵敏度为100%,有2例样本血清学结果为阴性而基因分型结果为阳性,重新用血清学方法和序列分析方法复核这2例样本,发现2例都是血清学漏检,因而基因分型方法的特异性是100%。结论:设计的基因分型方法可以有效地鉴定浙江汉族Rh阴性人群中的DEL表型。

RHD 1227A等位基因在Rh阴性人群和随机人群中的频率研究

本研究调查RHD1227A等位基因在Rh阴性人群和随机人群中的频率。采用等位基因特异-聚合酶链反应(allelespecific-polymerasechainreaction,AS-PCR)检测RHD1227A等位基因,RHD基因拷贝数采用D杂合性试验和RHD外显子9的核苷酸序列分析方法进行确定。结果表明在143例Rh阴性献血员中,共检测到41例RHD1227A等位基因携带者,其中8例(19.51%)为RhCCdee,32例(78.05%)为RhCcdee,1例(2.44%)为RhCcdEe。在这41例RHD1227A等位基因携带者中,35例有RHD基因的缺失,另外的6例是RHD1227A等位基因的纯合子。在489例随机献血员中检测到7例RHD1227A等位基因先证者,都是RHD1227G/A杂合子,且是正常Rh阳性血型。结论RHD1227A等位基因在Rh阴性人群中的频率为16.43%,在随机人群中的频率为0.72%。

罕见A1Bw亚型伴不规则抗-B研究

准确鉴定献血者血型对临床血液正确发放和安全输血至关重要[1],输血前应正确鉴定供、受血者血型,而ABO亚型会使抗原抗体反应出现异常、减弱或消失,导致血型正反定型不符,定型出现困难[2]。由于ABO亚型很多,不同的ABO亚型常呈现独特的正反定型结果,笔者在血液检验工作中遇到1例A1Bw11亚型伴不规则抗-B标本,现报道如下。

针对HLA-I类分子高效基因编辑方法的建立及其应用

目的:建立一种HLA-I类分子高效基因编辑的方法,以制备编辑HLA-I类通用型造血干细胞。方法:针对β2微球蛋白基因设计并合成sgRNA,将NLS-Cas9-NLS核酸酶与sgRNA按照不同的摩尔比(1∶1-1∶4)形成RNP复合物,分别设置对照组和四个转染组,通过核转染方式转入HEK-293细胞或者CD34+造血干细胞。培养72 h后,应用流式细胞术检测转染细胞表面HLA-I类分子表达情况,T7E1酶切反应鉴定切割作用,DNA直接测序方法鉴定序列套峰出现情况。结果:流式细胞术检测发现转染后HEK-293细胞或者CD34+造血干细胞有不同程度的HLA-I类分子阴性表达细胞群,直接测序不同转染组在sgRNA PAM序列附近均有明显套峰出现。在HEK-293细胞转染中,NLS-Cas9-NLS核酸酶与sgRNA摩尔比为1∶4时HLA-I类分子阴性表达细胞群比例最高(87.69±0.83)%,摩尔比为1∶3时T7E1酶切割效率最高(38±2.0)%。在CD34+造血干细胞转染中,NLS-Cas9-NLS核酸酶与Easyedit sgRNA摩尔比为1∶2时,HLA-I类分子阴性表达细胞群比例为(91.56±3.39)%,摩尔比为1∶1时T7E1酶切割效率为64±8.45%。结论:本研究提供了一种针对HLA-I类分子进行高效基因编辑的方法,该方法可以有效地将细胞表面的HLA-I类分子进行沉默表达,并成功应用于编辑CD34+造血干细胞。

NGS自动化平台在HLA基因分型的建立及应用

目的建立基于二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术对人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)基因进行分型的自动化操作平台,并评估其在HLA常规检测中的应用。方法根据试剂盒操作说明编写相应的计算机程序,利用Hamilton Microlab STARlet全自动液体处理工作站联合96通道小型液体工作站、荧光化学发光分析仪等仪器,实现NGS技术对HLA基因分型过程中文库制备步骤的自动化操作。结果手工法和自动化平台获取的文库片段两者读长基本一致,浓度及质量均符合要求,测序结果一致;而自动化平台操作时间明显少于手工操作。结论建立的NGS自动化操作平台检测HLA基因分型方法可行,值得推广使用。

中国人罕见的cisAB变异型分子机制分析

为研究中国人群ABO血型系统中罕见的cisAB变异型的分子遗传背景,用血型血清学方法鉴定12例ABO血型疑难样本和116例随机无血缘关系样本,应用聚合酶链反应和DNA序列分析等方法对样本ABO基因酶活性编码区外显子6、7和侧翼内含子进行突变筛选和检测,并对不同基因型的扩增片段进行单倍体序列分析。血清学检测发现12个样本均为(A强B弱)或(A弱B强),PCR产物直接序列分析表明这些样本均为cisAB变异型,并存在4种基因型。通过单倍体序列分析,从中发现2种cisAB等位基因,其中cisAB01不仅存在外显子7的467C>T和803G>C变异,还在第6内含子存在未经报道的163T>C和179C>T变异;另一种等位基因是在B101基础上保留了A101的803G位点,编码一条176G、235S、266M和268G组合的多肽链。经检索,未发现该组合的ABO等位基因,该等位基因已被国际血型抗原基因突变数据库命名为cisAB05等位基因。文章系统研究了中国人群cisAB变异型分子机制,发现了一种新的cisAB05等位基因,同时根据内含子序列推测cisAB01等位基因可能是通过A101和B101等位基因间的同源交换而形成的。

α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶等位基因467C>T和539G>C变异导致A_2亚型

为了研究中国汉族人群ABO血型系统中A2亚型的分子遗传背景,发现并鉴定新的ABO等位基因,采用血型血清学方法鉴定5例ABO血型疑难样本,PCR扩增ABO基因转录调控序列和全编码序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序,并对含有变异位点的扩增片段进行单倍体序列分析。结果表明5例疑难样本分别鉴定为A2或A2B亚型;进一步研究发现,1例A2B和1例A2样本分别含有A201和A205等位基因,另3例A2B样本中发现一个新的A2等位基因。该等位基因与A101相比,差异在外显子7的467C>T和539G>C变异,导致多肽链P156L和R180P的替换。结论首次发现467C>T和539G>C组合的A2等位基因,中国汉族人群中A2亚型具有遗传多态性。