大规模并行基因组测序技术应用于无创产前诊断染色体非整倍体的研究

目的利用大规模并行基因组测序技术检测孕妇外周血浆中的游离DNA,行胎儿染色体非整倍体的无创产前诊断。方法选择2009年1月到2010年7月在深圳市人民医院产前诊断中心就诊,孕龄在8～30周之间高龄妊娠、唐氏综合征生化筛查高风险和(或)彩超显示胎儿异常等同意介入产前诊断的孕妇941例,抽取孕妇外周静脉血,提取血浆DNA,制备测序文库,应用Illumina HiSeq2000高通量基因测序仪检测,测得的基因序列与人类的参考基因组比对并作统计分析。同时采集胎儿羊水或脐血,经细胞培养后行羊水或脐血细胞染色体核型分析确定染色体非整倍体。结果①941例孕妇血浆样本处理后经大规模并行基因组测序技术检测判定胎儿为唐氏综合征高风险共27例,非唐氏综合征914例;以羊水或脐血染色体核型分析的结果为金标准进行结果对照,检测出的27例唐氏综合征高风险中2例误诊,其中一例核型为47,XXY,一例核型分析正常。经统计分析胎儿唐氏综合征的检出率为100%,检出正确率99.78%,误诊率0.22%;②941例样本中,检出18-三体高风险14例,18-三体低风险927例。与染色体核型分析相比,统计分析显示无创产前基因检测18-三体胎儿的检出率为93.33%(14/15),漏诊率为6.67%(1/15)、误诊率为0。结论利用大规模并行基因组测序技术检测孕妇外周血浆中的游离DNA行无创产前诊断胎儿染色体非整倍体,其敏感性、特异性与染色体核型分析技术具有较高的一致性。该技术具有无创性、高准确性、高通量等优势,具有临床实际应用价值。

鱼类基因组研究进展

鱼类基因组研究利用大规模测序获取有关物种的基因组序列信息,进而阐明鱼类生物学特性、表型变异与基因组结构之间的关系,在鱼类的种质鉴定、遗传育种、动物营养、环境毒理和病害防治等领域具有巨大的应用潜力。自2001年首先对斑马鱼的基因组测序起,到目前为止已有近40个鱼类物种的全基因组测序完成,且其相关的生物学特征、遗传进化规律等得到较全面的解析。将从鱼类全基因组测序技术发展历程和鱼类基因组解析两大部分对鱼类基因组研究进展进行综述,旨在进一步了解鱼类基因组的研究现状、发展趋势和应用前景,为后续鱼类基因组研究提供参考。

embB基因突变与乙胺丁醇药敏表型及耐多药关系的研究

目的研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)emb B306位点及其他突变位点与乙胺丁醇(ethambutol,EMB)的耐药表型及耐多药(multidrug resistant,MDR)的关系;分析emb B基因突变与EMB药敏表型及MDR的关系。方法对临床分离的MTB采用BD MGIT 960 SIRE试剂比例法进行药敏试验,取48株EMB耐药、46株EMB敏感但耐其他药及7株四药均敏感MTB提取核酸并扩增emb B基因全序列,对扩增产物进行测序分析emb B基因序列,与H37Rv标准株序列比对,分析emb B基因各突变位点、形式及频率。结果 101株MTB发现emb B基因序列上有17个不同位点突变形式。53株MTB在emb B基因序列上发生突变,其中46株为EMB耐药,7株为EMB敏感;emb B基因野生型的MTB有48株,其中2株为EMB耐药,46株为EMB敏感;emb B突变型与emb B野生型的MTB之间EMB耐药率有显著性差异(c2=68.95,P<0.01)。101株MTB中MDR有51株,其中有42株发生emb B突变,9株为emb B基因野生型,emb B基因突变率在MDR和非MDR之间有显著性差异(c2=36.9,P<0.01)。结论 emb B306位点与EMB耐药及MDR中度相关,emb B基因突变与EMB耐药及耐多药结核菌(multidrug resistant-Mycobacterium tuberculosis,MDR-TB)高度相关,emb B基因突变可作为MDR-TB的检测分子标记物,指导临床用药。

高通量基因测序相位问题的校正研究

边合成边测序的高通量基因测序技术存在一个相位问题,即碱基合成的先后顺序会出现"超前"和"延迟"。针对此问题,结合Markov过程的方法提出一种回归分析,在建立有关相位"超前"与"延迟"问题的荧光强度数据基础上,构造出相位校正矩阵,解决高通量基因测序中的相位问题。实验结果表明,采用提出的相位校正方法,达到对碱基合成时出现的相位"超前"和"延迟"问题的校正。

西瓜基因组框架图谱绘制与20份代表性资源重测序研究

目的与意义:西瓜是一种重要的葫芦科作物,占全世界蔬菜生产面积的7%.经过长期人工选育,西瓜遗传多样性变的十分狭窄,已成为西瓜品种改良的瓶颈.本研究以东亚类型高品质西瓜品种‘97103’为材料进行西瓜全基因组序列分析,并开展20份代表性西瓜资源的基因组重测序分析,以明确西瓜基因组结构和进化历程,阐明果实品质和维管束信号传导等重要生物学过程的分子机制.

中国寻常型鱼鳞病患者FLG基因变异的研究

目的在中国寻常型鱼鳞病患者中验证FLG基因已知的突变,并期望发现FLG基因新的变异。方法收集4个寻常型鱼鳞病家系与95份散发病例的外周静脉血,并采集52名无血缘关系健康志愿者的外周静脉血,采用PCR及DNA直接测序的方法,对已报道的FLG基因18个突变位点进行检测。结果发现了7个频发致病突变,包括4个无义突变E2422X、Q2417X、R2447X和R4307X及3个移码突变441delA、1249in-sG和7945delA,并发现FLG基因3个新的变异Q1790X、Q1745X和7877delC。结论寻常型鱼鳞病存在明显的遗传异质性,中国寻常型鱼鳞病患者在FLG基因上有其特异的突变位点。

基因组编辑技术研究进展

利用基因组编辑技术可以对生物基因组特定位点进行人工修饰,研究相关基因的功能,进而应用于基础研究和临床治疗方面。序列特异性的DNA结合结构域与非特异性的DNA修饰结构域组合而成的人工酶是基因组编辑工具的重要组成部分。主要介绍了锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶(Meganucleases)和成簇间隔短回文重复(CRISPR)4种基因组编辑技术的特点、原理、构建方法及应用,为相关的研究和应用提供参考。

无创产前基因检测胎儿染色体非整倍体技术研究及应用进展

1背景介绍中国是出生缺陷高发国家,根据全国出生缺陷医院监测数据(监测期限为妊娠满28周至产后7天)显示,出生缺陷发生率呈上升趋势,由1996年的87.7万上升到2010年的149.9万,增长幅度达70.9%[1],染色体异常是导致出生缺陷的重要原因。据统计,约160例新生儿中就有1例是染色体异常患者[2]。在众多染色体异常疾病中,染色体非整倍体导致的残疾及生活障碍尤为明显,其中又以21-

基于低深度测序的无创产前基因检测技术对胎儿染色体拷贝数变异的检测效能评估

目的:探讨低深度测序的无创产前基因检测技术(NIPT)在胎儿染色体拷贝数变异(CNV)中的检测情况及临床意义。方法:抽取2017年9月至2019年5月所选873例孕妇的血浆,通过低深度测序方法对随机重排的样本进行盲法检测,并采用基因拷贝数变异分析算法(FCAPS)鉴定胎儿CNV。对比核型分析及染色体微阵列分析(CMA),评估低深度测序下NIPT对胎儿CNV的检测效能。结果:48例染色体微缺失/微重复(大小约0.1~47 Mb)样本中,与低深度(0.51~1.19X)测序的NIPT检测结果一致的有32例,结果不一致的有16例,另正常样本组有21例假阳性样本。NIPT对CNV总的敏感度和特异度分别为66.67%和97.45%,特别是对>2 Mb的CNV,其敏感度和特异度分别高达85.29%和98.18%。结论:基于低深度测序的NIPT对>2 Mb的CNV具有高效能。在NIPT中应用优化的检测和信息分析方法进行胎儿CNV的产前筛查是可能的。

利福平和异烟肼结核分枝杆菌药敏表型和基因型的关系

目的对利福平(RFP)和异烟肼(INH)进行药敏检测,分析相应的结核分枝杆菌药敏表型与基因型的关系。方法对2009年至2012年深圳市第三人民医院结核病门诊和住院的137例结核病患者晨痰标本进行结核分枝杆菌培养,利用膜基因芯片法检测结核分枝杆菌耐药基因的突变情况(基因型检测),同时以绝对浓度法进行异烟肼和利福平药敏试验(表型检测),计算两种方法检测结果间的符合率,验证膜基因芯片方法的准确性,用Kappa检验分析两种方法的一致性。结果137株结核分枝杆菌标本,表型检测利福平和异烟肼耐药率分别为27.01%(37/137)和22.63%(31/137);基因型检测利福平和异烟肼耐药率分别为26.28%(36/137)和23.36%(32/137);以绝对浓度法药敏结果为金标准,膜基因芯片检测利福平耐药的敏感度为83.78%(31/37),特异度为94.06%(95/101),符合率为91.97%(126/137),Kappa值为0.79,P<0.05;异烟肼耐药的敏感度为80.65%(25/31),特异度为94.29%(99/105),符合率为90.51%(124/137),Kappa值为0.73,P<0.05;两种药物药敏结果总符合率为91.24%(250/274)。结论结核分枝杆菌耐药性基因型检测和表型检测结果高度一致,且基因型的检测方法能快速准确地检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性,有望在临床治疗中广泛应用。

利用改进的手工克隆技术生产转GFP基因猪克隆胚胎

通过体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)培育转基因动物新个体是当前被广泛使用的技术之一,但其生产成本高和转基因囊胚形成率低在很大程度上制约了该技术的应用。文章报告对该技术的一些改进以提高其成功率并降低成本。首先将增强型绿色荧光基因(EGFP)导入猪胎儿成纤维细胞中,通过荧光观察EGFP的表达来筛选适合做细胞核移植的体细胞。这样避免了外源EGFP基因虽已整合至猪基因组但不表达的情况,保证供体细胞100%是表达目标蛋白(绿色荧光蛋白)的细胞;然后利用新一代体细胞核移植技术——手工克隆技术(Handmade cloning,HMC)将供体细胞与卵母细胞融合生产胚胎。共收集了4个批次378个肉用家猪的卵母细胞,经体外培养成熟后手工去核得到266个去核卵母细胞,与EGFP细胞融合后获得127个重构胚胎,将重构胚胎体外培养到144 h,得到转基因囊胚65个,平均囊胚率为52.1±8.3%。与传统SCNT相比,HMC不仅操作简便,而且能大幅提高核移植细胞的囊胚率。更为重要的是,改进的手工克隆技术摆脱了昂贵的显微操作仪,为产业化生产转基因动物提供了新的实用基础。

念珠藻多糖的研究现状与应用展望

念珠藻多糖是念珠藻群体的主要支撑物质,也是念珠藻的主要生物活性成分之一。念珠藻多糖在增强机体免疫、抗肿瘤、抗病毒等方面有显著活性,同时念珠藻胞外多糖对念珠藻本身在抗逆境等方面具有良好的保护作用。综述了念珠藻多糖的提取分离、结构与生物活性三方面对念珠藻多糖的研究进展,并在此基础上展望了对念珠藻多糖在医药保健、日用化工和环境保护等领域的开发潜力和应用前景。

眼病候选基因芯片在一汉族视网膜色素变性家系分子遗传学中的应用

背景 视网膜色素变性（RP）是一种累及视网膜光感受器细胞及色素上皮细胞的遗传性致盲眼病.RP的发病机制及临床特征较复杂,具有遗传异质性和临床异质性.随着基因组学的迅猛发展,越来越多的研究手段应用于RP致病基因筛查.目的 通过眼科基因芯片测序方法探讨一常染色体遗传RP家系临床表型及其基因突变情况.方法 于2013年6月在重庆市荣昌县收集一汉族RP家系,对该家系所有患者进行眼科检查确诊后,抽取12名家系成员外周静脉血各1 ml,应用华大基因眼科芯片目标区域捕获技术进行基因突变检测.该基因芯片覆盖了眼病相关的基因编码区（包括59个RP候选基因）,选择家系内2例RP患者（Ⅱ5、Ⅱ7）的DNA样本进行目标区域捕获测序.通过生物信息学技术对测序结果进行分析,对共有的变异位点进行Sanger测序验证.结果 该家系为常染色体遗传的RP家系.通过基因芯片分析发现该家系Ⅱ5和Ⅱ7患者存在2个共有基因突变：USH2A （c.3065T＞C,p.Phe1022Ser）突变和PDE6A（c.1699G＞A,p.Ala1319Gly）突变,家系其他成员检测结果表明2个基因突变未与疾病共分离.该眼科基因芯片高通量测序技术虽然未定位该家系致病基因,但快速排除了RP常见候选基因,为进一步分析奠定了研究基础.结论 采用基于目标区域捕获测序的眼科基因芯片技术可以快速、准确地筛查RP常见候选基因,是眼科疾病遗传研究的一项适用且高效的新方法.

基于微量RNA高通量测序技术的牦牛MⅡ期卵母细胞转录组研究

旨在现有高通量测序的基础上,建立一种针对牦牛卵母细胞等微量样本的RNA高通量测序方法,为进一步研究牦牛卵母细胞的转录组学提供基础。以微量MII期牦牛卵母细胞RNA(10ng)作为研究样本,应用SMART cDNA PCR扩增技术对样本进行富集并构建测序文库,再应用改进的RNA高通量测序技术对其进行高通量测序分析。经Illumina-Solexa深度测序后,得到了一个包含47 619 254条测序序列,4Gb大小数据量的微量MII期牦牛卵母细胞测序文库。质量控制(Quality control,QC)及基本结果分析表明测序文库质量良好。基因组比对分析显示,共有15 626个牦牛基因被映射。此外,还获得了7 348个新的转录本。GO分类注释结果显示,共有13 795个比对上的基因参与了生物过程、细胞组分及分子功能3大主要类别。进一步富集分析显示,分别有333 134及113个GO类别在上述3大类中得到富集。KEGG通路分析结果显示,共有13 496个比对上的基因参与了258条通路,其中101条通路得到有效富集。本研究以牦牛卵母细胞为样本成功建立了一种起始RNA量可低至10ng的微量转录组测序方法。该研究结果为进一步研究牦牛基因组提供了基础,同时也为研究牦牛MII期卵母细胞的分子机理提供了新的视角。

深海沉积物宏基因组文库构建及淀粉酶筛选

深海环境通常具有高盐,高压,高/低温,无光照等特点,使得海洋微生物存在一套独特的生理代谢机制和分子细胞结构,然而迄今绝大部分深海微生物不能在实验室条件下被分离培养,深海微生物资源开发遇到很大挑战。本研究通过不依赖培养的方法研究海洋微生物的基因资源,构建了南海深海沉积物fosmid宏基因组文库,共获得约39 600个克隆,插入片段范围在24～45kb之间,平均插入片段大小为33kb,克隆片段的总库容达到1 320Mb。通过功能筛选获得3个具有淀粉酶活性的克隆子,选取其中最适温度较低的amy7作为进一步研究对象。构建amy7插入片段的重组质粒文库,获得一个同样有淀粉酶活性的克隆子amy7—6。经测序,克隆子amy7—6含有3 291bp插入片段,序列比对分析后发现其中一个大小为1 920bp的ORF,其编码的蛋白质序列(AmyS)与各种来源的糖苷酶有着较高的相似性。

基于母体血浆单体型分析无创产前检测脊髓性肌肉萎缩症的研究

目的:探索无创产前检测(NIPT)脊髓性肌肉萎缩症(SMA)在临床应用的可行性。方法:招募生育过SMA先证者且再次妊娠的24个家系,其家系中夫妻双方及先证者致病突变经多重连接探针扩增技术(MLPA)测定。采集家系外周血及孕11周以后的孕妇血浆,通过目标序列捕获及高通量测序技术,首先对夫妻双方及先证者外周血DNA样品进行目标区域捕获测序,获得与致病位点连锁的亲本单体型信息,再结合血浆测序数据中提供的单核苷酸多态性位点的分析结果,构建隐马尔可夫模型,推断胎儿单体型,从而得到胎儿的基因型。同时利用有创产前诊断MLPA检测验证其准确性。本次研究主要针对SMN1基因第7、8号外显子的检测。结果:24个家系通过NIPT检测检出患胎5例,携带者7例,余12例正常;MLPA检测结果为5例患胎,8例携带者,11例正常。患胎均为SMN1基因第7、8号外显子纯合缺失。NIPT与MLPA检测结果一致率为95.83%(23/24),两种方法诊断结果差异无统计学意义(P=0.317)。结论:基于母体血浆目标区域捕获测序、单体型分析NIPT胎儿SMA风险的方法准确、安全,应用于有先证者遗传信息的SMA NIPT有一定可行性。

糖尿病增殖型视网膜病变外显子组测序研究

目的本研究组拟应用目标区域捕获与外显子测序技术对2型糖尿病增殖型糖尿病视网膜病变患者进行外显子组测序分析。方法选择于首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科就诊的2型糖尿病患者中进行彩色眼底照相及眼科医师检眼镜检查者。50名糖尿病人病史小于15年患增殖型糖尿病视网膜病变的患者作为病例组,50名糖尿病病史10年以上而无糖尿病视网膜病变且糖化血红蛋白大于7.0%患者作为对照组。提取外周血DNA,应用NimbleGen商业化2.1M外显子序列捕获芯片结合高通量测序技术进行外显子组区域的重测序。结果无视网膜病变组和增殖型视网膜病变组年龄分别为(60.00±7.89)岁、(55.81±7.75)岁(P=0.007);糖尿病病程分别为(13.67±3.87)年、(10.55±4.16)年(P=0.000 1)。2组间体质量指数、血压、糖化血红蛋白、血脂、肾功能差异均无统计学意义。增殖型视网膜病变组较无视网膜病变组有较高的糖尿病肾病患病率,分别为70.6%、21.6%,P=0.000。外显子组测序结果显示目标区域的平均测序深度42×。发现已知非同义单核苷酸多态性14 386个,新的非同义单核苷酸多态性6 444个。结论应用目标区域捕获与外显子测序技术对2型糖尿病增殖型糖尿病视网膜病变进行测序分析显示,大量单核苷酸多态性可能与增殖型糖尿病视网膜病变相关,有待于进一步在大样本研究及实验研究中验证其在增殖型糖尿病视网膜病变发病中的具体作用。

目标序列捕获二代测序技术在苯丙酮尿症基因诊断中的应用

目的评估目标序列捕获二代测序技术在苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)基因诊断中的应用价值。方法采用目标区序列捕获及第二代测序技术对9例经典型PKU患者的苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因进行检测;采用Sanger测序技术对患者及其父母基因突变型进行验证。结果 9例患者检测到PAH基因的12种致病性突变,包括7种错义突变(p.I65T、p.F161S、p.Q204C、p.R241C、p.L242F、p.R243Q和p.Q375E),2种无义突变(p.R111X和p.Y356X),3种剪接突变[c.442-1G>A(IVS4-1G>A)、c.1315+6T>A(IVS12+6T>A)和c.1316-2A>C(IVS12-2A>C)],以及3种非致病性的变异(p.Q232Q、p.V245V和p.L385L),致病性突变均来自患者父母。其中,2个致病性突变未见报道,分别为c.1316-2A>C和p.Q375E(CAA->GAA)。结论目标序列捕获二代测序可以准确检测出PAH基因突变,对遗传病因明确的疾病具有一定的临床应用价值。

香蕉枯萎病菌pacC基因的克隆与序列分析

采用PCR和RT-PCR方法扩增尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f sp.cubense,FOC)1号和4号生理小种的pacC基因(FOC1-pacC,FOC4-pacC),对FOC1-pacC和FOC4-pacC相似序列进行搜索和比对,以及对基因编码蛋白进行结构预测,发现FOC1-pacC和FOC4-pacC开放阅读框分别为1 863、1 905 bp,编码634、620个氨基酸,2个小种之间基因序列和氨基酸序列差异明显,FOC1-pacC比FOC4-pacC缺少1个基因片段,FOC-pacC与其相似序列有显著差异,比对缺少2个基因片段;初入侵转录组表达分析说明,2生理小种pacC基因在小种侵染不同品种香蕉过程中表达有差异,FOC1-pacC基因只在粉蕉中检测到表达,而FOC4-pacC则在粉蕉和香蕉中都检测到表达,但在粉蕉中的表达量明显高于香蕉。

目标区域捕获技术鉴定-RP家系USH2A基因的新复合杂合突变

背景RP为遗传性致盲眼病，其遗传方式和临床表型呈高度异质性，对患者的突变基因进行筛查和诊断对于进一步的基因治疗研究有重要意义。目的利用目标区域捕获技术确定中国一常染色体隐性遗传RP家系成员的临床表型及基因突变方式。方法收集2013年暨南大学附属深圳眼科医院1个汉族RP家系，对该RP家系的4个成员进行眼科检查，抽取家系成员的外周血后，利用华大基因眼科芯片目标区域捕获技术对先证者进行基因突变检测，利用PCR以及Sanger测序法对RP家系中正常表型的成员进行基因突变点验证。结果该家系共3代5名成员，I1、I2、Ⅱ2和Ⅲ1均为表型正常者，Ⅱ1为先证者，自18岁出现夜盲及视力下降，呈管状视野缺损。先证者眼底检查发现视盘呈蜡黄色和视网膜骨细胞样色素沉积，荧光素血管造影可见片状遮蔽荧光和周边视网膜透见荧光。该家系遗传方式符合常染色体隐性遗传。芯片分析发现先证者USH2A基因存在由C．9958G〉T（P．Gly3320Cys）错义突变和C．11156G〉A（P．Arg3719His）错义突变组成的复合杂合突变，而其表型正常的父亲（I1）为C．9958G〉T（P．Gly3320Cys）杂合突变，表型正常的母亲（I2）为c．11156G〉A（P．Arg3719His）杂合突变，表型正常的女儿（Ⅲ1）为c．9958G〉T（P．Gly3320Cys）杂合突变。结论该RP家系可能由USH2A基因的C．9958G〉T和C．11156G〉A复合杂合突变导致。眼科芯片技术可以快速准确地筛查RP常见候选基因。