ABO血型基因编码区全长序列的研究及初步应用

【目的】研究ABO血型基因编码区全长序列及对疑难标本的初步应用。【方法】对6份已知ABO血型的血样进行DNA抽提,针对ABO基因启动子、所有外显子、部分内含子序列设计、合成一系列特异性引物,探索它的最佳PCR反应体系和扩增条件,获得的PCR产物直接进行序列测定。用建立的方法对2份ABO疑难血型的标本进行全长序列测定。【结果】得到ABO基因中A101、B、O01、O02、A102常见等位基因的ABO基因编码区全长核苷酸序列。疑难标本中:正定型为O型、反定型为B型的ABO基因定为O02/O21型;表型为O型的基因定为A102/O01型。【结论】建立起中国人群的ABO基因编码区全长标准序列信息库,并可运用于ABO疑难血型基因的研究中。

A_2亚型相关等位基因的CBF/NF-Y增强子区域多态性的研究

目的鉴别中国汉族人群ABO血型系统中A2亚型的ABO基因CCAAT-连接因子/NF-Y增强区域多态性。方法从2 940个随机选择的A或AB型中国人中筛选出的24个A2表现型,已确认其ABO基因型。PCR扩增所有样本的ABO基因5端调控(CBF/NF-Y增强子)区域,得到不同长度的片断产物,经胶回收后进行直接序列测定。结果7个含A201等位基因的样本在ABO基因CBF/NF-Y增强子区域,是4个43碱基长度重复的微卫星序列,15个含A205等位基因的样本在此区域是1个43碱基长度重复的微卫星序列,且核苷酸41位有碱基替代(G>A)。2个基因型为A102/B101的样本中未发现异常分子背景。结论A2相关等位基因的CBF/NF-Y增强子区域具有微卫星片段长度多态性。描述了中国汉族人群A2型相关等位基因的CBF/NF-Y增强子区域多态性。

糖尿病视网膜病变与候选基因(LW、IN)相关性的研究

目的探讨糖尿病视网膜病变与Landsteiner-Wiener、Indian血型基因的相关性。方法将53名临床诊断为糖尿病视网膜病变患者的血样作为实验组,同时随机采集160名非血缘关系无偿志愿捐献者外周血样作为对照组;以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和DNA直接序列测定技术同时检测Landsteiner-Wiener血型系统基因,以DNA直接序列测定技术检测Indian血型系统基因。采用Woolf法计算相对危险度值。结果实验组53份糖尿病视网膜病变患者样本均为LWa/LWa纯合型和INb/INb基因纯合型;对照组160份正常样血者的样本中,LW基因第1外显子多态性位置第308位碱基均为A,定为LWa/LWa基因型;IN基因第2个外显子多态性位置第252位碱基均为G,定为INb/INb基因型。结论糖尿病视网膜病变与LW、IN基因未发现有关联。

论非传染性的输血反应和其危险性

安全的输血治疗是现代医学治疗措施的基本保证,为了确保病人获得安全、有效的输血治疗,必须确定"输血安全性"(Transfusion safety)的概念;"输血安全性"与"血液安全性"(Blood safety)的概念有区别,"血液安全性"是指血液制品的安全性,而"输血安全性"是涉及到从献血者征集到受血者接受血液制品的整个过程,它除了需要考虑到"血液制品安全"外,更多的是要严密注意实施输血的各环节和步骤,包括输血前的配合试验,输血申请、血液发放、输注、监护和效果评估等.国际输血医学界的人士认为,当前影响"输血安全性"的主要因素是"非传染性的输血危险",输血工作重点开始由"血液安全性"向"输血安全性"转移,由"血液机构"向"医院"转移.……

血小板捐献次数对血浆铁铜锌含量及SOD活性影响的初步研究

目的研究单采血小板捐献次数对献血者血浆铁、铜、锌元素含量及血浆超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。方法本中心2020年8月25日~2021年8月25日的单采血小板捐献者128名,根据血小板捐献次数的不同分为4组,第1组为首次献血者,共30名;第2组1年内捐献机采血小板2~7次,共23名;第3组1年内捐献机采血小板8~14次,共29名;第4组1年内捐献机采血小板15~24次,共46名。均为男性,平均年龄(42±8.3)岁,且2年内未捐献过全血。采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测不同组别单采献血者血浆中的铁、铜、锌元素的含量,采用WST比色法试剂对血浆SOD活性进行检测,使用SPSS 19.0软件对所有数据进行统计分析。结果不同组别献血者血浆中铁、铜含量具有统计学差异(P<0.05),锌含量未发现统计学差异。由多重比较结果可知,首次献血者血浆铁含量(18.86 mmol)显著高于每年献血15~24次者(15.52 mmol)(P<0.05),其他组别间铁含量差异均不具统计学意义;首次献血者血浆铜含量(18.34μmol)显著低于每年献血15~24次者(20.9μmol)(P<0.05),其他组别间铜含量差异均不具统计学意义;所有组别两两间锌含量差异均不显著。不同组别献血者血浆SOD抑制率差异不具统计学意义。结论献血者1年内捐献单采血小板<15次,其血浆铁、铜、锌元素含量和血浆SOD活性未造成明显影响;但若≥15次,可见血浆中铁元素减少与铜元素增加的趋势。提示捐献单采血小板≥15次与献血者血浆铁、铜微量元素含量存在相关性,建议高频单采献血者在献血后的日常膳食中适当增加富铁食物的比例。

中国南方汉族人群HLA-A、B、DRB1基因的序列分析和单体型分布

目的分析中国南方汉族人群HLA-A、-B、-DRB1基因的序列多态性和单体型的分布情况。方法PCR-测序分型方法(sequence-based typing,SBT)对421名随机南方汉族个体的HLA-A、-B、-DRB1基因进行序列分析,进而采用最大似然性方法计算等位基因和单体型的分布频率。结果26个HLA-A等位基因中,频率>0.05的6种常见等位基因A*1101、A*2402、A*0207、A*0201、A*3303和A*0203的频率总和为78.15%;53个HLA-B等位基因中,频率>0.05的5种常见等位基因B*4001、B*4601、B*5801、B*1502和B*1301的频率总和为50.59%;36个HLA-DRB1等位基因中,频率>0.05的7种常见等位基因DRB1*0901、DRB1*1501、DRB1*1202、DRB1*0803、DRB1*1101、DRB1*0405和DRB1*0301的频率总和为60.21%。372条A-B、494条B-DRB1和1658条A-B-DRB1单体型中,分别有39、43和26条单体型,频率>0.005,其频率总和分别为66.07%、58.91%和34.30%,A*0207-B*4601、B*4601-DRB1*0901和A*0207-B*4601-DRB1*0901分别为其最主要单体型。结论获得了中国南方汉族人群HLA-A、-B、-DRB1基因的高分辨等位基因频率和单体型分布数据,进一步为人类学、法医学、移植配型和疾病相关研究提供了信息。

cis基因交换形成RHD-CE(2～9)-D等位基因

以往通过基因组DNA分析,分别在高加索人和中国人中观察到少数Rh阴性个体存在RHD基因第1和第10外显子,但是该等位基因形成的具体分子机制尚有争论。分别针对RHD基因mRNA的5′和3′非编码区设计一对特异性引物,通过逆转录PCR(RTPCR)和cDNA测序,分析2例RHD基因阳性(拥有第1和第10外显子)、D抗原表型阴性个体的全长mRNA/cDNA序列,同时以1例正常Rh阳性个体(CcDDee)作对照。结果正常Rh阳性个体拥有正常RHD基因mRNA,2名携带RHD基因的Rh阴性个体则均检出存在与正常RHD基因或RHCE基因转录产物相同长度、以及相同外显子构成的mRNA,但该转录子的第1和第10外显子及3′非编码区序列与RHD基因一致,而第2～9外显子全部序列与RHCE(e)基因mRNA相同,表明2名个体均存在RHDCE(2～9)D融合RHD等位基因,即其RHD基因的第2～9外显子被同源RHCE(e)基因替换,导致不能编码正常RhD蛋白,形成个体D抗原阴性表型。

广东汉族人群人类白细胞抗原-A,B及DRB1基因多态性和单倍型分布

目的分析广东汉族人群人类白细胞抗原(HLA)-A、B、DRB1基因和单倍型的分布特征。方法根据3 275名广东汉族无关骨髓供者的HLA基因型数据,采用最大似然性方法计算HLA-A、B、DRB1的基因频率和单倍型频率。结果广东汉族人群中共检出73个HLA基因(或抗原),其中A*02、A*11、A*24、A*33、B*46、B60、B*13、B75、B*58、DRB1*09、DRB1*15、DRB1*04、DRB1*08和DRB1*12最常见;385条A-B单倍型中,20条频率高于0.01并至少有25条单倍型为显著性正连锁不平衡;458条B-DR单倍型中,24条频率高于0.01并至少可见37条单倍型为显著性正连锁不平衡;2 836条A-B-DR单倍型中,仅487条单倍型的频率有价值(大于等于3.05×10-4),36条常见单倍型中A2-B46-DR9和A33-B58-DR17频率最高。结论广东汉族人群HLA-A、B、DRB1基因和HLA单倍型的分布有其自身特点,本研究所获得的HLA-A、B、DRB1基因和单倍型频率可作为广东汉族人群的参考标准。

广东汉族HLA-A、C、B、DRB1和DQB1基因的高分辨多态性及连锁不平衡分析

目的研究广东汉族人群的人类白细胞抗原(HLA)-A、C、B、DRB1和DQB1基因的高分辨多态性和等位基因间的连锁不平衡关系。方法PCR-测序分型方法(sequence-based typing,SBT)对144名随机广东汉族造血干细胞捐献者的HLA-A、C、B、DRB1和DQB1基因进行序列分析,并采用PyPop软件计算等位基因频率、单体型频率和连锁不平衡参数。结果发现1个新等位基因HLA-Cw*0340;HLA-Ⅰ类基因中,A、C、B基因座分别检出27、24和54个等位基因,其中频率>0.05常见等位基因包括A*1101、A*2402、A*0207、A*0201、A*3303、A*0203、Cw*0102、Cw*0702、Cw*0304、Cw*0801、Cw*0302、B*4601、B*4001、B*1301、B*5801和B*1502;HLA-Ⅱ类基因中,总共观察到30个DRB1和15个DQB1等位基因,频率>0.05的常见等位基因见于DRB1*0901、DRB1*0301、DRB1*1501、DRB1*1202、DRB1*0803、DRB1*1101、DRB1*1602,DQB1*0303、DQB1*0301、DQB1*0502、DQB1*0601、DQB1*0201、DQB1*0302和DQB1*0501;除A-DQB1最常见单体型为A*1101-DQB1*0301外,其它所有两座位单倍型以及A-C-B、A-B-DRB1和A-C-B-DRB1-DQB1扩展单体型的最常见型均由A*0207、Cw*0102、B*4601、DRB1*0901和DQB1*0303组合而成。任意2个HLA基因间均具有强的连锁不平衡,而21.99%—31.63%的有价值连锁不平衡单倍型具有统计学意义(χ2>3.84,P<0.05),其中频率≥0.01的有156条。结论获得了广东汉族人群HLA-A、B、C、DRB1和DQB1基因的等位基因和单体型多态性及连锁不平衡分析数据,为HLA基因的相关研究和应用提供了更加详细的参考资料。

应用不同类型白血病患者群体HLA-A、B和DRB1遗传学数据评估HLA相合供者的概率

目的探讨不同类型白血病汉族患者群体找到HLA-A、B和DRB1低分辨全相合无关供者可能性。方法依据1201名急性淋巴细胞白血病(ALL)、1065名急性非淋巴细胞白血病(AML)和1432名慢性粒细胞白血病(CML)汉族患者群体HLA-A、B和DRB1低分辨分型结果,计算这3类白血病汉族患者群体的HLA-A、B和DRB1抗原频率,单体型频率和表型频率,联合应用中华骨髓库(CMDP)中健康汉族供者HLA表型频率数据,进一步推导出这3类白血病汉族患者群体找到至少1名HLA低分辨全相合供者概率及回归方程。结果ALL、AML、CML汉族患者群体表型种类数分别为416851、373903和464373种,其中31%的表型频率均>1/100万;ALL、AML、CML汉族患者群体在CMDP的汉族供者群体中找到至少1名HLA表型相同供者回归方程分别为:P=0.0824LgN-0.3667、P=0.0825LgN-0.3636和P=0.0829LgN-0.3644;计算出81.6%的ALL、81.9%的AML、82.4%的CML汉族患者要找到1名HLA低分辨表型相同的无关供者,CMDP中汉族有效供者群体数平均146.7万。结论应用不同类型白血病患者群体HLA-A、B和DRB1遗传学数据评估患者找到HLA相合供者概率较仅以健康供者群体HLA遗传学数据评估更为精确。为有效地提高患者的移植效果,需要征募更多的无关供者。

染色体分析及FISH法对急性早幼粒细胞白血病诊断的临床意义

目的探讨染色体分析及FISH检测对急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断的临床意义。方法骨髓标本经细胞培养后,采用染色体G带显带方法分析是否存在t(15;17),同时用FISH方法进行与t(15;17)相关的PML-RARα融合基因的检测。结果38例确诊APL的患者中,病理形态学检出率为92.1%(36/38),染色体分析36例发现克隆性t(15;17)存在,检出率为92.1%;FISH检测发现所有病例均存在PML-RARα融合基因,检出率为100.0%。结论染色体分析及FISH检测t(15;17)相关的PML-RARα融合基因是诊断APL的可靠指标;其中FISH检测更为敏感。

Flow-rSSO与PCR-SSP方法在骨髓库HLA基因分型中的应用比较

目的比较流式反向序列特异性寡核苷酸探针方法(Flow-rSSO)与聚合酶链式反应-序列特异性引物方法(PCR-SSP)在骨髓库人类白细胞抗原(HLA)分型中的应用价值。方法4769例中华骨髓库质控样本中,已采用PCR-SSP方法分型的3509例标本应用FLOW-rSSO方法复检,而1260例已采用FLOW-rSSO方法分型样本则应用PCR-SSP方法复检,结果不一致样本采用PCR-测序分型方法(SBT)进行确认。结果PCR-SSP方法HLA分型错误率(6.84‰)明显高于Flow-rSSO方法(1.59‰),其中PCR-SSP方法中75%的错误结果是由于漏检造成;PCR-SSP方法的模棱两可分型结果比例(2.56‰)明显低于Flow-rSSO方法(16.67‰)。结论PCR-SSP方法和FLOW-rSSO方法均适合应用于中华骨髓库供者的HLA分型,但HLA分型实验室有必要同时建立两种HLA分型方法。

RHD第9内含子全长序列分析

目的了解RHD第9内含子碱基变异对其正常剪切是否存在影响。方法采用PCR方法扩增和测序分析中国汉族1名正常Rh阳性个体和2名DEL(D放散型)表型个体[携带RHD(1227A)等位基因]的RHD第9内含子,并做相互比对,同时通过NCBI Basic BLAST与参考序列(GenBank BN000065)加以比对。结果在3名中国汉族个体的第9内含子中,共观察到28处碱基变异(EMBL/GenBank/DDBJ EU372940～2),其中7处变异相同,可能为中国人第9内含子的特异性碱基变异;另有1处碱基变异仅在DEL样本中检出,在正常Rh阳性个体中未发现,可能为DEL特异性。结论未发现中国汉族人DEL第9内含子存在可能影响正常拼接的碱基变异,提示DEL mRNA缺失第9外显子相应的序列的分子机制即1227A>G碱基突变造成错误拼接所致。

供、患者HLA-A、B、DRB1高分辨分型的无关供者外周血造血干细胞移植32例回顾分析

目的探讨供、患者的人类白细胞抗原HLA-A、B、DRB1基因高分辨相合及亚型相合,无关供者外周血造血干细胞移植后效果的情况,为临床造血干细胞移植治疗选择适配供者提供理论依据。方法采用PCR-SSP或SBT技术对供、患者HLA-A、B、DRB1的基因进行高分辨分型,定期随访患者在造血干细胞移植后状况,统计分析移植后效果。结果32例患者与供者的HLA低分辨分型结果完全相合,HLA-A、B、DRB1基因高分辨分型全相合的患者与HLA-A、B、DRB1基因高分辨分型不相合的患者,造血干细胞植活和两年半内的移植存活率比较,无统计学差异。结论HLA低分辨分型结果完全相合是临床医生选择造血干细胞移植的重要条件之一,供、患者HLA-A、B、DRB1高分辨分型是外周血造血干细胞移植治疗前组织配型不可少的实验之一,但HLA-A、B、DRB1基因高分辨分型错配对无关供者外周血造血干细胞移植的造血干细胞植活和两年半内的移植存活率影响较小,HLA基因高分辨分型可以帮助临床医生选择合适的供者。

A放散型血型分子遗传结构的研究

目的研究A放散型血型的分子生物学特性。方法对5例血清学定为Ael或AelB的个体,采用4对特异性引物进行PCR扩增后,对其ABO基因的第6、7外显子进行序列测定。且对其中1例表型为AelB样本的ABO基因转录结构进行序列分析。结果1例表型为Ael的样本含已报道的Ael01基因,1例表型为Ael的样本含Ael05基因,2例表型为AelB和1例表型为Ael的样本未测出任何A等位基因,而是含有261G缺乏的O01或O02基因。结论A放散型血型分子结构呈多样性,含261G缺失的O等位基因的样本有弱A抗原表达的机理有待说明。

一个RHD 270A等位基因家系研究

目的 调查 Rh血型 D抗原基因 ( RHD gene,RHD)阳性、D抗原阴性等位基因的家系遗传。方法 根据 RHD2 70 A等位基因序列设计 1对特异性引物 ,建立序列特异性引物 -聚合酶链反应方法 ,检测了一个 RHD2 70 A等位基因先证者的 6名家系成员 ,同时采用限制性片段长度多态性方法鉴定了全部家庭成员的 RHD基因杂合型。结果 RHD2 70 A等位基因分别在先证者、其父亲和叔父中检出 ,但其祖母检测为阴性 ,提示该等位基因可能来源于其祖父。RHD基因杂合型鉴定显示叔父和父亲均有 1条正常的RHD基因、为 RHD2 70 A隐性携带者 ,其母亲为 RHD基因杂合型 ( RHD+ / RHD- ) ,该例 Rh基因型为RHD2 70 A/ RHD- ,从而形成 RHD基因阳性、D抗原阴性特性。结论 RHD2 70 A等位基因为亲代遗传基因 。

一个中国汉族ABO血型B亚型家系中发现新的B等位基因

目的 研究中国汉族人群ABO血型中B亚型的分子遗传背景,发现并鉴定ABO新等位基因。方法 随机选择10个正常的B型志愿捐血者样本作对照,对6例血型血清学鉴定为B亚型的样本,采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法、ABO基因第6及第7外显子PCR产物直接测序,进行基因定型;并对B等位基因的第6外显子、第6内含子及第7外显子进行基因克隆和单倍体测序分析。结果 2例血清学为Bx、BW的B亚型样本中,发现一个新的B等位基因。该等位基因与B1 0 1 等位基因相比,差异仅在第7外显子nt6 95位T>C突变。进一步对其中一个Bx 血型的个体进行家系调查,结果该家系的11人中,7人带有该新B等位基因。而其余的4例B亚型样本及10例对照样本,ABO基因的第6、7外显子未发现新的点突变。结论 首次发现6 95 T>C变异的新B等位基因,该等位基因nt6 95位由T转变为C,2 32位氨基酸由亮氨酸转变为脯氨酸,可导致糖基转移酶活性的降低,表明ABO基因的第2 32位氨基酸对决定糖基转移酶活性至关重要。

H抗原缺乏血型个体FUT1和FUT2基因的序列分析

目的 探讨H抗原缺乏血型个体的FUT1和FUT2基因分型及测序结果.方法 选择2005-2014年深圳血液中心检出的13例H抗原缺乏血型个体为研究对象.采用常规血型血清学红细胞抗原、抗体凝集试验,对研究对象血液样本进行ABO正、反定型,Lewis血型及H抗原的鉴定;其中A或B抗原弱表达的样本,采用吸收及放散试验方法进行进一步抗原特异性鉴定.采用唾液凝集抑制试验,检测研究对象唾液样本中的ABH抗原物质.采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）、DNA直接测序及克隆测序的分子生物学方法,分析研究对象血液样本DNA的FUT1和FUT2基因序列.结果 13例H抗原缺失血型个体中有10例为H抗原缺乏-分泌型血型,2例为H抗原部分缺乏-分泌型血型,1例为H抗原缺乏-非分泌型血型.13例H抗原缺乏血型个体中FUT1基因型分布如下：3例为h547-552delAG/h547-552delAG,4例为h880-882delAG/h547-552delAG,2例为h880-882delTT/h880-882delTT,1例为h328G＞A/h360-400delGGTATTCCGCATCACCCTGCCCGTGCTGGCCCC（共33个碱基）,1例为h328G＞A/h880-882delTT,1例为h35C＞ T/h328G＞ A;658C＞T,1例h658C＞T/h658C＞T.13例H抗原缺乏血型个体样本的FUT2基因型分布如下：4例为正常野生型Se357 Se357,7例为Se357 se357,385,1例为Se357,716 Se357,716,1例为se357,385 se357,385.结论 FUT1和FUT2基因的点突变和碱基缺失是H抗原缺乏血型的分子基础.