亲和素蛋白与含有生物素的支撑平面膜之间相互作用的研究

生物功能分子的二维有序化组装是分子工程学的重要内容。本文通过构建有生物素受体的人工模型膜，对亲和素与生物素这一具有极强亲和力的系统之间的特异性相互作用的某些制约因素进行了探讨．应用ＬＢ膜技术结合激先椭圆偏振术和表面等离激元谱技术，较深入地研究了蛋白质与脂单层膜发生的非特异性吸附，特异性结合以及结合的侧向空间位阻效应．实验结果表明，膜表面电荷对非特异性吸附的速率有很大的影响，而对最终的蛋白吸附量影响不大；非特异性的吸附可以通过二阶阳离子的脱附而去除；受体蛋白质与配体间的特异性结合受到侧向空间位阻效应的制约．

生物弹道法基因导入技术及影响其有效性的因素

生物弹道法(Biolistic proccess)基因转染技术,又称基因枪技术。自1987年美国Cornell大学的J.C. Sanford等首先发明了这项技术以来,随着生物弹道装置和技术的不断改进和商业化,这项基因转移技术被迅速广泛运用于各类基因工程中。较之其它通用的基因导入技术,它具有简便,快速和普适性强等优点。这项技术的发展仍方兴未艾。我们在1991年研制了ZHFQ-1新型撞击式基因枪,这几年来。

纯钛表面梯度生物活性涂层材料生物相容性研究

目的评价复合氧化及水热沉淀法制备纯钛表面梯度生物活性涂层材料生物相容性和骨诱导能力。方法通过对L929成纤维细胞和M373成骨细胞体外细胞培养进行细胞相容性实验和动物颅骨植入实验评价梯度羟基磷灰石(HA)涂层生物相容性和骨诱导能力。结果涂层表面L929成纤维细胞附着与增殖实验提示多孔的羟基磷灰石表面涂层对细胞的黏附生长有诱导作用,促进细胞在其表面繁殖。体外细胞毒性实验提示各组材料对M373成骨细胞的生长、增值、代谢无不良影响。在细胞接种后期HA试件组的细胞增殖数较其他组有显著增加。颅骨植入实验提示羟基磷灰石涂层组在诱导成骨反应方面优于其它组。结论复合氧化及水热沉淀法制备纯钛表面梯度生物活性涂层材料具有良好的生物相容性和骨诱导能力,值得作为新型颅骨修补材料。

辐射灭菌对壳聚糖管力学性能和生物降解性的影响研究

采用剂量为 25 kGy 的 γ 射线对壳聚糖管进行辐射灭菌, 并测试了其体外降解性能、溶胀性能和力学性能。结果表明,γ 射线辐射灭菌明显降低了溶菌酶对壳聚糖管的降解速率和其在水溶液中的溶胀,并显著提高了其拉伸强度和弹性模量。同时,运用傅里叶红外光谱(FTIR)、X 射线衍射(XRD)和差热分析(DSC)表征了辐射灭菌前后壳聚糖材料的化学结构和结晶形态,探讨了辐射灭菌对壳聚糖管性能影响的机制。

生物三维电子显微学进入全新高速发展时期

生物三维电子显微学主要由三个部分组成——电子晶体学、单颗粒技术和电子断层成像术,其结构解析对象的尺度范围介于X射线晶体学与光学显微镜之间,适合从蛋白质分子结构到细胞和组织结构的解析。以冷冻电镜技术与三维重构技术为基础的低温电子显微学代表了生物电子显微学的前沿。低温单颗粒技术对于高度对称的病毒颗粒的解析最近已达到3.8"分辨率,正在成为解析分子量很大的蛋白质复合体高分辨结构的有效技术手段。低温电子断层成像技术目前对于真核细胞样品的结构解析已达到约40#的分辨率,在今后5年有望达到20$。这样,把X射线晶体学、NMR以及电镜三维重构获得的蛋白质分子及复合体的高分辨率的结构,锚定到较低分辨率的电子断层成像图像中,从而在细胞水平上获得高精确的蛋白质空间定位和原子分辨率的蛋白质相互作用的结构信息。这将成为把分子水平的结构研究与细胞水平的生命活动衔接起来的可行途径。

不同脱乙酰度和分子量壳聚糖的生物相容性之比较

目的 :壳聚糖是天然多糖几丁质部分脱乙酰基后的产物 ,是一种良好的生物材料。本文研究了四种来源相同 ,不同脱乙酰度和分子量壳聚糖的生物相容性。方法 :应用四唑盐比色法(MTT)研究了宫颈癌细胞 (Hela细胞 )在四种壳聚糖膜上的细胞活性和生长状况 ,并通过酶联免疫技术 (EL ISA)和圆二色法 (CD)测定了人血清白蛋白 (HSA)在这四种壳聚糖膜上的吸附量以及吸附后 HSA二级结构的变化。结果 :MTT结果表明 :生长在脱乙酰度为 74 .7%壳聚糖膜上的Hela细胞的活性最高。ELISA结果表明 :脱乙酰度为 74 .7%壳聚糖膜对 HSA的吸附量较小 ,其三种壳聚糖对 HSA的吸附量较高。圆二色法结果表明 :吸附在脱乙酰度为 74 .7%壳聚糖膜上的HSA的二级结构与其他三种壳聚糖吸附 HSA的结果差异较大。讨论 :从这四种壳聚糖的脱乙酰度 ,壳聚糖膜表面的氨基含量以及亲水性等方面讨论了 HSA在四种壳聚糖上的吸附量 ,吸附后二级结构的差异以及

表面等离激元共振生物传感器研究整合素蛋白α_(Ⅱb) β_3与RGD多肽的特异结合

整合素蛋白αⅡbβ3 是血小板上的一种钙依赖性膜受体 ,其胞外结构域可与含有RGD序列的肽链特异结合 .通过将含有NTA DOGS的磷脂单分子层膜转移到 5 0nm厚的金膜上 ,制备了一种含有NTA头部的表面等离激元共振 (SPR)传感器敏感膜 .设计并合成了含有 6个组氨酸和RGD基团的His tagged短肽P1,并利用SPR生物传感器 ,对整合素蛋白与含有RGD配基的支撑平面膜的特异相互作用以及Ca2 + 、Mn2 + 对该相互作用的影响进行了研究 .结果表明 ,NTA敏感膜能很好地将P1锚定在支撑平面膜表面 ,并能够保证P1维持一个有效的定向 .将Ca2 + 从低结合位点去除或加入Mn2 + 都能够增加整合素蛋白的配基结合活性 .二价阳离子对整合素蛋白配基结合能力的调节作用 。

黄芪对人红细胞膜脂流动性及膜蛋白构象的影响

用荧光偏振、圆二色谱(CD)和准弹性光散射等实验技术研究了中药黄芪对人红细胞膜的作用。黄芪能增加人红细胞膜脂流动性,增加膜蛋白中α-螺旋的含量,对膜表面电荷也有影响。黄芪对膜蛋白的作用比对膜脂作用更敏感。黄芪对人红细胞膜作用的一个重要环节可能是保护人红细胞膜免受自由基的攻击。

川芎嗪对小鼠红细胞膜的影响

用荧光偏振、圆二色谱和准弹性光散射等实验技术研究了中药有效成分川芎嗪对小鼠红细胞膜的作用。川芎嗪能增大小鼠红细胞膜脂流动性、减少膜蛋白中α螺旋的含量、增加膜表面负电荷。膜表面负电荷的增加有助于血液的抗凝和解凝。

圆二色光谱技术应用和实验方法

圆二色光谱对研究蛋白质二级结构、构象变化以及其他手性化合物结构是很重要的。该文从圆二色光谱的概念、原理和特点出发,介绍了圆二色光谱技术在蛋白质和药物分子结构分析上的应用和实验方法。

淀粉样蛋白Aβ的插膜作用可以抑制其形成纤维

作为老年性痴呆(AD)患者脑中淀粉样斑块的核心蛋白,β-淀粉样蛋白(Aβ)是从淀粉样前体蛋白(APP)水解而来。该蛋白是多种长度多肽的混合物,其中Aβ40和Aβ42是主要组分。分别研究了膜中胆固醇含量及溶液pH对Aβ40和Aβ42形成纤维的影响。电镜观察发现,含有胆固醇的脂质体几乎可以完全抑制Aβ40的纤维形成,而低pH只能部分地抑制Aβ42的纤维形成。单层膜的实验证明这两种因素都有利于Aβ40和Aβ42的插膜。构象研究表明插膜会诱导Aβ40和Aβ42的二级结构发生不同的变化。结果说明,Aβ40和Aβ42的插膜作用能够在一定程度上抑制蛋白形成纤维,但两者具有不同的抑制机制。

膜表面质子可能是ATP合成的主要驱动力

利用细胞压破碎仪破碎鼠肝线粒体，得到了具有良好生物活性的ＳＭＰ，其呼吸控制率为１．４。分别采用荧光探针ｏｘｏｎｏｌＶＩ和ａｃｒｉｄｉｎｅｏｒａｎｇｅ，利用荧光淬灭法测定了丙二酸滴定过程中，ＳＭＰΔΨ和ΔｐＨ的变化趋势，结果表明：当丙二酸浓度达到０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ时，ΔΨ的建立完全被抑制，而ΔｐＨ仍然保持了８３．９％。当丙二酸浓度达到１．００ｍｍｏｌ／Ｌ时，ΔｐＨ的建立才完全被抑制。ＳＭＰＡＴＰ合成活性的测定显示，当ΔΨ的建立被完全抑制，而ΔｐＨ仍然存在时，仍有部分ＡＴＰ合成活性（３４．１％）。上述现象为膜表面高能质子是ＡＴＰ合成的主要驱动力的观点提供了又一佐证。此外，当丙二酸浓度从０ｍｍｏｌ／Ｌ增加到０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ时，尽管ΔΨ与ΔｐＨ的变化不很大，但ＳＭＰＡＴＰ合成活性却出现明显降低，与氧化呼吸链活性的变化类似，二者呈对数关系，也表明ＡＴＰ合成很可能与ΔμＨ＋并不直接相关。

豚鼠耳蜗离体外毛细胞的膜电位和离子电流

利用膜片钳技术对分离的豚鼠耳蜗外毛细胞(OHC)进行了研究,结果表明:(1)新分离的正常OHC呈柱状,胞膜先滑,胞核位于底部,静纤毛由顶端表皮板伸出,4小时内形态无明显变化.(2)全细胞电压钳记录结合通道阻断剂实验表明,OHC膜电流主要由电压依赖性钾离子流组成.(3)利用全细胞记录方式得到的OHC静息电位值为-26±9mV((?)±SD,n=10).

利用细胞装配系统直接形成组织工程三维复合支架

目的:为克服目前组织工程中细胞和材料的复合方法中存在的缺陷,利用细胞装配系统将细胞和材料的共混物按照预先设定的结构直接打印成三维复合支架,并通过体外培养检测支架里细胞的形态和活性。方法:实验于2006-06/2007-03在清华大学生物膜与膜生物工程国家重点实验室和清华大学机械系组织制造中心完成。①选用海藻酸盐和明胶的混合水凝胶作为支架材料,配制终浓度为7%且藻酸盐和明胶比例为3∶4的混合物,用CaCl2溶液交联后,冷冻干燥,用扫描电镜观察共混材料的内部结构。②取出生3～5 d的新西兰乳兔的关节软骨组织,用Ⅱ型胶原酶消化获得原代软骨细胞并体外扩增至2或3代后备用。③将软骨细胞悬液与复合水凝胶混合均匀后,再利用快速成形技术组装的细胞装配系统将此共混物直接打印成组织工程三维复合支架,并体外培养此复合支架。④在培养的1,7,14和21 d采用MTT的方法检测软骨细胞在支架中的增殖;培养7 d后用苏木精-伊红染色的组织学方法观测细胞的形态;培养14 d后采用免疫组化检测支架中软骨细胞的Ⅱ型胶原表达。结果:①扫描电镜观察的结果表明共混物的内部是交错的网格结构,有着互相连通的孔。②在细胞装配系统上按照预先设计的参数将细胞和材料直接组装为网格状的细胞/凝胶复合支架,尺寸为10 mm×10 mm×6 mm,锥虫蓝染色表明成形后支架里细胞的存活率大于90%。③MTT实验表明软骨细胞在细胞/凝胶的支架里增殖很快,21 d的吸光度是1 d的3.5倍。④苏木精-伊红染色显示体外培养7 d后,复合支架里的软骨细胞都是圆形的,是生理状态下软骨细胞的正常状态,而且还可以看到正在分裂的细胞。⑤免疫组化的结果表明培养14 d后,培养在支架里的软骨细胞仍保持着分泌Ⅱ型胶原的活性。结论:通过细胞装配系统按照预先设定的结构形成包含细胞的软骨组织工程三维支架,成形的一系列操作对细胞损伤极小,并且支架里的软骨细胞在体外培养中能够正常的生长,具有生理形态和软骨活性,从而为软骨修复提供了新途径。

分子识别诱导的蛋白质和核酸多层膜的有序组装

通过生物大分子之间的特异性结合，采用表面等离激元共振技术监测，报导了支撑于固体表面脂单层膜上进行的亲和素、生物素标记的质粒ＤＮＡ、以及从系统性红斑狼疮患者血清中获得的抗ＤＮＡ抗体多层膜的有序组装。这种生物大分子的组装技术可以用于生物传感器以检测特定的抗原抗体。

γ-射线辐照对壳聚糖薄膜的改性研究

由于神经受损之后难以自发成功再生 ,经常导致永久性机体功能丧失。所以对损伤神经进行修复就显得格外重要。目前的修复方法之一是用生物可降解的人工神经导管 ,用这种神经修复导管提供神经再生所需的“微环境”以诱导神经再生〔1,3〕。壳聚糖是一种天然氨基多糖 ,具有良好的生物相容性和可降解性 ,因此可用壳聚糖作为人工神经导管材料。但在实际的临床应用中 ,用壳聚糖做的神经导管还存在许多有待解决的问题 ,如材料机械性能较差 ,特别是韧性。针对这一问题 ,本文采用 γ-射线辐照对壳聚糖进行了改性研究 ,以期获得有利于其韧性提高的措施。结果发现辐射剂量在一定范围 ,经 γ-射线辐照的壳聚糖薄膜的机械性能得到了明显地提高 ,并且在此辐照范围内 。

胆固醇对二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）多层膜结构的影响

用小角Ｘ射线衍射（ＳＡＸＤ）和差示扫描量热（ＤＳＣ）方法研究胆固醇对二棕榈酸磷脂酰胆碱多层膜结构的影响。在不同胆因醇浓度及不同温度下的衍射实验和热吸收曲线实验显示纯磷脂的尖锐的凝胶－液晶相变随胆固醇含量增加而逐渐消失。当胆固醇含量约为４０（ｍｏｌ）％或更多时，衍射曲线和热吸收曲线均显示存在分相现象。

显微红外研究巨噬细胞膜电融合后膜蛋白二级结构的变化

首次尝试了将显微傅里叶变换红外光谱术应用于研究电融合后细胞膜蛋白质二级结构的变化，发现脉冲电场作用于细胞具有穿透效应，施加电脉冲后，整个细胞的蛋白质体系能量增加，表明电脉冲对蛋白质的二级结构影响很大；同时，还发现用唾液酸苷酶和蛋白酶Ｐｒｏｎａｓｅ分别处理巨噬细胞膜表面后，膜上蛋白质二级结构无序化程度增加，用酶适度处理的细胞将更易发生电融合。

磷脂酶C诱导膜融合的初步研究

用光散射、电镜和荧光共振能量转移技术研究了ＰＬＣ诱导两种单一膜脂组分的模型膜即二油酸磷脂酰胆碱（ＤＯＰＣ：ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈａｐｈｅｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）脂质体和二豆蔻酰磷脂酰胆碱（ＤＭＰＣ：ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｅｌｏｎｅ）脂质体膜融合的可能性。结果表明：ＰＬＣ可以引起ＤＯＰＣ脂质体的融合。在相同的条件下，未见到ＤＭＰＣ脂质体的融合。这就首次证明了ＰＬＣ诱导单一组分脂质体融合的可能性。结果还表明：ＰＬＣ诱导脂质体膜融合的可能性大小与膜脂结构有关。用大鼠血影膜、人红细胞膜、大鼠巨噬细胞膜和大花萱草花瓣原生质体膜等天然生物膜作为材料，研究了磷脂酶Ｃ（ＰＬＣ：ｐｂｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＣ）诱导上述各种天然膜融合的可能性，均未观察到膜融合现象。提示ＰＬＣ不易诱导天然细胞膜的融合。