CRISPR/Cas9技术在热带作物育种中的应用研究进展

在热带地区种植的香蕉、番木瓜、甘蔗、木薯、天然橡胶、油棕等热带作物,是我国农业的重要组成部分,不仅为我们的日常生活和工农业生产提供了重要的原材料,而且为我国热带与亚热带地区的主要农业产量和经济增长做出了贡献。然而,这些作物的现代分子育种受其生物学特性和遗传复杂性的严重阻碍,多倍化、杂合性、无性繁殖、童期长和植株高大等问题导致热带作物的传统杂交育种周期长、难度大、进展慢。基因编辑技术的发展为热带作物育种带来了新途径和新机遇。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术以其更高的靶向效率、多功能性和易用性,已被广泛应用于植物基因组编辑育种中。近年来,该技术在香蕉、木薯、天然橡胶、甘蔗等热带作物上也实现了广泛应用。本文介绍了基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑、CRISPR-Cas9在热带作物改良中的应用进展以及所面临的挑战和问题,同时对热带作物基因编辑育种方面提出建议,以期为后续研究提供思路,并为进一步开发应用该技术以有效改良热带作物的植物性状提供参考。

近年我国甘蔗品种的育种成就与发展趋势

甘蔗是我国主要的糖料作物,不断进行品种改良更新是甘蔗产业持续发展的重要保障。近20年来,我国甘蔗育种机构根据主产蔗区旱坡地蔗区占70%以上,当家品种‘新台糖22号’、‘新台糖20号’等低产低糖的状况,不断收集和引进优异甘蔗种质资源,使我国种质资源总量达5962份,发掘和创制了‘CP81-1254’、‘桂糖92-66’、‘云蔗94-343’等一批优异育种亲本;同时,攻克杂交利用技术,研究形成集“家系评价、早期抗性鉴定、糖分高效检测、理想株型选择”为一体的育种技术体系,成功育成了‘桂糖42号’、‘桂柳05136’、‘云蔗081609’、‘桂糖44号’、‘云蔗0551’等一批高糖高产新品种,实现了我国第五代品种更新。面对我国蔗糖产业发展的新要求,当前我国甘蔗育种还存在适宜机械化作业的品种改良滞后和甘蔗生物育种进展缓慢等问题,今后将加强以机械化应用为目标的抗倒伏、宿根性强、分蘖力强的品种选育,加快转基因甘蔗新品种的培育,持续强化健康种苗的繁育推广应用。

品种和种植密度对木薯茎叶生物量及营养品质的影响

研究旨在探讨品种和种植密度对木薯茎叶产量、农艺性状及营养品质的影响。以木薯桂热891、云热薯2号、华南205为试验材料,选择品种(A)、种植密度(B)两个因素进行随机区组设计,在云南干热河谷区进行7个种植密度的田间比对试验。结果显示,木薯茎叶产量随种植密度增加呈先升高后下降的趋势,按B6、B5种植可收获较高的茎叶产量,低种植密度比高种植密度更适合茎叶干物质的积累。株高随种植密度的增加呈升高趋势,而茎粗则逐渐下降。根据平均隶属函数结果可知,A1、A3按B4种植营养品质最佳,A2按B2种植营养品质最佳,且粗蛋白含量相对较高。不同品种间,A2、A3的产量、农艺性状、营养品质优于A1。研究表明,云热薯2号为适宜云南干热河谷区种植品种,其适宜种植密度为50 000株/hm2,可收获较高的茎叶生物产量,且营养品质佳。

中糖2号在国家第13轮甘蔗品种区试的综合评价

为研究甘蔗新品种中糖2号在全国各个蔗区的适应性,中糖2号参加了2018—2020年在全国5省区18个区试点开展全国甘蔗新品种第13轮联合区试1年新植2年宿根区域试验。结果表明,以全国18个区试点的数据结果统计,1年新植2年宿根平均蔗产量6734 kg/667 m^(2),比对照ROC22增产11.16%,14点次增产;平均含糖量957 kg/667 m^(2),比对照ROC22增产7.29%,12点次增产;11—12月平均甘蔗蔗糖分为13.67%,1—3月平均甘蔗蔗糖分为15.30%,全期平均甘蔗蔗糖分为14.52%,比ROC22低0.20个百分点。第1年新植蔗产量6598 kg/667 m^(2),平均含糖量900 kg/667 m^(2),全期平均甘蔗蔗糖分13.57%;第1年宿根平均蔗产量6693 kg/667 m^(2),比ROC22增产15.66%,平均含糖量1017 kg/667 m^(2),比ROC22增产13.25%,全期平均甘蔗蔗糖分15.28%;第2年宿根平均蔗产量6963 kg/667 m^(2),比ROC22增产26.53%,平均含糖量952 kg/667 m^(2),比对照ROC22增产17.10%,全期平均甘蔗蔗糖分为14.75%。平均甘蔗纤维分为11.80%,比对照ROC22高0.70个百分点。通过人工接种鉴定对黑穗病的抗性级别为1级,抗性反应型为高抗;对花叶病的抗性级别为2级,抗性反应型为高抗。中糖2号高抗黑穗病,适宜机械收获。

橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库构建及HbHDA6互作蛋白筛选

次生乳管是天然橡胶合成和贮存的场所,是由橡胶树树干树皮中维管形成层细胞分裂分化而来。次生乳管的数量与天然橡胶产量直接相关,而这些乳管的数量取决于形成层分化次生乳管的频率(乳管分化能力),是橡胶树产量育种的主要指标。前期研究中,我们发现组蛋白去乙酰化酶(HDA)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)能诱导橡胶树乳管分化且组蛋白去乙酰化酶基因(HbHDA6)能够参与橡胶树乳管分化调控。由于组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制尚未阐明,因此该文使用冠菌素(COR)诱导橡胶树形成层分化产生次生乳管的实验系统,以分离形成层组织为材料,构建酵母双杂交cDNA文库,以HbHDA6基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与HbHDA6相互作用的蛋白。结果表明:(1)利用Gateway技术构建的均一化COR诱导橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库,初级文库的容量为6.34×10^(6)CFU·mL^(-1),总单克隆数为1.27×10^(7),文库重组率为100%;次级文库的容量为7.72×10^(6)CFU·mL^(-1),总单克隆数为1.54×10^(7),文库重组率为100%。初级文库和次级文库的插入片段平均长度分别为1.1 kb和1.2 kb。(2)成功构建了筛选HbHDA6互作蛋白的pGBKT7-HbHDA6诱饵载体,并确认无自激活活性。(3)使用该诱饵载体对构建的酵母双杂交cDNA文库进行筛选,并通过NCBI_BLAST比对和去除重复以后,获得了22个与HbHDA6发生互作的蛋白,包括CLP1、ERF3、ERF4、HSP82、LARP6a、APT5、PP2A、FBA6等。该研究成果为解析组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制提供了理论基础,为转基因改良橡胶树的产胶潜力提供了候选基因,为高性能天然橡胶遗传改良育种提供了新线索。

多胺对荔枝胚性愈伤组织增殖与体胚发生的影响

为探讨外源多胺(PAs)对荔枝胚性愈伤组织(EC)增殖及体胚发生的影响机制,该研究以“妃子笑”荔枝EC为材料,采用单因素法在增殖培养基中添加腐胺(Put)、亚精胺(Spd)及精胺(Spm),分析了不同PAs处理后EC的形态、结构、内源PAs含量及相关酶指标的变化。结果表明:(1)外源Put、Spd和Spm处理均显著提高了EC增殖率,减少了体胚诱导及萌发数量。经外源PAs处理增殖的EC胚性细胞大小较一致,染色深且均匀,多细胞原胚减少,可见已经分化完全的早期子叶胚。(2)外源PAs处理均显著提高了EC中内源PAs含量,其中Put处理的EC中各类内源PAs及总PAs含量最高;当在含外源PAs培养基上增殖的EC转入不含外源PAs的培养基上增殖时(恢复培养),EC中的Put含量仍然显著高于对照,内源Spd和Spm则显著降低。(3)外源Put处理显著提高了EC中的鸟氨酸脱羧酶(ODC)、精氨酸脱羧酶(ADC)和二胺氧化酶(DAO)活性,而外源Spd、Spm处理显著降低了EC中的ODC及ADC活性,外源Spd显著提高了多胺氧化酶(PAO)活性;恢复培养后,EC中ADC和DAO活性比恢复培养前显著降低,ODC和PAO无显著性差异。综上认为,外源PAs可以通过调节PAs代谢相关酶活性影响内源PAs含量,进而影响荔枝EC增殖和体胚诱导。该研究结果为进一步研究PAs调节荔枝体胚发生机制及提高荔枝离体再生效率提供了基础。

丘陵山地不同种植模式下甘蔗主栽品种生产的潜力

【目的】以丘陵山地不同种植模式甘蔗主栽品种生产潜力为研究对象,探索品种和机械适应关系,筛选宜机化(适宜机械作业)种植的甘蔗品种并明确其主要特征,为推动丘陵山地蔗区全程机械化提供理论支撑。【方法】选择云南丘陵山地2种不同生态类型蔗区,对桂柳05-136、云蔗05-49、云蔗05-51和云蔗08-1609 4个主栽品种进行全程机械化和全程人工2种种植模式下生产潜力研究。【结果】甘蔗产量和蔗糖分受品种和种植模式影响,其中产量影响显著,机械化种植模式下,云蔗08-1609产量显著高于人工种植模式(P<0.01),云蔗05-51表现相反(P<0.01);机械化种植模式下,云蔗08-1609蔗糖分略高于人工种植(P>0.05),桂柳05-136和云蔗05-49略降低(P>0.05)。甘蔗下种量和出苗率同时受品种特性和种植模式影响,机械化种植模式下下种量普遍高于人工种植,而出苗率普遍低于人工种植模式;云蔗05-51机械化种植条件下出苗率显著降低(P<0.05),云蔗08-1609出苗率相对较稳定(P>0.05)。甘蔗主要农艺性状同时受品种和种植模式影响,机械化种植模式下,云蔗08-1609有效茎显著高于人工种植模式(P<0.05);工艺品质性状主要受品种影响。云蔗08-1609在甘蔗机械种植条件下生长潜力更高,表现为产量和有效茎显著高于人工种植,甘蔗蔗糖分略高;云蔗05-51在人工种植模式条件下生长潜力更高,表现为人工种植模式下的产量更高。【结论】不同甘蔗品种对机械种植的适应程度不同,存在宜机化种植和宜人工种植甘蔗品种,在推进机械化种植模式过程中应充分考虑品种的适应性;总之,宜机化种植甘蔗品种应具备在机械化种植模式下的甘蔗产量更高和有效茎更多,且蔗糖分受种植模式影响较小甚至略高于人工种植模式的特征。

2017—2023年我国糖料甘蔗登记品种的亲本和产量分析

以2017—2023年通过非主要农作物品种登记的132个糖料甘蔗品种为调查对象,研究分析不同甘蔗亲本的选育效果以及登记品种的产量、宿根性和成熟期情况。结果表明,在调查育成的132个甘蔗登记品种中,亲本使用频率最高的是ROC22,其次是粤糖85-177、ROC25、CP72-1210、粤糖91-976、CP84-1198、粤糖93-159、粤农73-204、桂糖92-66、ROC10和ROC1。亲本来源主要是引进系列和粤糖/崖城系列,分别占比28.30%和26.42%。在产量分布及变化方面,1新2宿平均产量为102865.7 kg/hm^(2),产量变幅以90000.00~104999.99 kg/hm^(2)与105000.00~119999.99 kg/hm^(2)之间的品种最多;与对照相比,1新2宿产量增产幅度在5.00%~9.99%与10%~19.99%之间,分别占比22.90%和29.01%。在育成品种的宿根性方面,宿根蔗产量为新植蔗产量110.00%~130.00%的有8个,为100.00%~110.00%的有28个,说明大多数品种的宿根性挺好。育成品种的成熟期以早熟品种为主,占比46.49%。

云南木薯藻斑病危害及发生规律调查研究

近年来,藻斑病已经成为云南地区木薯生产中的重要病害。为明确当地木薯藻斑病危害情况并初步阐明其流行规律,对云南省保山市木薯藻斑病田间危害进行了系统调查,并对病情指数和主要气候因子进行了相关性分析。结果表明,126份木薯种质均受藻斑病危害,‘华南124’‘南植188’‘南植199’等主栽品种均受害,病情指数均在30以上。病害流行规律研究结果得出藻斑病可于8月中下旬开始发生,流行高峰期在11月下旬或12月上旬,对藻斑病病情指数与病害流行月均温度、日均温差、湿度进行相关性分析,得到回归方程式Y=38.6096-2.1033 X_(1)-0.5175 X_(2)+0.325 X_(3),表明月均温度、日均温差和湿度是影响藻斑病病害流行的主要因素,且与月均温度和日均温差成负相关,与湿度成正相关。

冠菌素诱导橡胶树次生乳管分化的形成层细胞CUT&Tag文库构建和初步分析

CUT&Tag技术是一种研究蛋白质-DNA互作的新方法,使用超高活性的新型pG-Tn5转座酶,在抗体引导下精准靶向切割目的蛋白附近的DNA序列,从而进行cDNA建库和测序分析。此技术在人类和动物研究中应用广泛,由于植物细胞结构特殊,该技术在植物研究中应用较少。在前期研究中,我们发现组蛋白乙酰化修饰参与茉莉酸诱导橡胶树次生乳管分化的调控,但其分子机制尚未阐明。本研究利用冠菌素(COR)诱导橡胶树萌条维管形成层分化次生乳管的实验系统,通过酶解法获取高质量的形成层区细胞原生质体,使用组蛋白H3乙酰化修饰抗体对次生乳管分化过程中发生组蛋白乙酰化修饰的区域进行原位识别,采用CUT&Tag技术成功构建COR处理橡胶树树皮形成层细胞的cDNA文库。对构建cDNA文库进行质检和测序分析,发现文库质量较好,并通过差异基因的GO和KEGG富集分析,发现生长素、类黄酮代谢和蛋白质泛素化等相关基因得到富集。本研究结果为使用CUT&Tag技术构建植物组织的cDNA文库提供操作方法,为解析组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制提供理论基础。

特早熟荔枝“科技一号”在海南陵水的引种表现

为进一步优化海南荔枝品种结构,充分发挥海南荔枝产区早熟优势,选育和推广早熟荔枝品种,2018年通过高接换种方式在海南省陵水县引种“科技一号”荔枝,以特早熟荔枝“桂早荔”为对照,比较分析两个品种在海南省陵水县的植物学性状、物候期、经济性状以及抗逆性等。结果表明,“科技一号”荔枝果实椭圆形,果皮暗红色,平均单果质量19.4 g,果形指数1.05,平均可溶性固形物含量16.2%,平均可食率63%,部分种子焦核,成熟期2月下旬至3月中旬,比同区域“桂早荔”早15 d左右,是适宜在海南适度种植推广的特早熟荔枝。

橡胶树CRISPR/Cas9编辑植株出现预期表型的突变阈值

本课题组前期在橡胶树原生质体中分别实现了基于CRISPR/Cas9-RNP及质粒介导的瞬时转化基因编辑,并以HbPDS基因为靶标,在橡胶树愈伤组织中实现了农杆菌介导的稳定转化基因编辑,并获得了出现白化表型的愈伤组织,但由于橡胶树愈伤诱导体胚的技术还不稳定,导致未能获得基因编辑植株。为了获得橡胶树基因编辑幼苗,本研究继续以HbPDS基因为靶标,改用橡胶树体胚为侵染受体,开展农杆菌介导的遗传转化,经潮霉素抗性筛选获得增殖的T_0代抗性体胚,通过Cas9基因分子检测共挑选出116个阳性转化体胚,通过对靶点处的测序检测发现有5个胚块发生了基因编辑,编辑效率为4.3%。通过植株再生程序,获得了2株再生植株,表型观测均是嵌合体,表现为同一编辑植株上同时存在绿色及白化叶片。同时取白化叶片和绿色叶片进行高通量测序,发现二者均已发生了基因编辑,除了1个白化叶片发生了纯合双等位突变之外,其余叶片均为嵌合突变。其中,白化叶片编辑细胞的占比介于86%~100%之间,而绿色部位编辑细胞所占比例介于66%~69%之间,说明橡胶树CRISPR/Cas9编辑植株出现预期表型的突变阈值高于69%,介于70%~85%之间,为今后创制有表型的橡胶树基因编辑幼苗提供理论指导。同时,本研究证明了T_0代转化体胚及其获得的再生植株嵌合比例太高,不宜作为植株再生的材料,为今后通过对T_0代阳性体胚进行继代获得T_1代纯合体胚,并以T_1代体胚为转化受体获得纯合基因编辑植株提供思路。本研究首次公开报道获得了橡胶树基因编辑植株,尽管是嵌合植株,但也增进了对CRISPR/Cas9在橡胶树中作用的理解,为下一步在橡胶树中改进并应用基因编辑技术奠定基础。

不同土地利用方式下文昌滨海贝屑沙土磷素组成与淋溶特性

土壤磷素(P)是作物必需的营养元素之一,也是农业生产中重要的养分限制因子,还是水体富营养化的重要污染源。以文昌滨海贝屑沙土为研究对象,应用石灰性土壤无机磷分级方法研究其形态组成,采用淋洗法评价其磷淋溶特性。试验结果表明:文昌滨海贝屑沙土磷素形态组成以Ca10-P(45.78%)为主,O-P(26.67%)与Ca8-P(11.27%)次之,Ca_(2)-P(2.97%)、Al-P(4.70%)和Fe-P(8.60%)的含量较少;耕地土壤Ca_(2)-P(28.35 mg/kg)和Ca8-P(93.74 mg/kg)含量显著高于林地土壤的Ca_(2)-P(3.95 mg/kg)和Ca8-P(42.31 mg/kg)含量;瓜菜和叶菜地土壤Ca_(2)-P和Ca8-P含量显著高于其他植被类型土壤的含量;土壤平均磷淋失量为2.92 mg/kg,占土壤总磷量的0.32%,占土壤有效磷(Olsen-P)含量的10.26%,Olsen-P淋溶阈值为51.13 mg/kg。

文昌滨海贝屑沙土养分特征

为了解不同土地利用方式下文昌滨海贝屑沙土的基本养分特征,对文昌市主要滨海贝屑沙土区6类植被类型的90块样地表层土壤进行采样分析。结果表明:文昌滨海贝屑沙土呈弱碱性,pH为(7.85±0.47);有机质(11.75±4.86)g/kg和碱解氮(70.59±42.64)mg/kg,含量偏低;有效磷[Olsen-P,(44.59±55.46)mg/kg]含量较高,样品间差异较大;速效钾含量为(78.83±72.72)g/kg;林地土壤严重缺磷;耕地土壤,尤其是蔬菜地的磷含量极为丰富。研究结果反映了文昌滨海贝屑沙土的养分现状,可为科学制定区域农作物施肥方案提供参考,同时对土壤磷过量提出预警。

甘蔗宿根关键性状及其在宿根性快速评价中的应用

甘蔗重要性状宿根性因甘蔗生长周期长,其高效评价一直是研究的难点。本研究以国内外不同地区引进的212份甘蔗种质资源为研究材料,分别在广西隆安和云南开远开展基于2个重要宿根关键性状(宿根发株率和地上部蔗株生物量)两季宿根力的快速评价。结果表明甘蔗宿根力受环境影响较大,两个试验点所有宿根力指标均存在极显著差异,且指标之间均呈极显著正相关。主成分分析在两个试验点(云南开远和广西隆安)均仅提取到1个主成分,贡献率分别为80.25%和62.68%。聚类分析将212份种质分为5个类群,第Ⅰ类4个宿根力指标均处于高水平,有9份种质,可作为强宿根第一梯队资源;第Ⅱ类群、第Ⅲ类群共有38份种质,各宿根力指标均处于较高水平或个别宿根力指标非常突出,可作为强宿根第二梯队资源;第Ⅳ类群、第Ⅴ类共有165份种质资源,各宿根力指标均一般或较差。综合以上,利用筛选出来的强宿根资源改良甘蔗品种宿根性,降低甘蔗生产成本对于产业的可持续发展具有重要意义。

甘蔗脱毒原种苗田间繁育过程中氮、磷、钾营养元素的吸收及累积特征

探讨甘蔗脱毒原种苗不同生长时期氮、磷、钾营养元素的累积需求状况,为甘蔗脱毒原种苗田间繁育栽培过程中养分管理提供参考。试验分别在2020、2021年进行,调查中糖1号甘蔗脱毒原种苗全生育期生长情况,测定其生物量及其在各生育阶段根、茎、叶中氮、磷、钾各营养元素的含量,并分析氮、磷、钾的累积量、阶段吸收量、日吸收速率。结果表明:甘蔗脱毒原种苗从种苗假植到种茎最佳收获时需6~7个月可达15茎节,在7、8月至9月下旬(茎1期至茎2期)蔗茎生长速度最快,以茎4期(10月下旬至11月下旬)干物质量累积增加最快,此阶段为生物量累积的关键阶段。在甘蔗脱毒原种苗全生育期中各元素含量及累积量从高到低依次为钾>氮>磷,在根茎叶各器官中蔗叶、蔗茎始终为氮、磷、钾含量相对较高的器官,氮、磷、钾累积量在茎伸长生长1期前主要贮存于蔗叶中,而后以蔗茎为新的主要贮存器官。甘蔗对氮、磷、钾的吸收比例在苗期和分蘖期分别为24.84%、26.18%、27.74%,在茎1~3期(7月下旬至10月下旬)分别为55.54%、58.61%、52.30%,茎4、5期(10月下旬至12月下旬)分别为19.62%、15.20%、19.96%。因此,可根据各元素的阶段吸收量进行合理施肥,进而提高甘蔗脱毒健康种苗的品质和经济效益。试验明确了甘蔗脱毒原种苗生长过程中对氮、磷、钾的需求状况,可为今后甘蔗脱毒健康种苗田间规模化繁育生产的科学合理施肥提供依据,提高脱毒原种苗田间繁育效率和养分资源利用效率。

高糖新品种云蔗1640花叶病原的检测与脱毒种苗生产

【目的】甘蔗花叶病是导致甘蔗品种减产的重要病害,通过应用甘蔗健康种苗可以有效提高甘蔗种苗的抗病能力。‘云蔗1640’是由云南省农业科学院甘蔗所培育的高产高糖甘蔗新品种,适宜在我国热区推广种植。【方法】本研究通过田间采样调查结合RT-PCR检测的方法,完成了‘云蔗1640’甘蔗品种的花叶病毒带病情况调查,开展了‘云蔗1640’健康种苗的脱毒处理与品种的快繁。【结果】确认‘云蔗1640’携带有甘蔗花叶病毒,其主要的病原以甘蔗线条花叶病毒为主,甘蔗花叶病毒次之,不带有高粱花叶病毒。通过温水处理结合茎尖脱毒的方法培养获得了‘云蔗1640’健康种苗。研究表明经RT-PCR的方法检测线条花叶病毒和甘蔗花叶病毒的脱毒效率分别为10.12%和90.62%。经筛选出不带病原的脱毒种苗作为原种开展健康种苗的组培快繁。【结论】糖料蔗健康种苗的繁育是一种有效的良种繁育技术,可加快优异甘蔗新品种的推广与应用,为我国蔗糖产业的发展提供新的优异种质,是我国蔗区老品种提纯复壮的新来源。

橡胶树HbPIP2;3的亚细胞定位与多聚化分析

水通道蛋白是一类高效转运水分子的膜内在蛋白,其在生物膜上以四聚体的形式起作用。天然橡胶在橡胶树的乳管细胞中特异合成,并在割胶过程以胶乳的形式被排出。胶乳系乳管细胞的胞质成分,其含水量高达70%,水分通过调节胶乳的粘稠度和乳管膨压进而影响橡胶树的产排胶能力,是决定胶乳产量的关键因素。前期研究显示,橡胶树乳管的水分平衡主要由质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic protein,PIP)特别是HbPIP2;3介导。为揭示HbPIP2;3调控乳管水分平衡的分子机制,本研究采用RT-PCR技术对其861 bp的编码区进行分离。序列分析显示:HbPIP2;3预测编码286个氨基酸,理论分子量为30.58 kDa,等电点为8.50,不稳定系数为31.68,总平均疏水指数为0.449,为稳定的疏水型碱性蛋白;该蛋白含有保守的MIP结构域,其中包括6个典型的跨膜螺旋和2个半螺旋;基于同源建模的3D结构预测显示其可以形成同源四聚体。生物信息学预测和在烟草叶片中的亚细胞定位分析显示,HbPIP2;3定位在细胞膜,这同时也得到了双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)实验的证实。BiFC实验显示,HbPIP2;3可在细胞膜上形成同源四聚体,这进一步得到酵母双杂交结果的验证。本研究结果表明,HbPIP2;3可通过同源四聚体的方式调控乳管的水分平衡,但是否存在异源互作模式还有待进一步研究。

油莎豆块茎高水平表达CePIP1;1基因的克隆与分析

油莎豆隶属于禾本目莎草科,是一种在块茎中高水平积累油脂的新型草本油料作物。与其他块根块茎类作物类似,未成熟油莎豆块茎的含水量高达85%,因此,水分平衡对于块茎的发育至关重要。质膜内在蛋白(PIP)是一类定位在细胞膜上具有高效水分转运活性的水通道蛋白,包含PIP1和PIP2两个亚类。本研究基于块茎蛋白组中鉴定到的一个PIP蛋白,采用RT-PCR技术对其编码基因进行克隆,并在此基础上分析其基因结构、序列特征、进化关系、表达特性及蛋白亚细胞定位。结果表明:CePIP1;1含有3个内含子,编码区全长867 bp,编码288个氨基酸,理论分子量为30.76 kDa,等电点为8.82,不稳定系数为32.95,总平均疏水指数为0.384,脂肪族指数为95.28,属于稳定的碱性疏水型蛋白;该蛋白含有保守的MIP结构域,其中包括6个跨膜螺旋、2个半螺旋以及位于半螺旋顶端的NPA基序。序列比对和进化分析显示,CePIP1;1与水稻的PIP1亚类聚在一起,相比于菠菜PIP2;1拥有延伸的N端和较短的C端,符合PIP1亚类的基本特征。在烟草叶片中的亚细胞定位分析显示,CePIP1;1定位在细胞膜,这与生物信息学预测结果一致。表达分析显示,CePIP1;1在分析的所有组织中均高水平表达,属于组成型表达基因,其在块茎的发育过程中呈现先升后降的钟形趋势,与水分含量趋势基本一致。这些结果为下一步的功能分析及油莎豆遗传改良奠定坚实的基础。

油莎豆CePIP2;1的克隆、亚细胞定位与表达分析

油莎豆是一种在块茎中高水平积累油脂的草本油料作物,其未成熟块茎的含水量高达85%,水分平衡对于块茎的发育与代谢至关重要。质膜内在蛋白(PIP)是介导细胞间水分跨膜运输的主要通道。本研究报道1个块茎高水平表达的PIP基因CePIP2;1,该基因含有3个内含子,预测编码288个氨基酸(aa),其理论分子量(MW)为30.34 kDa,等电点(pI)为8.60,总平均疏水指数(GRAVY)为0.529,不稳定系数(Ⅱ)为29.60,属于典型的稳定、碱性、疏水型蛋白。CePIP2;1含有保守的MIP结构域,ar/R选择性滤器为F-H-T-R,Froger位点为Q-S-A-F-W,符合高水分转运活性PIP的特征。进化分析显示,CePIP2;1与OsPIP2;1、OsPIP2;2和OsPIP2;3聚在一起,序列相似性分别为91.72%、90.31%和84.98%,支持其归为PIP2亚类。亚细胞定位分析显示,CePIP2;1定位在烟草叶片的细胞膜。进一步的表达分析显示,虽然CePIP2;1为主要的块茎表达PIP基因,但其在叶片、叶鞘、匍匐茎和根等组织中的表达丰度更高,最高的为叶片,而在芽尖中的表达丰度与块茎相当;在块茎的4个典型发育时期(S_(1)~S_(4))中,CePIP2;1基因呈现先升后降的钟形趋势,表达丰度最高的是S_(2)。这些结果为解析油莎豆的水分平衡机制奠定基础。